南蛇藤活性成分Nimbidiol 抑制血管新生作用研究

白殊同，鄧秋狄，謝 揚，唐雯慧，高皖皎，佟 麗*

1南方醫科大學中醫藥學院;2 南方醫科大學藥學院，廣州 510515

衛矛科南蛇藤屬植物具有多種生物學活性，其中南蛇藤抗類風濕關節炎、抗腫瘤等多種藥理學活性已被證明［1，2］。近期有研究表明，南蛇藤有抑制腫瘤細胞增殖及抑制腫瘤血管新生(Angiogenesis)作用［3］，但物質基礎尚未闡明。本課題組前期研究中，從南蛇藤總萜成分中分離出一個活性成分，通過1H NMR 和13C NMR 分析，鑒定該成分結構與Nimbidiol 相同(分子式:C17H22O3，分子量274.1524)。采用模式生物斑馬魚斑和大鼠動脈環實驗對其生物活性進行篩選，觀察了南蛇藤活性成分Nimbidiol 對斑馬魚節間血管發育及對大鼠動脈環生長情況的影響，為明確南蛇藤抑制血管新生作用確定了物質基礎。

1 材料與方法

1.1 藥品試劑與儀器

南蛇藤(Celastrus aculeatus Merr.)由華南植物園葉華古研究員采集并鑒定。Nimbidiol(由南方醫科大學藥學院謝揚教授，分離提取鑒定后提供);靛玉紅(中國藥品生物制品檢定所，批號:1107171-200204);血管內皮生長因子(VEGF，Vascular endothelial growth factor，PeproTech 公司);新生牛血清(GIBCO 公司);Matrigel 膠(BD 公司);DMEM 高糖培養基(GIBCO 公司);胚胎培養水(Egg water，南方醫科大學生物學教研室提供);二甲基亞砜(DMSO分析純，南方醫科大學試劑中心);苯硫脲(PTU，Sigma 公司);磷酸鹽緩沖液(PBS，武漢博士德生物工程有限公司);高效液相色譜儀(HPLC，Agilent 公司);高速逆流色譜儀(HSCCC，上海Tauto 生物科技公司);核磁共振波譜儀(NMR，600M，Bruker 公司);電子轟擊源-高分辨質譜儀(EI-HR-MS，Thermo Scientific 公司)。

1.2 實驗動物

SPF 級SD 大鼠，雄性，體質量160～180 g，購買于南方醫科大學實驗動物中心(合格證號:SCXK 粵2011-0015);Fli1-GFP(+/ +)雄性轉基因斑馬魚、AB 型雌性斑馬魚(南方醫科大學生物學教研室提供)。斑馬魚飼養于斑馬魚養殖系統(北京愛生公司)內，培養水pH 值7.4，水溫28.5 ℃。斑馬魚每天接受日光燈照射14 h，黑暗環境10 h，每天由實驗室飼養人員喂食三次。

1.3 Nimbidiol 的提取分離及鑒定

過山楓原藥材烘干粉碎，過60 目篩得粗粉。粗粉經95%乙醇浸泡、回流提取、濾液減壓濃縮得乙醇提取浸膏。將乙醇浸膏分散于水中，用超聲加熱并使其均勻分散，用石油醚、氯仿萃取后再用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯部位;乙酸乙酯部分用大孔樹脂層析柱(9 ×40 cm)，進行分離和篩選，先用蒸餾水進行沖洗，然后再用80%乙醇進行洗脫，將洗脫液進行減壓濃縮，得濃縮物1;濃縮物1 用硅膠柱(4.5×65 cm)層析進行分離，洗脫液比例為石油醚∶丙酮=50∶1～5∶1(洗脫液均為體積比)，對5∶1 部位收集液進行合并濃縮，得濃縮物2;濃縮物2 用硅膠柱(1.2 ×70 cm)層析進行分離，洗脫液:石油醚∶乙酸乙酯=8∶1～6∶1，其中對中間比例部位收集液進行合并濃縮，得濃縮物3;制備薄層色譜法得到濃縮物3，展開劑選擇為石油醚∶丙酮(3∶1)，得單體化合物1。化合物1 溶于甲醇，以高效液相色譜法(HPLC)檢測化合物1 含量，其純度為95%;以1H NMR 和13C NMR 對化合物1 進行結構鑒定。

化合物1(結構見圖1)，分子式(C17H22O3);mp.171～175 ℃;EI-HR-MS m/z:274.1524 m/z(rel.int.%):274 (M+，99)，259 (100)，217 (32)，203 (24)，191 (78)，189 (94)，177 (57)，163(23)，69 (51)，57 (30)，55 (24);1H NMR (CDCl3，600 MHz)δ:7.62 (1H，br，H-14)，6.83 (1H，br，H-11)，2.15 (1H，m，H-5)，2.54-2.66 (2H，dd，H-6)，1.71 (1H，overlapped，H-1a)，1.64 (1H，m，H-1b)，1.78 (1H，m，H-2a)，1.48 (1H，overlapped，H-2b)，1.22 (1H，m，H-3a)，1.43 (1H，m，H-3b)，1.14(3H，s，H-15)，0.94 (3H，s，H-16)，0.88 (3H，s，H-17);13C NMR (CDCl3，150 MHz)δ:37.9 (C-1)，32.5 (C-2)，41.3 (C-3)，33.2 (C-4)，49.8 (C-5)，35.9 (C-6)，200.6 (C-7)，123.7 (C-8)，142.2 (C-9)，37.8 (C-10)，110.1 (C-11)，151.4 (C-12)，152.4 (C-13)，113.6 (C-14)，18.9 (C-15)，21.3(C-16)，23.2 (C-17)。鑒定結果提示化合物1 與Nimbidiol 一致［4］。

圖1 Nimbidiol 的化學結構Fig.1 Chemical structure of nimbidiol

1.4 斑馬魚胚胎培養及藥物濃度配制

實驗前一天，挑選Fli1-GFP (+/ +)轉基因斑馬魚與AB 型斑馬魚，以1:2 的比例分別放入交配盒中，以擋板將雌雄斑馬魚分隔，放置過夜。第二天早晨，取出交配盒擋板，光照刺激促使斑馬魚交配產卵。斑馬魚產卵后，收集半小時內的胚胎，移入到潔凈培養皿中，并加入適量胚胎培養液，置于28.5 ℃孵化箱培養。胚胎發育11 h 后，篩選健康胚胎，用于試驗。

將胚胎移入28.5 ℃生化培養箱中孵化11 h 后用于實驗。將10 mg Nimbidiol 溶于100 μL 的DMSO 中，然后以胚胎培養水定容做為母液，實驗時配成不同濃度工作液(DMSO 含量低于0.1%)。根據預實驗結果確定Nimbidiol 藥效濃度范圍，正式實驗時，將Nimbidiol 終濃度每個培養孔分別為12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L(三組含藥培養水中，DMSO 含量均低于0.1%)。以100 μmol/L 終濃度靛玉紅為陽性對照組、含0.1% DMSO 培養水為陰性對照組［5］。

1.5 斑馬魚胚胎節間血管形成實驗

魚卵孵化11 h 后移入24 孔板，每孔10 枚，各組設2 復孔。棄孔內培養水，加入900 μL 含PTU培養水(培養水與PTU 體積比1∶1)。根據預實驗藥物濃度，加入不同濃度藥物100 μL，且DMSO 含量控制在體積分數0.1%以下。每孔加入藥液后置培養箱中，胚胎繼續孵化。待胚胎發育30 h 后，在熒光顯微鏡下觀察胚胎節間血管(Intersegmental Vessels，ISV)發育狀況。實驗重復三次。

熒光顯微鏡下觀察胚胎ISV 發育狀態并拍照記錄，對各組胚胎ISV 計數并統計分析;計算ISV 抑制率，抑制率(%)=(陰性對照組ISV 個數-給藥ISV個數)/陰性對照組ISV 個數［6］。

1.6 大鼠動脈環試驗

取6～8 周齡SPF 級SD 大鼠，頸椎脫臼處死，75%乙醇浸泡15 min，超凈工作臺內取胸主動脈，放入100 mm 培養皿中，PBS 緩沖溶液清洗2 次，去除動脈外周膜組織和纖維組織，將血管切成1.0～1.5 mm 長的主動脈環，PBS 清洗動脈環2 次，DMEM 高糖培養基漂洗2 次。將動脈環縱切面平行于培養孔底部，放進預先鋪有Matrigel 膠的96 孔(50 μL/well)，隨后每孔加入預先融化的Matrigel 膠70 μL，放入細胞培養箱中(37 ℃，5% CO2)孵育2 h，使膠凝固。待基質膠凝固后，加入含10%新生牛血清的DMEM 高糖培養基(完全培養基)100 μL，每2 d 換液一次，實驗第4 d 給藥。

設空白對照組、VEGF 對照組(刺激血管內皮細胞增殖，100 ng/mL)、Nimbidiol 高劑量組(50 μM/L)、中劑量組(25 μM/L)、低劑量組(12.5 μM/L);以完全培養基釋至VEGF 和藥物稀至相應濃度，空白對照組加完全培養基作為對照，其余各組加入100 ng/mL 的VEGF，Nimbidiol 組加入相應濃度的藥物，每孔培養基終體積100 μL。完成給藥，將96 孔板放回細胞培養箱中繼續培養，每2 d 換藥一次。給藥6 d 后，終止培養，顯微鏡下(40 ×)觀察微血管生長情況，并拍照記錄。每組設3 復孔，實驗重復3次。

1.7 統計學分析

使用SPSS 13.0 軟件，結果以X ±S 表示，采用ONE-WAY ANONA 方法對各組ISV 均數進行統計分析，統計結果以P＜0.05 為有統計學差異。

2 實驗結果

2.1 Nimbidiol 對斑馬魚胚胎血管發育形態影響

正常發育的斑馬魚胚胎背主動脈熒光清晰可見(圖2A)，ISV 熒光清晰、無畸形;陽性對照組斑馬魚背主動脈熒光消失，ISV 長度縮短且數量減少，血管生長受到抑制(圖2B);Nimbidiol 低劑量組斑馬魚背主動脈熒光可見，ISV 長度均一且數量無明顯變化(圖2C);Nimbidiol 中劑量組斑馬魚背主動脈熒光消失，ISV 熒光縮短且數量減少，血管生長受到抑制(圖2D);Nimbidiol 高劑量組斑馬魚背主動脈熒光消失，ISV 熒光減弱，且數量和長度均減少，提示血管生長受到顯著抑制(圖2E)。

圖2 胚胎發育30 h 后，各組斑馬魚胚胎發育節間血管發育狀態Fig.2 The development state of internode blood vessel in zebrafish embryo (30 h)

2.2 Nimbidiol 對斑馬魚胚胎節間血管數的影響

對各組ISV 均數比較可見，與陰性對照組比較，Nimbidiol 高、中、低劑量組斑馬魚胚胎，節間平均血管數量減少，血管生長呈抑制狀態，且具有統計學差異(F=24.773，均P＜0.05。結果見表1)

2.3 Nimbidiol 對大鼠動脈環血管生成的影響

動脈環經9 d 培養后，空白對照組動脈環周圍內皮細胞增殖，出現條索狀血管芽，最終形成新生微血管(圖3A);以VEGF 刺激血管內皮細胞增殖，實驗周期結束后，VEGF 組動脈環周圍出現大量新生微血管結構，排列緊密(圖3B);經Nimbidiol 低、中、高劑量處理后的動脈環，周圍內皮細胞增殖減少，毛細血管樣結構生成降低，微血管數量降低(圖3C、D、E)，且抑制效果與給藥劑量具有依賴關系。

表1 Nimbidiol 對斑馬魚節間血管數量的影響()Table 1 Effect of nimbidiol on internode vessels number of zebrafish ()

表1 Nimbidiol 對斑馬魚節間血管數量的影響()Table 1 Effect of nimbidiol on internode vessels number of zebrafish ()

注:與陰性對照組比較，* P＜0.05Note:compared with negative control group，* P＜0.05

圖3 Nimbidiol 對大鼠動脈環新生血管的影響Fig.3 Anti-angiogenesis effect of nimbidiol on new blood vessels formation around arty rings

3 討論

類風濕關節炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種發病機制尚未闡明的自身免疫系統疾病，臨床表現為對稱性的關節滑膜炎性增生，最終造成軟骨和骨組織侵蝕。RA 患者滑膜組織呈類腫瘤樣過度增殖，并伴有炎性細胞浸潤，同時導致滑膜組織內出現大量新生血管。大量新生血管的出現，對RA 的發展起促進作用，新形成的血管為滑膜組織提供氧氣、營養，同時血管內皮細胞分泌大量細胞因子、炎性因子，持續刺激滑膜組織，加重增生并形成血管翳，侵蝕關節面和關節軟骨，并最終破壞關節軟骨和軟骨下骨，使關節畸形并功能損傷［7］。因此抑制滑膜新生血管的形成，能夠延緩類風濕關節炎病情發展，減輕骨關節損傷。

南蛇藤抗類風濕關節炎實驗研究已有很多報道，其相關作用機制與抑制炎癥、調節機體免疫及細胞因子水平相關。但南蛇藤對類風濕關節炎滑膜血管新生作用尚未見報到。本研究通過模式生物斑馬魚實驗模型，觀察南蛇藤活性成分Nimbidiol，發現其在12.5 μmol/L 時，開始出現最低有效濃度的抑制斑馬魚血管形成活性，在一定的給藥劑量范圍內，隨著給藥濃度的增加，Nimbidiol 的抑制血管新生效果不斷增強并與劑量相關，當給藥濃度達到50 μmol/L 時，Nimbidiol 藥效最強，如繼續加大給藥劑量，藥物開始出現胚胎毒性，出現死胎現象。

在正常的生理條件下，血管內皮細胞處于一種相對靜止狀態;然而，當出現病理條件(如:RA)或者生長因子刺激的情況下，血管內皮細胞的活動增強。通過大鼠動脈環實驗，觀察Nimbidiol 對大鼠動脈環新生血管形成的影響;實驗結果表明，在體外條件下，12.5～50 μmol/L 濃度范圍內的Nimbidiol，能夠抑制VEGF 誘導的動脈環周圍內皮細胞的遷移和增殖，從而減少管腔狀微血管的形成和抑制血管新生過程。實驗結果提示，Nimbidiol 具有明顯的抑制血管新生作用。

綜上所述，Nimbidiol 在12.5～50 μmol/L 濃度范圍內，能夠有效抑制斑馬魚胚胎節間血管發育和大鼠動脈環周圍血管新生過程，具有明顯的抗血管新生作用。Nimbidiol 的抗血管新生活性，是南蛇藤抑制RA 重要活性成分之一，也表明了南蛇藤萜類成分是其抗RA 和抗腫瘤作用的物質基礎，但其作用機制尚未闡明，推測其作用與抑制VEGF 信號通路活化有關，有待進一步研究證實。

1 Yang MM(楊蒙蒙)，Tong L(佟麗)，Chen YY(陳育堯).The experimental study on the treatment on adjuvant -induced arthritis with NST ethanol extract rats.Lishizhen Med Mater Med Res(時珍國醫國藥)，2008，19:2917-2918.

2 Ji X(季雪)，Qian YY(錢亞云)，Zhang H(張華)et al.Effects of three TCM with sweet-flavor，cool-nature and meridian tropism in lung on the cAMP，cGMP of lung-yin deficiency rats.Pharmacol Clin Chin Mater Med (中藥藥理與臨床)，2012，28:90-97.

3 Hou Y(侯瑩)，Yuan L(員林)，Qian YY(錢亞云).Celastrus orbiculatus extract inhibits the xenograft tumor growth of HepA1-6 hepatoma in mice.Tumor(腫瘤)，2011，31:999-1003.

4 Xie Y，Ding ZB，Duan WJ，et al.Isolation and purification of terpenoids from Celastrus aculeatus Merr.by high-speed counter-current chromatography.J Med Plants Res，2012，6:2520-2525.

5 Sung JJ，Jeon J，Jin JS，et al.Zebrafish Jak2a plays a crucial role in definitive hematopoiesis and blood vessel formation.Biochem Biophys Res Commun，2009，378:629-633.

6 Han LW(韓利文)，Wang SF (王思鋒)，Wang JN(王加寧)，et al.Inhibitory effect of a novel tyrosine kinase inhibitor BSSD-1 on angiogenesis of zebrafish embryo and tumor growth of HT-29 colon cancer xenografts in nude mice.Chin Pharmacol Bull(中國藥理學通報)，2011，10:1434-1438.

7 Wang QT(汪慶童)，Ma YK(馬昱琨)，Huang P(黃蓓)，et al.Protective effect of AE3 on anoxia preconditioning Via NO pathway in rat cardiomyocytes.Chin Pharm Bull (中國藥理學通報)，2012，28:43-47.