一種新型的高效液相色譜填料

李心怡，谷曉娟，孫孔春，姚艷云，沈報春*

1昆明醫(yī)科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，昆明 650500;2 楚雄醫(yī)藥高等專科學校，楚雄 675005

近年來，新型液相色譜分離模式和固定相的研究非常活躍，鍵合硅膠固定相已成為近代液相色譜發(fā)展的主流。新型鍵合固定相分子設(shè)計、合成、性能、應用及分離機理研究是當今高效液相色譜法領(lǐng)域內(nèi)的重要課題。隨著分離對象的越來越多樣性和復雜性，對傳統(tǒng)的十八烷基硅烷化硅膠(ODS)色譜固定相提出了巨大挑戰(zhàn)，發(fā)展基于超分子作用或π-酸和π-堿多個作用位點的高效液相硅膠色譜固定相成為近年來色譜分離材料研究中的熱點之一［1，2］。

研究表明，天然化合物獨特的結(jié)構(gòu)使其具有作為色譜配體的能力，能用于相似結(jié)構(gòu)物質(zhì)的分離富集，并且由于其具有天然、低毒或無毒性質(zhì)，人工合成配體無法達到這種效果［3，4］。薯蕷皂苷的化學結(jié)構(gòu)中存在多個活潑的羥基和雙鍵，用其制備成固定相能與溶質(zhì)產(chǎn)生氫鍵作用、偶極-偶極作用、π-π 作用等多種作用。三七［Panax notoginseng (Burk.)F.H.Chen］是五加科植物，以干燥的根入藥，有散瘀止血，消腫止痛的功效［5］。三七中含有多種人參皂苷以及與人參皂苷類似的成分［6］，其主要藥理活性成分為三七總皂苷(Panax notoginseng saponins，PNS)［7］。以三七總皂苷為原料藥的制劑也不斷涌現(xiàn)。為了有效打擊假劣藥品，保證藥品質(zhì)量，同時為了實現(xiàn)中藥標準標準化，推動中藥材GAP 的實施，建立三七總皂苷原料藥及其制劑的質(zhì)量控制方法勢在必行。

本實驗以薯蕷皂苷為原料，采用“一鍋法”，制備得到一種新型的高效液相色譜填料——薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相。對該固定相進行結(jié)構(gòu)表征，采用不同的溶質(zhì)探針對新固定相的色譜性能進行評價，并建立三七總皂苷原料藥進行HPLC 指紋圖譜，可用于其質(zhì)量控制。該研究不僅擴大了薯蕷皂苷的應用范圍，對天然產(chǎn)物中活性成分的分離分析也提出了新的思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津LC-2010A 高效液相色譜儀，島津SPDM10AVP 檢測器;裝柱機:Haskel 氣動高壓裝柱機(Haskeline.，Burbank，USA);空柱管(250 mm ×4.6 mm):大連日普利科技儀器有限公司;元素分析儀(VarioEL，德國);固體核磁共振儀(德國Bruker 公司);S-3000N 電子掃描顯微鏡(日本日立公司);TGS 系列熱重分析儀(北京博淵精準科技發(fā)展有限公司)。

Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 × 250 mm，5 μm);l，6-己二異氰酸酯(1，6-diisocyanatehexane，99%，Acros Organics);硅膠(青島美高化工有限公司，平均粒徑5 μm，平均孔徑92 ?，比表面積260 m2/g);乙腈，甲醇(江蘇漢邦科技有限公司，色譜純)，水(三次重蒸水)，其余試劑均為分析純。色譜評價所用試劑均購于中國試劑網(wǎng)，國藥集團化學試劑有限公司。

薯蕷皂苷(南京春秋生物工程有限公司，98%);三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd(成都普菲德生物技術(shù)有限公司);三七總皂苷原料藥(批號:120801、120805、120807、120901、120909、120911、120916、121003、121007、121008)由云南云科藥業(yè)提供。

1.2 薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相的制備

1.2.1 薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相的合成

薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相的制備反應式見圖1。具體實驗步驟為:冰浴中，氮氣保護，向50 mL 3.0 g 硅烷化硅膠的干燥甲苯中加入1，6-己二異氰酸酯(2.5 mL，15 mmol)，攪拌15 min。移去冰浴，混合物加熱至70 ℃反應2 h，冷卻至室溫后，氮氣保護下除去多余溶劑。將10 mL 干燥甲苯分3 次洗滌，除掉過量的1，6-己二異氰酸酯。然后加入100 mL 含0.5 g 薯蕷皂苷的干燥吡啶溶液，將反應化合物加熱至70 ℃，攪拌12 h 至薯蕷皂苷反應完全。冷卻至室溫后過濾，分別用50 mL 的吡啶、水、甲醇、乙腈和二氯甲烷洗滌，減壓干燥(70 ℃，0.1 mbar，2 h)，得到薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相。

圖1 薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相合成路線Fig.1 Synthetic routes of dioscin-bonded silica gel stationary phase

1.2.2 薯蕷皂苷鍵合硅膠色譜柱的制備

將3.30 g 的薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相分散到50 mL 的氯仿-丙酮(1∶1，v/v)溶液中，超聲分散。用50 mL 針筒注入勻漿罐內(nèi)，勻漿罐接至裝柱機上，乙醇做頂替液，用6000 psi(約4.15 ×107Pa)壓力下裝入不銹鋼空柱中，頂替液成線形流出，維持高壓30 min，然后撤去壓力。待壓力表指針讀數(shù)降為零時，取下裝填好的色譜柱，用小刀削平填料，兩端密封，貼好標記及流動相方向待用。柱效用聯(lián)苯測定。

1.3 三七總皂苷原料藥的指紋圖譜分析

流動相:乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫程序:0～42 min，14%A;42～69 min，14%～33%A;69～79 min，33%A;79～80 min，33%～90% A;80～110 min，90%A。流速:0.8 mL/min，柱溫:35 ℃，檢測波長:203 nm，進樣量15 μL。

分別精密稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd 對照品適量，用甲醇溶解，制得濃度分別為0.87、3.89、0.44、0.86、1.2 mg/mL 的混合對照品溶液。

分別取不同批號的三七總皂苷原料藥約100 mg，精密稱定，置于25 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。進樣前取適量溶液用0.45 μm 微孔濾膜過濾。

2 結(jié)果與討論

2.1 薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相的結(jié)構(gòu)表征

固體核磁共振和紅外光譜可以提示固定相的結(jié)構(gòu);元素分析可根據(jù)相關(guān)元素的百分含量，計算出鍵合量;熱重分析則能用于估算固定相有機物總濃度，其掃描曲線與配體穩(wěn)定性有關(guān);電鏡掃描可由鍵合前后硅膠顆粒表層的改變，判斷鍵合成功與否。

2.1.1 固定相的固體核磁分析

薯蕷皂苷鍵合前后的13C 固體核磁圖譜見圖2。從圖2 可以看出，薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相的13C 固體核磁圖譜(圖2 B)比硅烷化硅膠的13C 固體核磁圖譜(圖2 A)多出兩簇峰，化學位移是δ:160 和δ:158，推測為=C-、C=O 基團的信號峰。此外，硅烷化硅膠的-CH2(δ:25、δ:43)信號在鍵合上薯蕷皂苷配體后，出現(xiàn)偏移、信號增強，歸因于與薯蕷皂苷配體在此的信號峰(-CH2，-CH，-C-O)發(fā)生重疊。

2.1.2 固定相的紅外光譜分析

圖2 硅烷化硅膠及薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相的13C 固體核磁圖譜Fig.2 The solid-state 13C NMR of silylanization silica gel(A)and dioscin-bonded silica gel stationary phase(B)

硅烷化硅膠紅外光譜中，3455 cm-1提示分子結(jié)構(gòu)中有N-H 基團，表明硅膠已經(jīng)發(fā)生硅烷化;薯蕷皂苷鍵合硅膠的紅外光譜比硅烷化硅膠的紅外光譜多出三組峰:在2940 cm-1多出一個C-H 伸縮振動吸收峰，1642 cm-1，1570 cm-1提示有C=C，C=O 基團。這些數(shù)據(jù)表明薯蕷皂苷已經(jīng)鍵合至硅烷化硅膠表面。

2.1.3 固定相的元素分析

硅烷化硅膠和薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相的元素分析結(jié)果見表1。與硅烷化硅膠相比，薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相的C、N、H 的含量均有增加。以含C量計算，薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相表面配體濃度為127.6 μmol/g。

表1 元素分析結(jié)果Table 1 Elemental analysis results

2.1.4 固定相的熱重分析

熱重分析結(jié)果顯示，隨著溫度的逐漸升高，硅膠表面的有機物發(fā)生分解，當溫度升至176.9 ℃時，薯蕷皂苷固定相產(chǎn)生明顯的失重。薯蕷皂苷固定相在溫度達到176 ℃以后才開始失重，說明薯蕷皂苷固定相具有較好的熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性，這為其穩(wěn)定的色譜性能奠定了基礎(chǔ)。

2.1.5 固定相的電鏡掃描分析

從硅膠、薯蕷皂苷固定相的電子顯微鏡掃描圖(圖3)可明顯觀察到，鍵合前后硅膠顆粒的表層形態(tài)存在明顯差異。鍵合前硅膠顆粒的表面光滑圓潤，鍵合后硅膠顆粒表面變得粗糙不平，表面被一層物質(zhì)覆蓋。結(jié)合固定相的元素分析和熱重分析可知，薯蕷皂苷已成功鍵合到硅膠上。

2.2 柱效與穩(wěn)定性考察

以聯(lián)苯為溶質(zhì)探針，甲醇-水(65∶35，v/v)為流動相，流速設(shè)為0.4 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測波長設(shè)為254 nm，測得理論塔板數(shù)為4558 塊/米。采用甲醇交替沖洗一個月，聯(lián)苯保留時間、理論塔板數(shù)變化很小，說明該固定相上的薯蕷皂苷配體在流動相中是穩(wěn)定的。

圖3 正相硅膠固定相(A)和薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相(B)的電鏡掃描圖Fig.3 The scanning electron microscope of silica gel stationary phase (A)and dioscin-bonded silica gel stationary phase (B)

2.3 三七總皂苷原料藥的指紋圖譜分析

指紋圖譜分析是對中藥及其制劑進行宏觀分析的可行手段［8］。以人參皂苷Re 為參照峰(S)，確定16 個共有峰，對10 批三七總皂苷原料藥進行指紋圖譜分析，建立了三七總皂苷原料藥在薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相上的指紋圖譜。

2.3.1 精密度試驗

取同一供試品溶液，連續(xù)進樣6 次，考察各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的一致性，結(jié)果表明各共有峰相對保留時間的RSD＜1.40%，相對峰面積的RSD＜2.42%，結(jié)果表明方法精密度良好。

2.3.2 重復性試驗

取同一批樣品6 份，精密稱定，制成供試品溶液，分別進樣，考察各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的一致性，各共有峰相對保留時間的RSD＜0.74%，相對峰面積的RSD＜2.93%，結(jié)果表明方法重現(xiàn)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，室溫放置，分別于0、4、8、12、16、24 h 進樣，考察各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的一致性，各共有峰相對保留時間RSD＜1.42%，相對峰面積的RSD＜2.90%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 指紋圖譜的建立

用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(中國藥典委員會2004A 版)處理10 批三七總皂苷原料藥色譜圖，生成對照譜圖(R)(見圖4);共標定了16 個共有峰(占總面積90%以上)，共有峰在10 批藥材中相對保留時間RSD＜1.36%，10 批樣品相似度分別為0.993、0.984、0.985、0.995、0.984、0.992、0.990、0.996、0.987、0.992。

以O(shè)DS 商品柱在相同的色譜條件下測定三七總皂苷原料藥，發(fā)現(xiàn)樣品的人參皂苷Rg1和Re 未能獲得分離;其次，72～82 min 內(nèi)的峰分離情況不理想;第三，人參皂苷Rd 在90 min 采集時間內(nèi)不能被洗脫。三七總皂苷原料藥在ODS 柱上的高效液相色譜圖見圖5。

與ODS 柱相比，薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相在同條件下，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd 均能達到基線分離;72～82 min 內(nèi)，獲得基線分離的色譜峰數(shù)目更多;人參皂苷Rd 的保留時間在68 min 左右，且90 min 內(nèi)，樣品色譜峰洗脫完全。

4 10 批次三七總皂苷原料藥樣品的高效液相色譜疊加圖Fig.4 Overlaid HPLC chromatograms of 10 batches of PNS APIs

圖5 三七總皂苷原料藥樣品在ODS 商品柱上的高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of PNS API on commercial ODS C18 column

3 結(jié)論

以天然產(chǎn)物藥用成分薯蕷皂苷為原料，制備得到一種新型的高效液相色譜填料——薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相。經(jīng)固體核磁共振、紅外光譜分析、電鏡掃描、熱重分析等技術(shù)確證，薯蕷皂苷已鍵合至硅膠表面并具有一定的熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性，由元素分析結(jié)果計算得出薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相表面配體濃度為127.6 μmol/g。采用自制的薯蕷皂苷鍵合硅膠色譜柱，乙腈-水梯度洗脫，建立了三七總皂苷原料藥指紋圖譜，為三七總皂苷原料藥質(zhì)量控制方法提供技術(shù)支持。與商品柱ODS 相比，薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相在分離人參皂苷Rg1、人參皂苷Re 時表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢;72～82 min 內(nèi)，獲得基線分離色譜峰數(shù)目更多;并在較短時間內(nèi)完成樣品分離分析。薯蕷皂苷鍵合硅膠固定相的研制，為高效液相色譜固定相材料的尋找提供了新的方向，也為天然產(chǎn)物中活性成分的分離分析提供了新的思路。

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