薤白多糖的硫酸化修飾及體外抗氧化活性

夏新奎，豆成林

信陽農林學院食品科學系，信陽 464000

多糖作為構成生命活動的基本物質之一，在抗腫瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗衰老、抗凝血等方面均發揮著其特殊的生物活性作用。研究表明，多糖的活性直接或間接地受其分子結構的影響，采取一定的方法對多糖分子結構進行修飾，可以提高或賦予多糖更多活性、降低其毒副作用［1］。

薤白是一味傳統的中藥，為百合科植物小根蒜Allium macrostemon Bge.和薤Allium chinensis G.Don.的干燥鱗莖。性味辛、苦、溫，有溫中通陽，理氣寬胸，通陽散結之功效［2］。其原植物除入藥外還可食用，是衛生部2002 年公布的88 種藥食兩用中藥材之一。現代研究證明，薤白具有抗氧化、防治動脈粥樣硬化等作用。薤白中已分離得到揮發油、皂苷、含氮化合物、前列腺素等化學成分，但薤白多糖的研究報道較少。本文在前期對薤白粗多糖提取工藝、分離純化及組成分析研究的基礎上［3，4］，對所得的薤白多糖純品采用氯磺酸+吡啶法進行硫酸化修飾，用響應面設計法確定硫酸化的最佳條件，并對修飾前后的薤白多糖清除超氧陰離子自由基、羥自由基的能力進行研究，旨在選出硫酸化的最佳條件，為薤白多糖藥物及功能性食品開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

薤白粗多糖及分級純品:由本實驗室提供。利用水溶醇沉法得薤白粗多糖(PAM)，經DEAE-纖維素柱層析和SephadexG-150 柱層析得薤白多糖的三種級分(PAM-Ib、PAM-IIa、PAM-III’)［3，4］。

電熱恒溫水溶槽:北京市醫療設備廠;Z323K 高速冷凍離心機:德國HERML 公司;752 紫外可見分光光度計:上海精密科學儀器有限公司。

氯磺酸、吡啶、硫酸鉀、鄰二氮菲、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷(Tris)，以上試劑均為國產分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 硫酸化修飾條件設計

根據文獻報道，試劑比例、反應溫度和反應時間對修飾的影響較大［5］，因此，在單因素試驗的基礎上，根據Box-Benhnken Design 中心組合試驗設計原理，以試劑比例(A)、反應溫度(B)和反應時間(C)為自變量，產物的硫酸根取代度(DS)為響應值，設計三因素三水平的響應面分析試驗，以確定硫酸化修飾的最佳工藝條件。因素水平如表1。

表1 試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.2.2 硫酸化試劑的制備

在帶有攪拌裝置和冷凝裝置的250 mL 三頸燒瓶中加入預冷的無水吡啶，并將燒瓶置于冰鹽浴中，較為劇烈地不停攪拌，再將氯磺酸按照表1 的比例逐滴緩慢加入(40 min 內完成)。滴加完畢后撤去冰鹽浴，將酯化試劑于-20 ℃封存備用。

1.2.3 硫酸化操作

精確稱取500 mg 薤白多糖(PAM)，分散于30 mL 無水甲酰胺中制成薤白多糖懸液，室溫下加入酯化試劑，按表1 設定的反應溫度和反應時間在水浴中攪拌反應。反應結束后取出燒瓶冷卻至室溫，然后加入預冷的100 mL 冰水中，用1 mol/L 的NaOH 溶液中和至pH 7.5。加入四倍體積的無水乙醇，4 ℃靜置過夜、過濾，將沉淀對自來水透析3 d，蒸餾水透析1 d。透析液再用四倍體積的無水乙醇沉析，沉淀經低溫真空干燥得到硫酸酯化薤白多糖衍生物(sPAM)。

1.2.4 產物的硫酸根取代度測定

用硫酸鋇比濁法［6］測定各種修飾產物的硫酸根質量分數。

標準曲線的繪制:配制1.0 mol/L 硫酸鉀標準溶液，并吸取一系列不同體積的硫酸鉀標準溶液于試管中，補充蒸餾水使其體積為10 mL，然后加入10 mL 0.18 mol/L 鹽酸溶液、1 mL 0.5%明膠溶液，充分振蕩混勻，迅速加入2 mL 氯化鋇-明膠溶液(10 g氯化鋇溶于100 mL 0.5%明膠溶液中)，振蕩混勻，室溫放置20 min 后以蒸餾水為參比，于360 nm 處測定吸光值。以硫酸根量為橫坐標，吸收值為縱坐標，繪制標準曲線。

樣品取代度的測定:測定薤白多糖硫酸酯化衍生物中硫酸基含量時，取樣品10 mg 用蒸餾水溶解后加一定體積的濃鹽酸至HCl 濃度為3 mol/L，封口，100 ℃水解6 h，冷卻，減壓旋轉蒸干，再用少量水溶解后再次減壓旋轉蒸干，重復幾次后，用超純水將殘留物溶解并定容于10 mL 容量瓶中，取此樣液50 μL，按照標準曲線方法測定。根據標準曲線計算硫酸基含量并根據以下公式計算取代度:

式中S%為硫酸基百分含量。

1.2.5 薤白多糖硫酸化修飾前后體外抗氧化活性測定

1.2.5.1 對·OH 的清除率的測定(H2O2/Fe2+體系法［7］)

將各多糖樣品配成濃度為4 mg/mL 的溶液。取6 支試管，分別加入0.75 mmol/L 鄰二氮菲溶液1 mL，150 mmol/L pH 7.4 PBS 1.5 mL，充分混勻后。加入0.75 mmol/L FeSO4溶液1 mL，每加1 管立即混勻，然后向其中一管加入0.01% H2O21 mL(損傷)，另一管不加H2O2(未損傷)，以蒸餾水補充體積，37 ℃保溫60 min 后，以磷酸鹽緩沖液為參比，分別測536 nm 時吸收值，得A損傷與A未損傷。其余4 管分別加入一定的各多糖溶液(每次所加的體積不同)，混勻，再分別加入0.01% H2O21 mL，37 ℃保溫60 min 后以同濃度的多糖液作參比，測536 nm時的吸收值，即得A樣。重復5 次，以下式計算·OH清除率:

1.2.5.2 對O-·2的清除率的測定(鄰苯三酚自氧化法［8］)

取4.5 mL pH8.2 50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液，4.5 mL 蒸餾水，混勻后在25 ℃預熱過的鄰苯三酚0.3 mL(以10 mmol/L HCl 配制，空白管用10 mmol/L HCl 代替鄰苯三酚的HCl 溶液)，迅速搖勻后倒入比色杯，325 nm 下每隔30 s 測定吸光度，計算線性范圍內每分鐘吸光度的增加。在加入鄰苯三酚前，先加入一定體積的多糖溶液，蒸餾水減少，然后按下述方法計算清除率。

其中:△Ao 為鄰苯三酚自氧化速率，△A 為加入多糖溶液后鄰苯三酚的自氧化速率，單位均為吸光度每分鐘的增加值。

2 結果與分析

2.1 標準曲線方程的建立

根據1.2.4 節方法進行試驗，結果建立的S 含量(X)和吸光度(Y)標準曲線回歸方程為:Y=2.4852X+0.0013，R2=0.9986。

2.2 響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，根據Box-Benhnken Design 中心組合試驗設計原理，以試劑比例(A)、反應溫度(B)和反應時間(C)為自變量，產物的硫酸根取代度(DS)為響應值，設計三因素三水平的響應面分析試驗，試驗設計及結果如表2。

表2 響應面分析試驗設計及結果Table 2 The results of RSM

2.2.1 回歸方程的建立

利用Design Expert 8.0.5.0 軟件對表2 數據進行多元回歸擬合，得到硫酸化薤白多糖的硫酸根取代度(DS)對氯磺酸∶吡啶(v ∶v)(A)、反應溫度(B)、反應時間(C)的回歸方程為:

方差分析結果見表3。由表3 可知，模型P 值小于0.0001，表明該模型方程高度顯著;不同處理間的差異顯著，說明該方法是準確可靠的，使用該方程模擬真實的三因素三水平分析可行。失擬性檢驗結果表明，失擬不顯著(P=0.1782)，說明未知因素對試驗結果干擾很小，該回歸模型比較理想，可信度較高。R2Adj=0.9822，說明建立的模型能夠解釋98.22%響應值的變化，能很好的描述各因素對薤白多糖硫酸根取代度的變化規律。因此，該模型能準確地模擬各因素對硫酸根取代度的影響。

由表3 可以看出，各因素對試驗結果的影響排序為B ＞A ＞C，即反應溫度對薤白多糖硫酸根取代度的影響最大，其次為氯磺酸∶吡啶(v∶v)，反應時間影響最小。因素A、B 對薤白多糖多糖硫酸根取代度的影響極顯著(P＜0.01)，C 對薤白多糖硫酸根取代度的影響顯著(P＜0.05)，AB、A2、B2、C2對薤白多糖硫酸根取代度的影響顯著(P＜0.05)，AC、BC 對薤白多糖硫酸根取代度的影響不顯著(P＞0.05)。表明試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系，二次項對響應值也有很大的影響。

采用Design Expert 8.0.5.0 軟件作出3 個因素之間的響應曲面圖如圖1 所示。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

圖1 氯磺酸:吡啶與反應溫度(A)、氯磺酸:吡啶與反應時間(B)及反應溫度與反應時間(C)對取代度影響的響應曲面圖Fig.1 Response surface plots showing the effects of chlorosulfonic acid to pyridine ratio and reaction temperature (A)，chlorosulfonic acid to pyridine ratio and reaction time (B)and reaction temperature and reaction time (C)on the DS

2.2.2 模型的優化和驗證

利用Design Expert 8.0.5.0 軟件進行優化，薤白多糖硫酸化修飾的最佳條件為:氯磺酸∶吡啶=1∶3，反應溫度63.45 ℃，反應時間2.07 h，在此條件下硫酸根取代度為0.474。根據實際操作的方便情況，選擇氯磺酸∶吡啶=1∶3，反應溫度65 ℃，反應時間2 h，此條件下硫酸根取代度為0.470，與預測值接近，說明該模型可以很好地預測薤白多糖硫酸化條件與硫酸根取代度之間的關系。同時也證明了響應面優化法優化薤白多糖硫酸化修飾條件的可行性。

2.3 薤白多糖硫酸化修飾產物的體外抗氧化活性

2.3.1 薤白多糖硫酸化修飾前后對·OH 的清除作用

薤白多糖及各組分硫酸化修飾前后對·OH 的清除影響如表4。

表4 薤白多糖硫酸化修飾前后對·OH 的清除的影響Table 4 Scavenging effect of PAM and sPAM on ·OH

從表4 可以看出，薤白多糖硫酸化修飾后對H2O2/Fe2+體系通過Fenton 反應產生的·OH 清除率都有所提高，尤其是對PAM-IIa 影響最大。PAMIIa 修飾前幾乎沒有清除·OH 的作用(清除率0.08%)，但硫酸化修飾后清除率提高到11.26%，說明硫酸化修飾可改變或增加多糖的生物學活性。

表5 薤白多糖硫酸化修飾前后對 的清除的影響Table 5 Scavenging effect of PAM and sPAM on

表5 薤白多糖硫酸化修飾前后對 的清除的影響Table 5 Scavenging effect of PAM and sPAM on

由表5 可以看出，薤白多糖硫酸化修飾后對鄰苯三酚自氧化過程中產生的的抑制作用均有所提高，尤其對PAM-IIa、PAM-III’影響最大。PAMIIa、PAM-III’修飾前對幾乎沒有清除作用，但硫酸化修飾后清除效果明顯，說明薤白多糖硫酸化修飾可提高其體外抗氧化性。

3 結論

本試驗采用氯磺酸-吡啶法對薤白多糖進行硫酸化修飾，并通過響應面優化試驗研究了各因素對取代度的影響和最優工藝條件。各因素對試驗結果的影響排序為B ＞A ＞C，即反應溫度對薤白多糖硫酸根取代度的影響最大，其次為氯磺酸∶吡啶(v∶v)，反應時間影響最小，得到硫酸化修飾的最優工藝條件為:氯磺酸∶吡啶=1∶3，反應溫度65 ℃，反應時間2 h，此條件下硫酸根取代度為0.470，與預測值接近，說明該模型可以很好地預測薤白多糖硫酸化條件與硫酸根取代度之間的關系。同時也證明了響應面優化法優化薤白多糖硫酸化修飾條件的可行性。

體外抗氧化試驗表明，薤白多糖硫酸化修飾后清除·OH、O-·2 的能力明顯提高，說明薤白多糖硫酸化修飾可改變或增加其生物學活性，為薤白多糖硫酸化產物在保健因子、功能性食品或藥品領域的應用提供理論依據，在實踐中具有指導意義。

1 Li YH(李玉華)，Wang FS(王鳳山)，He YL(賀艷麗).Research status of the chemical modification methods of pol-ysaccharides.Chin J Biochem Pharm(中國生化藥物雜志)，2007，28:62-65.

2 Editorial Group of Chinese Medicine Citing(中藥辭海編審組).Chinese Medicine Citing(中藥辭海).Beijing:Chinese Medical Science and Technology Press，1997.

3 Xia XK(夏新奎)，Yang HX(楊海霞)，Li C(李純)，et al.Study on the extraction technology of polysaccharide from Allium macrosttemon Bge.J Anhui Agric Sci(安徽農業科學)，2006，34:4403-4405.

4 Xia XK(夏新奎)，Yang HX(楊海霞)，Li C(李純)，et al.Study on extraction，purification and component of polysaccharide from Allium macrosttemon Bge.Sci Technol Food Ind(食品工業科技)，2010，1:244-247.

5 Lu Y(盧宇)，Hu YL(胡元亮)，Sun JL(孫峻嶺)，et al.Optimization of sulfated modification conditions in epimedium polysaccharide.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2008，39:357-359.

6 Huang XY(黃小燕)，Kong XF(孔祥峰)，Wang DY(王德云)，et al.Research progress on sulfating modification of polysaccharides and sulfated polysaccharides.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2007，4:328-332.

7 Jia ZS(賈之慎)，Wu JM(鄔建敏)，Tang MC(唐孟成).Colorimetric determination of hydroxyl radical from Fenton reaction.Prog Biochem Biophys(生物化學與生物物理進)，1996，23:184-186.

8 Cui WX(崔文新)，Zhang JJ(張靜靜)，Geng Y(耿越).Free radical scavenging qualities of several natural edible pigments.J Shandong Normal Univ，Nat Sci(山東師范大學學報，自科版)，2006，21:105-107.