五倍子有效組分的分離純化及抗弧菌活性分析

李忠琴，靳 恒，林 茂，黃文樹，江興龍

集美大學水產學院 鰻鱺現代產業技術教育部工程研究中心，廈門 361021

水產養殖規模的不斷擴大和集約化養殖的發展，造成養殖環境的日益惡化，因此近年來水產養殖病害發病率越來越高。魚類細菌性疾病具有發病快，感染率高等特點，是養殖魚類中最為常見的一類疾病。其中，弧菌是近年來危害我國養殖業比較嚴重的魚類病原菌。弧菌生長的適宜溫度為17～35℃［1］，廣泛分布于世界各地海水及河口處［2］。其對養殖動物的致病性多發生在夏季［3］，在水溫25～32℃下容易流行［4］。此外，也有大量報道弧菌對人具有致病性，可引起人食物中毒［5］。

傳統防治魚類細菌性疾病的手段主要是使用抗菌化學類藥物進行治療，但抗生素的長期使用導致病菌的耐藥株大量增加;其次，大量使用抗菌化學類藥物，是造成水產品體內藥物殘留過量的一個重要原因［6］。我國中藥資源相當豐富，具有純天然、高效、毒副作用小、抗藥性不顯著等優點。近年來有不少學者對中藥抑制魚類致病菌進行了詳細的研究，王玉娥［7］等采用紙片擴散法(K-B 法)測定了34 種中藥對5 種海洋致病菌的體外抑制作用，研究結果顯示五倍子的體外抑菌效果最好，對溶藻弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌、麥式弧菌的最低抑菌和殺菌濃度均為1.56 mg/mL，對哈維氏弧菌的最低抑菌和殺菌濃度為3.125 mg/mL。在進行中藥防治魚類細菌性疾病的研究方面，大多是體外抑菌試驗和藥餌防治試驗，對中藥防治魚病的機理和發揮療效的物質基礎方面研究還很薄弱。由于中藥中有效物質基礎尚不清楚，限制了中藥的有效開發和綜合利用。

五倍子為漆樹科漆樹屬鹽膚木(Rhus chinensis Mill)的葉或葉柄因受五倍子蚜蟲的刺傷而形成的囊狀蟲癭，是一種可治療多種疾病的中藥材，在水產養殖中常用于防治細菌性疾病。本研究采用高速逆流色譜法對五倍子主要組分進行分離提取，并利用微量熱法分析各分離組分對弧菌的抑制活性，篩選出五倍子中具有抑菌活性的有效組分。該研究旨在建立一種分離制備中藥材有效組分和篩選評價其生物活性的方法，研究成果將為中藥有效組分應用于防控水產動物細菌性疾病提供理論依據及參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

弧菌致病株G1-1 由鰻鱺教育部工程中心的病原菌庫提供，經Biolog 系統鑒定，并進行攻毒實驗確定為強毒株;五倍子購于福建銘遠制藥有限公司;MH 肉湯培養基(青島高科園海博生物技術有限公司);無水乙醇、氯仿、正己烷、乙酸乙酯、甲醇、正丁醇、醋酸、磷酸、二甲基亞砜(DMSO)等試劑均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司);HPLC 所用甲醇為色譜純(TEDIA，美國)，水為超純水。

X0DL-1000N 超聲破碎儀(南京先歐儀器制造有限公司);TBE-20A 分析型高速逆流色譜、TBE-300B 制備型高速逆流色譜儀(上海同田生化技術有限公司);TAM Ⅲ微量熱儀(美國Waters LC);Agilent 1100 高效液相色譜儀(美國安捷倫);酶標儀(美國Thermo Scientific);SQW-601 冷凍超微粉碎機(山東三清不銹鋼設備有限公司);多樣品平行蒸發儀(瑞士BüCHI);超純水機(MILLIPORE 公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 五倍子醇提物的制備

準確稱取五倍子超微粉15 g 與70%乙醇料液比1∶10(v/v)混合，溶液浸泡30 min。然后在超聲破碎儀輔助萃取30 min，條件為變幅桿6 mm，超聲功率400 W，溫度50 ℃，超聲3 s，間歇5 s。離心過濾藥渣，將藥液置于多樣品平行蒸發儀中減壓濃縮得到浸膏，4 ℃保存備用。

1.2.2 高速逆流色譜分析條件

采用分析型高速逆流色譜(High-speed countercurrent chromatography，HSCCC)，選擇不同分離體系，以上相為固定相，下相為流動相，分別超聲脫氣20 min，注入不同量的五倍子醇提物藥液進行分離溶劑體系的篩選實驗。再根據所優化的溶劑系統(乙酸乙酯-乙醇-水，5 ∶1 ∶5，v/v/v)，采用制備型HSCCC(TBE-300B)進行分離制備。固定相以30 mL/min 的流速迅速泵入螺旋管柱中，主機轉速900 r/min，流動相流速為2.0 mL/min，待流動相流出且兩相溶劑達到動態平衡時，將制備好的五倍子醇提物20 mL(100 mg)注入HSCCC 儀中，開啟色譜工作站開始采集數據，紫外檢測波長254 nm，柱溫25℃，根據色譜圖收集各組分，濃縮干燥獲得干粉備用。

1.2.3 微量熱法測定分離組分的抑菌作用［8］

采用微量熱安瓿法測定各分離組分對弧菌的抑制效果。用無水乙醇溶解五倍子各分離組分，配制成不同濃度的藥液。在無菌條件下，向各安瓿瓶中加入MH 肉湯培養基1 mL，接種107CFU/mL 的弧菌菌液50 μL，再加入不同濃度藥液，密封后將安瓿瓶放入微量熱儀中。28 ℃下培養，實時動態記錄細菌生長代謝曲線即P-t 曲線。

1.2.4 熱譜曲線計算方法［9］

設每個細菌的輸出熱功率為W，細菌的發熱功率與細菌群體的數目成正比，則Pt=NtW，P0=N0W，其中P0、Pt分別為t0、t 時刻的細菌熱功率，N0、Nt分別為t0、t 時刻的細菌數目，對于細菌指數生長方程Nt=N0ekt，則有:

即lnPt-t 呈線性關系，把熱譜圖上的指數生長期的Pt、t 值代入式(2)中，用計算機進行線性擬合得到細菌生長速率常數k。

1.2.5 純度分析

采用HPLC 對HSCCC 分離的各組分進行檢測，根據面積歸一法，計算其純度。色譜條件為:甲醇(A)∶0.1%磷酸水(B)=5∶95，流速1 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長270 nm。

2 實驗結果

2.1 五倍子醇提液分離體系的優化

本試驗采用分析型HSCCC 分別考察了乙酸乙酯-乙醇-水(5∶1∶5，v/v/v);乙酸乙酯-甲醇-水(5∶1∶5，v/v/v);乙酸乙酯-正丁醇-甲醇-水(4∶2∶0.5∶6，v/v/v/v);乙酸乙酯-正丁醇-水(4∶1∶5，v/v/v)四個溶劑體系分離五倍子醇提物的效果。圖1 顯示不同溶劑體系的HSCCC 分離五倍子的譜圖，結果證明乙酸乙酯-乙醇-水(5∶1∶5，v/v/v)系統的分離效果最為理想。

圖1 高速逆流色譜分離五倍子醇提物各組分的溶劑體系優化圖Fig.1 HSCCC chromatograms of crude extract of R.chinensis with different solvent systems

2.2 五倍子各色譜組分的分離制備

根據分析型HSCCC 分離五倍子醇提物的溶劑體系，采用半制備型高速逆流色譜儀分離制備五倍子的主要組分(圖2)，分離獲得7 個單峰組分。

圖2 HSCCC 分離制備五倍子主要組分譜圖Fig.2 HSCCC chromatogram for the separation of R.chinensis

2.3 各色譜分離組分的HPLC 純度測定

將制備型HSCCC 分離得到的五倍子各個單峰組分進行濃縮，再利用HPLC 進行純度分析，采用面積歸一法計算各組分純度，結果見表1。五倍子分離得到的7 個峰中，P3、P4、P5 純度較低，尤其P5 組分的雜質較多，需進一步進行分離純化，有待進一步研究。

2.4 各分離組分對菌株G1-1 的生物活性分析

根據弧菌G1-1 在微量量熱儀上測得的熱功率-時間曲線上指數生長期的數據，如圖3，利用方法1.2.4 可計算出致病菌在五倍子各色譜組分不同濃度的藥液中的生長速率常數k，然后通過EXCEL 擬合得出k 與藥液濃度c 的線性函數關系，進而得到各組分分別對弧菌G1-1 的最低抑制濃度，結果見表2。其中組分P5 的抗菌效果最佳，最低抑菌濃度達到0.1 mg/mL。

表1 HPLC 測定五倍子各分離組分的純度(n=3，)Table 1 Purity of fractions isolated from R.chinensis determined by HPLC (n=3，)

表1 HPLC 測定五倍子各分離組分的純度(n=3，)Table 1 Purity of fractions isolated from R.chinensis determined by HPLC (n=3，)

表2 五倍子各色譜組分抑制致病弧菌菌株G1-1 的擬合方程及最佳抑菌濃度Table 2 The relationship between the concentrations of fractions separated from R.chinensis and growth rate constant of Vibrio G1-1，and the optimum inhibitory concentrations

圖3 菌株G1-1 在含不同濃度P5 的培養基中的熱功率-時間曲線Fig.3 Power-time curves of Vibrio G1-1 in different concentrations of fraction P5

3 討論與結論

在應用高速逆流色譜的分離過程中，溶劑體系的選擇是決定分離純化效果的關鍵。結合本實驗室已有儀器條件，選用體積小、速度快、溶劑消耗量小的分析型HSCCC 作為摸索溶劑體系的方法。HSCCC 在天然藥物活性組分研究中雖得到了廣泛應用，并取得了較好的效果，但經常遇到在一次分離中會有幾個峰不能有效分開的現象，尤其是在分離未經處理的粗提樣品或組分構成較復雜的樣品時，極性相近的目標物間無法分開，為了達到較好的分離效果往往需要采取一定的輔助措施。如，石聞華［10］和宋學英［11］均在利用HSCCC 分離純化藥用植物有效成分時，采用了二次分離，大大提高獲得化合物的純度。

五倍子主要有效組分為鞣質、沒食子酸等，均具有較多鄰位酚羥基的結構。其中鞣質是五倍子的主要組分，含量可達60%～70%［12］，是一類結構比較復雜的多酚類化合物，在酸性條件下鞣質水解可得到沒食子酸。鄭曙明等［13］在研究漁用抗菌劑復方五倍子有效組分及體外抑菌試驗時，通過薄層分析法發現并得出五倍子中所含的沒食子酸具有較好的抑菌活性。沒食子酸可溶解于水、乙醇等溶劑，黃建軍［14］報道乙醇提取沒食子酸的含量明顯高于水提取，因此本試驗選用70%乙醇作為提取溶劑。目前植物多酚類物質的提取正由傳統的提取方法向更高效的方法轉變(如色譜法和超臨界萃取等)，其中高速逆流色譜在多酚粗品分離純化領域取得了較好的效果。Han 等［15］采用溶劑系統正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶20∶1∶20，v/v/v/v)分離純化300 mg 訶子的浸提物(60%甲醇水溶液浸提)，分離得到33.2 mg 訶黎勒酸和15.5 mg 訶子酸，純度分別是95.3%和96.1%。Li 等［16］用正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(3∶7∶1∶9，v/v/v/v)為溶劑系統，HSCCC 法從500 mg丹參粗提物中得到純度大于98%的丹參酚酸B 342 mg。本研究參考HSCCC 分離多酚類物質的相關文獻，采用分析型HSCCC 篩選五倍子醇提物中的抗菌組分。結果發現，采用體系乙酸乙酯-乙醇-水(5∶1∶5，v/v/v)可以達到較好的分離效果，且各組分分離度較高。其他體系如乙酸乙酯-甲醇-水(5∶1∶5，v/v/v)、乙酸乙酯-正丁醇-甲醇-水(4∶2∶0.5∶6，v/v/v)和乙酸乙酯-正丁醇-水(4∶1∶5，v/v/v)等均不能達到有效分離，且體系不穩定，重復性差。

微量熱法測得五倍子各色譜分離組分對菌株G1-1 均有一定程度的抑菌效果，與五倍子醇提物的最低抑菌濃度0.5 mg/mL 相比，發現組分P4、P5、P6、P7 的對弧菌G1-1 的抑制作用增強，其最低抑菌濃度均有不同程度降低，而且它們含量總和占62.5%(表1)，因此可推測它們為五倍子發揮抑菌效果的主要組分。結合HPLC 測得的各組分峰的純度分析(表1)，P4、P6、P7 的純度分別為83.1%、98.5%和94.2%，抑制弧菌G1-1 的最低抑菌濃度分別為0.27、0.24 mg/mL 和0.41 mg/mL。在HSCCC 分離制備得到7 種組分中，P5 對弧菌G1-1 的抑制作用最強，其最低抑菌濃度為0.10 mg/mL，但是HPLC 測得的純度僅為48.7%，推測其中含有特強的抑菌組分，還需進一步純化，并鑒定其化學結構。

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