白木香內生真菌Botryosphaeria rhodina A13 固體發酵產物的分離鑒定

張 瑤，陶美華，陳玉嬋，郁建平，章衛民*

1貴州大學，貴陽 550025;2 廣東省微生物研究所 省部共建華南應用微生物國家重點實驗室廣東省菌種保藏與應用重點實驗室 廣東省微生物應用新技術公共實驗室，廣州 510070

內生真菌(endophytic fungi)通常是指生長在健康植物體根、莖、葉等組織細胞間隙或者細胞內對植物體沒有明顯病害的真菌，是植物微生態系統的重要組成部分［1］。近年來研究表明，植物內生真菌能夠產生多種結構類型的活性代謝產物［2］。來源于藥用植物的內生真菌能夠產生和宿主植株相同或者相似的生物活性物質，因此藥用植物內生真菌是發現天然活性物質的重要資源。

據報道，葡萄座腔菌屬真菌Botryosphaeria rhodina 能產生結構新穎的抗菌和抗腫瘤活性代謝產物［3，4］。本研究前期從藥用植物白木香［Aquilaria sinensis (Lour.)Gilg.］中分離獲得一株內生真菌Botryosphaeria rhodina A13［5］，經離體實驗表明，該菌株能誘導離體白木香樹枝產生沉香倍半萜組分5，9-二甲基-2-(1-甲基亞乙基)-環癸醇［6］。為了研究該株內生真菌的活性代謝產物，本研究以白木香木屑為培養基質對菌株A13 進行固體發酵培養，并對其發酵產物進行分離純化和結構鑒定，從中分離得到10 個化合物，分別鑒定為:豆甾-4-烯-3-酮(1)、豆甾-5-烯-3β-醇-7-酮(2)、豆甾-4-烯-3，6-二酮(3)、(22E，24S)-5α，6α-環氧基-24-甲基膽甾-8(14)，22-二烯-3β，7α-二醇(4)、5，4＇-二羥-7-甲氧基黃酮(5)、香草酸(6)、對甲氧基苯甲酸(7)、尿嘧啶(8)、2-甲氧基對苯二酚(9)、2-甲基-3，5-羥基色酮(10)。所有化合物均為首次從該屬真菌中分離得到。

1 材料與儀器

1.1 菌株和細胞株

內生真菌B.rhodina A13 分離自30 年生的白木香［5］，供試腫瘤細胞株為乳腺癌細胞MCF-7 和大細胞肺癌細胞NCI-H460，均保藏于廣東省微生物菌種保藏中心。

1.2 試劑

柱色譜硅膠(100～200 目、200～300 目，青島海洋化工廠)、GF254高效薄層硅膠板(Merck 公司)，C18反相硅膠(40～75 μm，Fuji Silysia Chemical Ltd.)，凝膠Sephadex LH-20(18～110 μm，Amersham Biosciences Ltd.)，其余試劑均為分析純，購自廣州化學試劑廠。

1.3 儀器

LRH-100 生化培養箱(韶關市泰宏醫療器械有限公司)，AVANCE III 型500 MHz 核磁共振波譜儀(Bruker 公司)，API 2000 LC/MS/MS 質譜儀(MDS SCIEX 公司)，DSQII 型電子轟擊電離質譜儀(美國Thermo 公司)，LC-20AT 型高效液相色譜儀(日本島津公司)，ZF-6 型三用紫外線分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)，Hangping FA2004N 電子天平(上海精密科學儀器有限公司)，RE-2000 型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)，超凈工作臺(上海恒益科技有限公司)。

2 實驗方法

2.1 發酵培養

在白木香木屑中加入適量水拌勻，使含水量達60%左右，分裝至聚丙烯食用菌袋，每袋約裝100 g木屑，共100 袋，121 ℃滅菌30 min，冷卻后挑取適量B.rhodina A13 菌絲體接種于菌袋中，在黑暗條件下27 ℃培養38 d。

2.2 發酵產物的提取與分離

將固體發酵產物用95%乙醇浸提3 次，濃縮得發酵物提取物，加入適量水懸浮，先用石油醚萃取5次，至上層液澄清，40 ℃下減壓濃縮，得浸膏26.7 g，再用乙酸乙酯萃取5 次，至上層液澄清，40 ℃下減壓濃縮，得浸膏71.1 g。兩種浸膏分別過硅膠柱，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫，用薄層色譜(TLC)檢測(顯色劑為茴香醛-濃硫酸試劑)，合并相似組分，石油醚萃取部分得到39 個組分(P1～P39)，乙酸乙酯部分得到39 個組分(E1～E39)。P11 組分用甲醇反復重結晶得到化合物1(18.0 mg)。重結晶后P11 剩余組分經Sephadex LH-20 以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫，正相硅膠柱(石油醚-乙酸乙酯4∶1)，制備薄層色譜得化合物2(1.6 mg)。P14 組分經Sephadex LH-20 以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫，用甲醇反復重結晶得到化合物3(2.0 mg)。P30 組分經Sephadex LH-20 以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫，反相硅膠柱層析(甲醇-水70∶30)，正相硅膠柱(石油醚-乙酸乙酯2∶1～1∶2 和乙酸乙酯)，制備薄層色譜得化合物4(20.0 mg)。E23 組分經Sephadex LH-20 以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫得到亞組分E23-3～E23-4，E23-3 組分用甲醇反復重結晶得化合物5(1.0 mg)，E23-4 組分經反相硅膠柱層析(甲醇-水40∶60)得化合物6(5.5 mg)。E15 組分經Sephadex LH-20 以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫，反相硅膠柱層析(甲醇-水30∶70)，用甲醇反復重結晶得化合物7(1.3 mg)。E34 組分經Sephadex LH-20 以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫，用甲醇反復重結晶得化合物8(1.5 mg)。E25 組分經Sephadex LH-20 以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫，反相硅膠柱層析(甲醇-水20∶80)，制備薄層色譜得化合物9(2.0 mg)。E21組分經Sephadex LH-20 以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫，反相硅膠柱層析(甲醇-水20∶80)，用甲醇反復重結晶，制備薄層色譜得化合物10(5.2 mg)。

2.3 細胞毒活性測定

采用SRB 法［7］測定化合物4 的細胞毒活性。取對數生長期的乳腺癌細胞MCF-7 和大細胞肺癌細胞NCI-H460，用胰酶消化，臺盼藍染色計數，臺盼藍排斥實驗檢測細胞活力大于95%后，用新鮮培養基調整細胞濃度為3 ×104個/mL，細胞接種于96 孔板，每孔加入180 μL 的細胞懸液，并設3 個空白孔調零，于37 ℃、5% CO2培養箱培養24 h。待細胞貼壁后，每孔加入20 μL 待測樣品，空白(陰性)對照加20 μL 培養基，以順鉑作陽性對照。置CO2培養箱中培養72 h 后，加入50 μL 50%冷三氯醋酸固定細胞，4 ℃放置1 h 后用蒸餾水洗滌5 次，空氣中自然干燥。然后每孔加入由1%冰醋酸配制的濃度為4 mg/mL 的SRB 溶液100 μL，室溫中染色30 min，去上清，用1%冰醋酸洗滌5 次，空氣干燥。最后每孔加入濃度為10 mmol/mL 的Tris 溶液200 μL，用酶標儀測定570 nm 處的吸光值(A)，用以下公式計算樣品對細胞生長的抑制率，采用SigmaPlot 10.0 軟件計算IC50值。

3 實驗結果

3.1 結構鑒定

化合物1 白色晶體;ESI-MS m/z:413 ［M +H］+，分 子 式 為C29H48O。1H NMR (500 MHz，CDCl3)δ:5.72 (1H，s，H-4)，1.18 (3H，s，H-19)，0.92 (3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，0.86 (3H，t，J=7.5 Hz，H-29)，0.84 (3H，d，J=6.8 Hz，H-27)，0.82 (3H，d，J=6.8 Hz，H-26)，0.71 (3H，s，H-18);13C NMR (125 MHz，CDCl3)δ:200.6 (C-3)，172.6 (C-5)，124.6 (C-4)，56.9 (C-14)，56.8 (C-17)，54.7 (C-9)，46.7 (C-24)，43.3 (C-13)，40.5(C-12)，39.5 (C-10)，37.0 (C-20)，36.6 (C-1)，36.5 (C-8)，34.9 (C-22)，34.8 (C-7)，33.9 (C-6)，33.0 (C-23)，30.0 (C-2)，29.1 (C-25)，26.9(C-16)，25.1 (C-15)，24.0 (C-28)，21.9 (C-11)，20.7 (C-27)，19.9 (C-19)，19.6 (C-21)，18.3 (C-26)，12.9 (C-18)，12.9 (C-29)。以上數據與文獻報道基本一致［8］，確定其結構為豆甾-4-烯-3-酮。

化合物2 白色粉末;EI-MS m/z:428 ［M］+，分子式為C29H48O2。1H NMR (500 MHz，MeOD)δ:6.14 (1H，s，H-6)，4.33 (1H，m，H-3)，1.30 (2H，m，H-28)，1.23 (3H，s，H-19)，0.97 (3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，0.89 (3H，t，J=7.5 Hz，H-29)，0.88 (3H，d，J=6.8 Hz，H-27)，0.85 (3H，d，J=6.8 Hz，H-26)，0.77 (3H，s，H-18);13C NMR (125 MHz，MeOD)δ:202.0 (C-7)，175.4 (C-5)，119.7(C-6)，68.6 (C-3)，56.9 (C-14)，56.5 (C-17)，54.8 (C-9)，46.8 (C-24)，43.1 (C-13)，41.9 (C-4)，40.4 (C-12)，39.8 (C-10)，36.9 (C-1)，36.9(C-20)，34.9 (C-8)，34.5 (C-22)，34.0 (C-2)，29.7 (C-25)，28.8 (C-16)，26.6 (C-23)，24.7 (C-15)，23.6 (C-28)，21.6 (C-11)，19.7 (C-26)，18.9(C-27)，18.7 (C-21)，18.0 (C-19)，11.8 (C-29)，11.8 (C-18)。以上數據與文獻報道基本一致［9］，確定其結構為豆甾-5-烯-3β-醇-7-酮。

化合物3 白色固體;EI-MS m/z:426 ［M］+，分子式為C29H46O2。1H NMR (500 MHz，CDCl3)δ:6.18 (1H，d，J=0.86 Hz，H-4)，1.17 (3H，s，H-19)，0.95 (3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，0.87 (3H，t，J=7.5 Hz，H-29)，0.85 (3H，d，J=6.8 Hz，H-27)，0.85 (3H，d，J=6.8 Hz，H-26)，0.73 (3H，s，H-18);13C NMR (125 MHz，CDCl3)δ:203.3 (C-6)，200.5 (C-3)，162.0 (C-5)，126.4 (C-4)，57.5 (C-17)，56.8 (C-14)，51.9 (C-8)，47.7 (C-7)，46.7(C-24)，43.4 (C-13)，40.7 (C-10)，40.0 (C-12)，36.9 (C-20)，36.4 (C-1)，35.1 (C-8)，34.9 (C-2)，34.7 (C-22)，30.0 (C-25)，28.9 (C-16)，26.9(C-23)，24.9 (C-15)，24.0 (C-28)，21.8 (C-11)，20.7 (C-26)，19.9 (C-27)，19.6 (C-21)，18.4 (C-19)，12.9 (C-29)，12.8 (C-18)。以上數據與文獻報道基本一致［10］，確定其結構為豆甾-4-烯-3，6-二酮。

化合物4 白色固體;ESI-MS m/z:451 ［M +Na］+，分子式為C28H44O3。1H NMR (500 MHz，CDCl3)δ:5.23 (1H，m，H-23)，5.21 (1H，m，H-22)，4.43 (1H，d，J=3.6 Hz，H-7)，3.96 (1H，m，H-3)，3.15 (1H，d，J=3.6 Hz，H-6)，2.36 (1H，m，H-9)，2.12 (1H，m，H-20)，1.87 (1H，m，H-24)，1.03 (3H，d，J=6.9 Hz，H-21)，0.93 (3H，d，J=6.9 Hz，H-24＇)，0.88 (3H，s，H-18)，0.87 (3H，s，H-19)，0.85 (3H，d，J=7.0 Hz，H-27)，0.83 (3H，d，J=7.0 Hz，H-26);13C NMR (125 MHz，CDCl3)δ:153.5 (C-14)，136.2 (C-22)，133.2 (C-23)，126.1(C-8)，69.6 (C-3)，68.7 (C-5)，66.0 (C-7)，62.2(C-6)，57.7 (C-17)，43.9 (C-24)，43.7 (C-13)，40.5 (C-20)，40.2 (C-9)，39.6 (C-4)，37.5 (C-12)，36.7 (C-10)，34.0 (C-25)，33.1 (C-1)，32.0(C-2)，28.1 (C-16)，25.9 (C-15)，22.1 (C-21)，20.9 (C-24＇)，20.6 (C-26)，19.9 (C-27)，19.0 (C-11)，18.5 (C-18)，17.4 (C-19)。以上數據與文獻報道基本一致［11］，確定其結構為(22E，24S)-5α，6α-環氧基-24-甲基膽甾-8(14)，22-二烯-3β，7α-二醇。

化合物5 黃色固體;ESI-MS m/z:285 ［M +H］+，分子式為C16H12O5。1H NMR (500 MHz，DMSO)δ:12.96 (1H，s，5-OH)，10.39 (1H，s，4＇-OH)，7.96 (2H，m，H-2＇，6＇)，6.93 (2H，m，H-3＇，5＇)，6.85 (1H，s，H-3)，6.77 (1H，d，J=2.2 Hz，H-8)，6.37 (1H，d，J=2.2 Hz，H-6)，3.86 (3H，s，7-OCH3);13C NMR (125 MHz，DMSO)δ:183.3 (C-4)，166.5 (C-7)，165.4 (C-2)，162.7 (C-4＇)，162.6(C-5)，158.6 (C-8a)，129.9 (C-2＇，6＇)，122.4 (C-1＇)，117.3 (C-3＇，5＇)，106.0 (C-4a)，104.4 (C-3)，99.3 (C-6)，94.1 (C-8)，57.4 (7-OCH3)。以上數據與文獻報道基本一致［12］，確定其結構為5，4＇-二羥基-7-甲氧基黃酮。

化合物6 白色粉末;EI-MS m/z:168 ［M］+，分子式為C8H8O4。1H NMR (500 MHz，DMSO)δ:7.45 (1H，s，H-2)，7.41 (1H，d，J=8.0 Hz，H-6)，6.79 (1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，3.77 (3H，s，-OCH3);13C NMR (125 MHz，DMSO)δ:151.5 (C-4)，148.3 (C-3)，124.5 (C-6)，116.1 (C-2)，114.3(C-5)，56.8 (-OCH3)。以上數據與文獻報道基本一致［13］，確定其結構為香草酸。

化合物7 白色粉末;ESI-MS m/z:151 ［MH］-，分子式為C8H8O3。1H NMR (500 MHz，MeOD)δ:7.97 (2H，d，J=8.9 Hz，H-2，6)，6.94 (2H，d，J=8.9 Hz，H-3，5)，3.85 (3H，s，-OCH3)。以上數據與文獻報道基本一致［14］，確定其結構為對甲氧基苯甲酸。

化合物8 黃色固體;ESI-MS m/z:113 ［M +H］+，111 ［M-H］-，分子式為C4H4N2O2。1H NMR(500 MHz，DMSO)δ:11.01 (1H，br s)，10.82 (1H，br s)，7.38 (1H，d，J=7.6 Hz，H-6)，5.44 (1H，d，J=7.6 Hz，H-5);13C NMR (125 MHz，DMSO)δ:165.7 (C-1)，152.9 (C-3)，143.6 (C-5)，101.6 (C-6)。以上數據與文獻報道基本一致［15］，確定其結構為尿嘧啶。

化合物9 黃色粉末;ESI-MS m/z:304 ［2M +Na+H］+，320 ［2M+K+H］+，分 子 式 為C7H8O3。1H NMR (500 MHz，MeOD)δ:7.58 (1H，d，J=1.2 Hz，H-3)，7.50 (1H，d，J=8.2 Hz，H-6)，6.77 (1H，dd，J=8.2，1.2 Hz，H-5)，3.89(3H，s，-OCH3);13C NMR (125 MHz，MeOD)δ:150.0 (C-4)，147.7 (C-2)，128.6 (C-1)，123.9 (C-6)，114.8 (C-5)，113.5 (C-3)，55.8 (-OCH3)。以上數據與文獻報道基本一致［16］，確定其結構為2-甲氧基對苯二酚。

化合物10 無色油狀液體;ESI-MS m/z:193［M-H］-，分子式為C10H10O4。1H NMR (500 MHz，CD3OD)δ:7.58 (1H，dd，J=7.5，8.4 Hz，H-7)，7.08 (1H，d，J=7.5 Hz，H-8)，6.94 (1H，dd，J=8.3，0.8 Hz，H-6)，4.56 (2H，m，H-2，H-3)，1.47(3H，d，J=6.3 Hz，CH3-2);13C NMR (125 MHz，CD3OD)δ:169.7 (C-4)，162.4 (C-5)，143.6 (C-8a)，137.3 (C-7)，117.3 (C-6)，117.2 (C-8)，107.5 (C-4a)，81.1 (C-2)，69.0 (C-3)，17.7 (C-2a)。以上數據與文獻報道基本一致［17］，確定其結構為2-甲基-3，5-羥基色酮。

3.2 細胞毒活性

細胞毒活性測試結果表明，化合物4 對腫瘤細胞株MCF-7 和NIC-H460 的IC50分別為34.22 μg/mL 和37.97 μg/mL(表1)。

表1 化合物4 對2 種腫瘤細胞株的IC50值Table 1 IC50values of compound 4 against two tumor cell lines

4 討論

葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria)真菌是農林業上重要的病原菌、內生真菌或潛在的致病菌，能產生具有細胞毒活性、抗菌活性等次級代謝產物［3，4］。如黃玖利從海南粗榧內生真菌葡萄座腔菌S15 的發酵產物中分離得到具有抑制人慢性髓原白血病細胞K562 活性的化合物［18］。本研究從藥用植物白木香內生真菌B.rhodina A13 的固體發酵產物中分離鑒定了10 個化合物，它們均為首次從該屬真菌中分離得到。化合物5 為黃酮類化合物，具有抗口腔表皮樣癌細胞KB 作用，此化合物的多個衍生物具有顯著的抗KB 細胞和抑制DNA 拓撲異構酶I 活性［12］。化合物1～4 是甾體類化合物，活性測試結果表明化合物4 有細胞毒活性。

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