HPLC-ELSD 法測(cè)定不同炮制方法雪蓮果中低聚果糖的含量

郝 婷，尹志峰，王小青，高 楊，王良友

河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北 承德 067000

雪蓮果(Smallanthus sonchifolius)為菊科多年生草本，原產(chǎn)于南美洲安第斯山，是印弟安人傳統(tǒng)的塊莖食品［1，2］。雪蓮果含有20 多種人體必需的氨基酸和豐富礦物質(zhì)。雪蓮果的主要成分為帶有甜味的低聚果糖，人體內(nèi)沒(méi)有酶可以水解這種碳水化合物，因此難以吸收，糖尿病患者亦可使用。低聚果糖(fructooligosaccharides，簡(jiǎn)稱FOS)又叫蔗果低聚糖或果聚糖，分子式為G-F-Fn(G 為葡萄糖基，F(xiàn) 為果糖基，n=1～3)，是果糖與葡萄糖構(gòu)成的直鏈低聚糖，是蔗糖的果糖基以β-1，2 糖苷鍵與1～3 個(gè)果糖基結(jié)合而成的蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(GF3)、蔗果五糖(GF4)的混合物。低聚果糖具有改善體內(nèi)菌群，排毒清腸、改善脂質(zhì)代謝，降低血脂、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)，提高免疫力、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收等生物活性［3-7］。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-ELSD［8，9］測(cè)定方法對(duì)雪蓮果中低聚果糖的含量進(jìn)行了測(cè)定，并比較不同炮制方法所得雪蓮果粉末中低聚果糖的含量，為雪蓮果的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1200 高效液相色譜儀(自動(dòng)進(jìn)樣器，四元泵，柱溫箱，ELSD 檢測(cè)器，Agilent 公司，美國(guó));電子分析天平(瑞士梅特勒AG-245 型);CHRIST 實(shí)驗(yàn)室型冷凍干燥機(jī)(德國(guó)MARTIN CHRIST);KQ-100E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

對(duì)照品:蔗果三糖，蔗果四糖，蔗果五糖(批號(hào):AWG0714，均購(gòu)自上海惠城生物科技有限公司);乙腈(色譜純，天津星馬克科技發(fā)展有限公司)，水(娃哈哈飲品有限公司)其余試劑為分析純。本實(shí)驗(yàn)所用雪蓮果經(jīng)河北省承德醫(yī)學(xué)院趙春穎副教授鑒定為菊科植物雪蓮果(Smallanthus sonchifolius［Poepp.＆Endl.］H.Robinson)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:華譜XAmide(4.6 ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈∶水=75∶25;流速:1 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:30 ℃。檢測(cè)器:ELSD，漂移管溫度70 ℃，氮?dú)怏w積流量3.5 L/min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液

精密稱定對(duì)照品蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖20.3、21.0 和22.8 mg，用流動(dòng)相溶解并定容至10 mL 容量瓶中，配制成含有蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖2.03、2.10 和2.28 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 不同炮制方法制備的供試品溶液

將雪蓮果洗凈，切片，按照表1 方法對(duì)其進(jìn)行處理。精密稱取粉碎后的粉末0.998 g，用0.3%檸檬酸溶液100 mL，超聲提取1 h，離心取上清液。

表1 不同雪蓮果炮制方法Table 1 Different processing methods of S.sonchifolius

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

取已配制的含有蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的混合對(duì)照品溶液，流動(dòng)相依次2 倍稀釋成一系列濃度。在上述色譜條件下，分別進(jìn)樣10 μL，每個(gè)濃度平行測(cè)定3 次，記錄峰面積，將濃度(Y)與峰面積(X)進(jìn)行線性回歸，混合對(duì)照品及樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

結(jié)果，蔗果三糖回歸方程Y=3630.7X-883.22，r=0.9991，線性范圍0.406～2.030 mg/mL;蔗果四糖回歸方程Y=3643.7X-774.31，r=0.9994，線性范圍0.420～2.100 mg/mL;蔗果五糖回歸方程Y=4700.7X-953.02，r=0.9978，線性范圍0.456～2.280 mg/mL。

圖1 混合對(duì)照品(A)及雪蓮果低聚果糖樣品(B)的HPLC-ELSD 色譜圖Fig.1 HPLC-ELSD chromatograms of mixed standards (A)and sample (B)

2.4 儀器精密度以及穩(wěn)定性

取2.2.1 項(xiàng)下的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖對(duì)照品溶液，各分別進(jìn)樣10 μL，連續(xù)5 次，按2.1項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄峰面積。取2.2.2 項(xiàng)下的樣品溶液，于制備后0、2、4、8、12 h 進(jìn)樣10 μL，進(jìn)行測(cè)定，按2.1 項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算出蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的RSD 分別為0.8%、1.1%、1.8%。結(jié)果RSD 均小于3%，表明此分析檢測(cè)系統(tǒng)精密度良好;樣品溶液在此條件下至少12 h穩(wěn)定。

2.5 樣品重現(xiàn)性以及回收率

稱取同一批雪蓮果粉末樣品，按照2.2.2 項(xiàng)下的方法制備樣品溶液5 份。進(jìn)樣10 μL，按2.1 項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算樣品中的準(zhǔn)確含量，結(jié)果蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為12.53%、20.14%、10.82%，其RSD 分別為1.2%、1.5%、2.6%，結(jié)果RSD 均小于3%，說(shuō)明該方法重現(xiàn)性良好。

稱取已知含量的雪蓮果粉末10 mg，共6 份，分別精密加入蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖對(duì)照品適量，按照2.2.2 項(xiàng)下的方法制備樣品溶液，按2.1 項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果平均回收率分別為101.4%、99.7%、98.6%，RSD 分別為1.53%、1.29%、2.81%。

2.6 樣品測(cè)定

取不同處理方法所得的雪蓮果，按照2.2.2 項(xiàng)下的方法制備樣品溶液，按2.1 項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算3 種低聚果糖的含量，見(jiàn)表2。

表2 不同處理方法雪蓮果低聚果糖的含量Table 2 Determination results of fructooligosaccharides prepared by different processing methods

由表2 可以看出不同處理方法的雪蓮果中都是蔗果四糖的含量最高，蔗果三糖次之，蔗果五糖最少。而且明顯第四種處理方法即清水漂洗0.5 h 后冷凍干燥的雪蓮果中蔗果四糖和蔗果五糖的含量明顯高于其他處理方法。

3 討論

用甲醇-水、乙腈-水進(jìn)行梯度及不同比例的等度洗脫比較，結(jié)果表明采用乙腈-水(75∶25)為流動(dòng)相不但基線穩(wěn)定，而且色譜峰在30 min 內(nèi)達(dá)到良好分離且峰形漂亮。漂移管溫度和氣體流速是ELSD檢測(cè)中至關(guān)重要的2 個(gè)參數(shù)，根據(jù)反復(fù)比較實(shí)驗(yàn)確定漂移管溫度為70 ℃，氮?dú)饬魉贋?.5 L/min。

通過(guò)對(duì)雪蓮果中低聚果糖含量測(cè)定，可以看出不同處理方法的雪蓮果中都是蔗果四糖的含量最高，蔗果三糖次之，蔗果五糖最少。而且明顯第四種處理方法即清水漂洗0.5 h 后冷凍干燥的雪蓮果粉末中蔗果四糖和蔗果五糖的含量明顯高于其他處理方法。由表2 可以明顯看出四種處理方法中清水漂洗0.5 h 后冷凍干燥這種處理方法最好。雪蓮果塊根中低聚果糖含量是所有植物中含量最高的，其干物質(zhì)中的45%～65%含量是低聚果糖，因此雪蓮果具有“低聚果糖之王”的美稱。低聚果糖作為人和動(dòng)物的生理活性物質(zhì)，廣泛應(yīng)用在疾病診斷與防治、營(yíng)養(yǎng)與保健、畜牧養(yǎng)殖、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)及抗病害等方面，它的開(kāi)發(fā)在國(guó)際上已經(jīng)發(fā)展成為一個(gè)應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飼料、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的重要產(chǎn)業(yè)。

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