亳芍總生物堿提取及抑菌活性的研究

陳乃東，朱旺生，楊小東

1皖西學院生物與制藥工程學院，六安 237012;2皖西中藥與天然藥物工程技術研究中心，六安 237012;3安徽醫科大學藥學院，合肥 230032

亳芍(Bozhou Peony Paeonia lactiflora)，即亳白芍，主產安徽省亳州地區，為安徽道地藥材之一，是芍藥科植物芍藥(Paeonia lactiflora)或其變種毛果芍藥(Paeonia trichocarpa)栽培品的根，夏秋季采挖其根部，去凈泥土和支根，沸水浸或略煮至受熱均勻，再經曬干等處理后即炮制成中藥亳芍，具有抗炎、免疫調節、抗病毒、抗氧化、抗驚厥、護肝等作用，對胃腸道疾病和心血管疾病也有一定的療效［1-3］。植物化學研究表明，白芍主要含有單萜［4］、倍半萜及三萜［5］、單寧［6］、揮發油［7］、黃酮［8］、多酚類［9］、多糖［10］等活性成分。

在我們的前期研究中發現，亳芍中含有微量生物堿［11］。本文在前期研究的基礎上，以烏頭堿為標準品，采用紫外分光光度法測定生物堿的含量，對亳芍總生物堿的最佳提取工藝條件及其抑菌活性進行研究，為后續的亳芍生物堿深度藥理學研究和開發利用奠定基礎。

1 材料、儀器和試劑

1.1 材料

實驗材料亳芍購于安徽省亳州市，品種經皖西學院陳乃東博士鑒定為亳芍(Radix Paeoniae Alba)。

1.2 儀器

GJ14-DGF3006 型電熱恒溫干燥箱(金壇市榮華儀器制造有限公司)，HH-4 型數顯恒溫水浴鍋(金壇市國華電器有限公司)，RE-52D 型旋轉蒸發器(上海浦滬儀器廠)，FA-1004 型電子天平(上海精科天平廠)，超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)，滅菌鍋(上海三申醫療器械有限公司)，TU-1901 雙光束紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)。

1.3 試劑

氨水、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、濃鹽酸、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、硫酸鎂、葡萄糖、硫酸二氫鉀、淀粉等均為國產分析純。

標準品烏頭堿購自城都吉歐特生物科技有限公司，純度≥98%(HPLC 檢測)。

1.4 供試菌種

金黃色葡萄球菌(Staphyloccus aureus)，大腸桿菌(Escherichia coli)，酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，黑曲霉菌(Aspergillu nigers)由植物細胞工程安徽省工程技術研究中心內生真菌研究室汪學軍副教授提供。

2 實驗方法

2.1 亳芍總生物堿的提取

2.1.1 總生物堿提取方法

稱取100g 干燥至恒重的亳芍粉末，分別在不同條件下(乙醇濃度、料液比、提取液鹽酸、提取溫度)進行回流提取，過濾，濾液減壓濃縮至干獲總生物堿粗提物。將亳芍生物堿粗提物以5%(V/V)鹽酸捏溶，等體積二氯甲烷萃取萃三次除雜，酸水相中緩慢滴加氨水至溶液pH=8.5～9.5(精密pH 試紙測定)，等體積氯仿萃取三次，減壓回收氯仿，得亳芍總生物堿。

2.1.2 總生物堿含量測定方法

亳芍總生物堿的含量測定參照陳美川等［12，13］方法改進而來，操作步驟如下:

2.1.2.1 標準對照品溶液的配制

精密稱取烏頭堿對照品5 mg 置50 mL 容量瓶中，加0.01 mol/L 鹽酸溶液使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為標準溶液，備用。

2.1.2.2 醋酸-醋酸鈉緩沖液及溴甲酚綠溶液的配制

取0.2 moI/L 醋酸溶液250 mL，用0.20 mol/L醋酸鈉溶液調節pH 至3.1 10 mL，備用。取溴甲酚綠50 mg，加0.50 mol/L 氫氧化鈉液1.6 mL 研磨使溶解，加水至100 mL，用三氯甲烷提取3 次，每次30 mL，棄去三氯甲烷液，備用。

2.1.2.3 標準曲線測定方法

精密量取烏頭堿標準溶液0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00 mL 分別置分液漏斗中，各依次加入0.01 mol/L 鹽酸溶液2.00、1.75、1.50、1.25、1.00、0.50、0.00 mL，各精密加醋酸-醋酸鈉緩沖液10 mL、漠甲酚綠液2 mL、三氯甲烷10 mL，振搖3 min，靜置，分取三氯甲烷液，于412 nm 處測定吸光度值(A)。然后以吸光度為縱坐標(y)，標準溶液濃度(x)為橫坐標繪制標準曲線，求得回歸方程為:y=0.410x-0.009(R2=0.9940)。

2.1.2.4 亳芍總生物堿的含量測定

0.01mol/L 鹽酸溶液配制0.1 mg/mL 總生物堿提取物溶液，按測定標準曲線相同方法測定亳芍生物堿的含量。

2.1.3 亳芍生物堿提取條件的優化

2.1.3.1 單因素實驗

從溫度、乙醇濃度、料液比、提取時間四個方面探討影響亳芍總生物堿提取率的因素。其中，溫度考察范圍為:40、50、60、70、80 ℃;乙醇濃度考察范圍:30%、50%、70%、90%、100%;料液比考察范圍:1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40;提取時間考察范圍:1、2、3、4、5 h。提取次數均為一次。當考察其中一個因素時，其它因素選擇五個水平中的中位數，例如，考察溫度影響時，另三個條件分別選擇:70%乙醇濃度、料液比1∶20、提取時間3 h。

2.1.3.2 正交實驗

根據單因素實驗結果，選擇合適的因素水平，進行4 因素3 水平正交實驗。

2.2 抑菌活性的測定

培養大腸桿菌與金黃色葡萄球菌采用牛肉膏蛋白胨培養基，培養酵母菌、黑曲霉菌采用PDA 培養基。

2.2.1 樣品配制

精密配制2.5、5.0、10.0、15.0 mg/mL 亳芍總生物堿乙酸乙酯溶液各5 mL，密封，備用。以2.5 μg/mL 青霉素和克霉唑乙酸乙酯溶液為陽性對照、乙酸乙酯為陰性對照。

2.2.2 菌懸液的制備

供試菌種斜面培養基活化后，取適量用生理鹽水稀釋，制成菌懸液備用。

2.2.3 抑菌活性測定——濾紙片法

在無菌操作臺上將滅菌后的固體培養基，每皿精確加入0.5 mL 菌液，涂布棒涂布均勻。將直徑8 mm 的濾紙圓片滅菌后在不同濃度生物堿提取液中浸泡2 h 后取出，貼于平板上，以無菌水作為對照。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌于37 ℃恒溫培養24 h，黑曲霉菌和酵母于28 ℃恒溫培養24 h。上述實驗每組設3 個重復，測定濾紙片的抑菌圈直徑大小，記錄實驗結果。

3 實驗結果

3.1 亳芍總生物堿提取工藝單因素試驗結果

單因素實驗結果如圖1 所示。液料比1∶20，提取時間為3 h，提取溫度為60 ℃條件時，分別以30%、50%、70%、90%、100%濃度的乙醇進行回流提取，隨乙醇濃度的增加測得的生物堿含量也升高(圖1A)，表明總生物堿的提取率隨乙醇濃度的增高而增加，當濃度超過70%時，提取率下降，可能是亳芍中水溶性總生物堿在高濃度醇中溶解度下降所致，故選擇50%、70%、90%為繼續優化提取條件的乙醇濃度。

當提取時間為3 h、提取溫度為60 ℃、乙醇濃度為70%，考察料液比對總生物堿提取的影響，實驗結果見圖1B。實驗測定的生物堿含量(提取率)隨料液比的增加而增加，當料液比超過1∶20 時，生物堿得率增加緩慢。但料液比越小，耗費的試劑越多，后處理工作量增大，綜合考慮，選擇料液比1∶10～1∶30，作為進一步優化提取條件的料液比考察范圍。

溫度對總生物堿提取的影響如圖1C 所示，采用70%乙醇、料液比1∶20 提取3 h 時，隨著溫度的升高，總生物堿提取率增加，當溫度達60 ℃時，提取率最高，然后隨著溫度的升高生物堿的提取率下降。故實驗選擇50、60、70 ℃作為進一步優化提取條件的溫度范圍。

提取時間對總生物堿提取的影響見圖4，隨提取時間的升高，總生物堿提取率增加，而時間為3 h時，隨著時間推移，提取率增加緩慢，故選2、3、4 h為作為進一步優化提取條件的時間范圍。

圖1 乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取溫度(C)及提取時間(D)對亳芍總生物堿提取率的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration (A)，solid-liquid ratio (B)，extraction temperature (C)and extraction time (D)on the extraction yield of total alkaloids from Bozhou Peony P.lactiflora

3.2 提取工藝優化

通過單因素實驗，確定了每個因素的三個水平(表1)，以L9(43)正交實驗設計對亳芍總生物堿提取工藝進行優化(表2)。

由表2 可知影響亳芍生物堿提取因素中，對生物堿提取率影響由大到小依次為:提取溫度(D)＞提取時間(C)＞乙醇濃度(A)＞料液比(B)，提取亳芍總生物堿的最佳提取工藝條件為A1B2C2D2，即乙醇濃度為60%，料液比為1∶20，提取時間為3 h，提取溫度為60 ℃，在此條件下，測得亳芍總生物堿含量為0.58‰。

表1 正交因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiments

表2 正交實驗與結果Table 2 Results of orthogonal experiments

3.3 不同濃度的亳芍總生物堿抑菌效果

不同濃度的亳芍總生物堿抑菌活性如表3 所示，亳芍總生物堿對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金色葡萄球菌和酵母菌均表現出抑菌活性(圖2)，且生物堿提取液濃度與抑菌圈大小具有量效關系，抑菌圈隨生物堿提取液濃度增大而擴大，對金黃色葡萄球菌、黑曲霉抑菌效果尤為顯著。

4 結論

亳芍生物堿的最佳提取工藝為:60%乙醇，提取溫度為60 ℃，提取時間為3 h，料液比為1∶20。亳芍總生物堿提取物對大腸桿菌、酵母菌、黑曲霉菌及金色葡萄球菌均表現出一定的體外抑菌活性，抑菌作用由大到小依次為:金色葡萄球菌＞黑曲霉菌＞酵母菌＞大腸桿菌本研究結果可為中藥亳芍質量控制、藥理學研究及資源開發提供參考依據。

表3 亳芍生物堿的體外抑菌活性Table 3 Antibacterial activity of different concentrations of total alkaloids from Bozhou Peony P.lactiflora

圖2 亳芍總生物堿提取物的抑菌效果Fig.2 Antibacterial effects of total alkaloids from Bozhou Poeny P.lactiflora

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