海南不同產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛活性成分的比較研究

王 佳，陳海霞*，邢利沙，王艷偉，黃宇航，劉海青

1天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 天津市現(xiàn)代藥物傳遞及功能高效化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072;2海南大學(xué)海洋學(xué)院，海口 570228

鐵皮石斛(Dendrobium candidum Wall.ex Lindl)是蘭科石斛屬植物，具有滋陰清熱、生津益胃、潤(rùn)肺止咳的功效［1］，名列“中華九大仙草”之首，為《中華人民共和國(guó)藥典》中收載的名貴中草藥之一。現(xiàn)代藥理研究表明鐵皮石斛具有提高機(jī)體免疫力、防治白內(nèi)障、抗疲勞、抗氧化、促消化、降血糖、降血壓、抗肝損傷、抗腫瘤等功效［2，3］。植物化學(xué)成分分析表明鐵皮石斛中主要的生物活性物質(zhì)是多糖類化合物，且含量較高［4］，多糖含量的高低是目前判斷鐵皮石斛質(zhì)量的主要依據(jù)［5］。

鐵皮石斛為多年生植物，不同產(chǎn)地氣候影響著植物代謝的過(guò)程，影響植物體內(nèi)有效成分的形成與積累［6］，導(dǎo)致不同產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛的產(chǎn)量及質(zhì)量有所差異，因此，有必要對(duì)不同產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛藥材質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，為鐵皮石斛的采收提供科學(xué)參考。目前，對(duì)于海南不同產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛有效成分比較還未見報(bào)道，本研究比較了鐵皮石斛水提物，醇提物中主要成分及其與DPPH 自由基清除，還原力及α-淀粉酶抑制活性的關(guān)系，為海南產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛資源利用，鐵皮石斛天然產(chǎn)物在藥品及保健食品領(lǐng)域中的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV-2450 紫外分光光度計(jì)(日本Shimadzu)，BP211D 分析天平(德國(guó)Sartorius)，恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(美國(guó)Sigma，257621)，α-淀粉酶(上海晶純生化科技股份有限公司，A109182)，其余試劑均購(gòu)買于天津市化工技術(shù)有限公司。鐵皮石斛藥材從海南省瓊中縣寶元堂、三亞、儋州、保亭、五指山、昌江、樂東、陵水收集采購(gòu)，由天津大學(xué)陳海霞教授鑒定。

1.2 不同產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛活性成分提取及分離純化

將取自海南省上述八個(gè)產(chǎn)區(qū)的鐵皮石斛粉碎后，分別精密稱取鐵皮石斛粗粉10 g，按1∶30(m/v)加入80%乙醇于80 ℃加熱回流提取3 次，每次2 h，提取液合并后減壓回收溶劑，真空冷凍干燥得到醇提物。取上述醇提物，經(jīng)AB-8 大孔樹脂吸附完全后，分別用30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇洗脫，每種洗脫液收集4 BV，濃縮后，測(cè)定總多酚及總黃酮含量，取富集部位分別計(jì)算鐵皮石斛醇提物得率及主要成分含量。乙醇提取后的殘?jiān)?∶30(m/v)加入去離子水于100 ℃加熱回流提取3 次，每次2 h，將提取液合并旋轉(zhuǎn)蒸干后，真空冷凍干燥得到水提物，測(cè)定水提物得率及主要成分含量。

1.3 鐵皮石斛醇提物中主要成分含量測(cè)定

1.3.1 總多酚含量測(cè)定

采用福林酚法測(cè)定總多酚含量［7］，取樣品500 μL，加入500 μL 福林酚試液，20% Na2CO3溶液500 μL，加水補(bǔ)至5 mL，在760 nm 處測(cè)定吸光值。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算總多酚含量。所有的測(cè)定都進(jìn)行了三次重復(fù)。

1.3.2 總黃酮含量測(cè)定

采用氧化鋁法測(cè)定總黃酮含量［7］，取樣品250 μL，加入5% NaNO2溶液150 μL，搖勻放置6 min后，加入10% Al(NO3)3溶液150 μL，混勻放置6 min 后，加入1 mol/L NaOH 溶液2 mL，加水0.2 mL，搖勻后放置10 min，在510 nm 處測(cè)定吸光值。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算總黃酮含量。所有的測(cè)定都進(jìn)行了三次重復(fù)。

1.4 鐵皮石斛水提物中主要成分含量測(cè)定

1.4.1 中性糖含量測(cè)定

采用硫酸苯酚法測(cè)定中性糖含量［8］，取樣品200 μL，加入5%苯酚，混勻后加入濃硫酸1.0 mL，靜置冷卻后，在490 nm 處測(cè)定吸光值。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算中性糖含量。所有的測(cè)定都進(jìn)行了三次重復(fù)。

1.4.2 酸性糖含量測(cè)定

采用硫酸咔唑法測(cè)定酸性糖含量［8］，取樣品250 μL，加入四硼酸鈉溶液1.5 mL，混勻后在100℃下加熱10 min，迅速冷卻后加入50 μL 咔唑溶液，混勻后在100 ℃下加熱15 min，迅速冷卻至室溫，在525 nm 處測(cè)定吸光值。以D-半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算酸性糖含量。所有的測(cè)定都進(jìn)行了三次重復(fù)。

1.4.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量［8］，取樣品500 μL，加入5.0 mL 考馬斯亮藍(lán)染液，混勻后，在595 nm 處測(cè)定吸光值。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算蛋白質(zhì)含量。所有的測(cè)定都進(jìn)行了三次重復(fù)。

1.4.4 總多酚含量測(cè)定

測(cè)試方法同1.3.1。

1.5 鐵皮石斛醇提物及水提物抗氧化活性比較

1.5.1 鐵皮石斛醇提物及水提物DPPH 自由基清除活性的測(cè)定

參照文獻(xiàn)［8］，分別取不同濃度的樣品(5、10、20、25、30 mg/mL)0.1 mL 與2.9 mL DPPH(120 μmol/L)充分混勻，37 ℃避光保溫30 min，測(cè)量其在517 nm 下的吸光值，只加入樣品溶劑的反應(yīng)體系作為空白對(duì)照。樣品DPPH 自由基清除率的計(jì)算公式為:I%=［(Ablank-Asample)/Ablank］×100。Ablank為空白對(duì)照的吸光度，Asample為樣品的吸光度。

1.5.2 鐵皮石斛醇提物及水提物三價(jià)鐵還原/抗氧化性的測(cè)定

參照文獻(xiàn)［8］，分別取不同濃度的樣品(5、10、20、25、30 mg/mL)0.1 mL，加入0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH=6.6)0.7 mL，1%鐵氰化鉀溶液2 mL，50℃水浴20 min 后加10%三氯乙酸2 mL，混勻后離心(3000 × g)5 min。取上清液1 mL 加入1%三氯化鐵3 mL，混勻后在700 nm 處測(cè)定吸光值，吸光值大表明還原力強(qiáng)。

1.6 鐵皮石斛醇提物及水提物對(duì)α-淀粉酶抑制活性的比較

參照文獻(xiàn)［9］，分別取上述醇提物及水提物(5 mg/mL)0.1 mL，加入α-淀粉酶，底物為淀粉溶液，加入DNS 溶液(1% 3，5-二硝基水楊酸和0.4 mol/L NaOH 溶解的12 %酒石酸鉀鈉)用于終止反應(yīng)。反應(yīng)液稀釋20 倍后，測(cè)定其在540 nm 下吸光值，只加入樣品溶劑的反應(yīng)體系作為空白對(duì)照。樣品α-淀粉酶抑制率的計(jì)算公式為:I%=［(Ablank-Asample)/Ablank］×100。Ablank為空白對(duì)照的吸光度，Asample為樣品的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛醇提物中總多酚，總黃酮的含量

表1 海南不同產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛醇提物得率，總多酚，總黃酮的含量Table 1 Comparative analysis of extraction yield，total phenolic contents and total flavonoids contents in alcohol extracts of D.candidum from different areas of Hainan

海南省八個(gè)不同產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛醇提物經(jīng)AB-8大孔樹脂進(jìn)一步富集后，其總多酚，總黃酮含量見表1，其中瓊中產(chǎn)區(qū)的鐵皮石斛醇提物具有最高得率(61.23 mg/g)，其次為昌江(60.90 mg/g)、三亞(58.31 mg/g)、保亭(51.28 mg/g)，樂東、陵水產(chǎn)區(qū)所得鐵皮石斛醇提物得率相對(duì)較低。總多酚含量由大到小對(duì)應(yīng)的產(chǎn)區(qū)依次為:三亞＞瓊中＞保亭＞五指山＞昌江＞樂東＞儋州＞陵水。總黃酮含量由大到小對(duì)應(yīng)的產(chǎn)區(qū)依次為:瓊中＞三亞＞保亭＞儋州＞昌江＞五指山＞樂東＞陵水。在這八個(gè)產(chǎn)區(qū)中，瓊中、三亞、保亭三個(gè)產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛醇提物得率，總多酚，總黃酮均顯示較高值。

2.2 鐵皮石斛水提物中性糖，酸性糖，蛋白質(zhì)，總多酚的含量

表2 海南不同產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛水提物得率，中性糖，酸性糖，蛋白質(zhì)，總多酚的含量Table 2 Comparative analysis of extraction yield，neutral sugar contents，uronic acid contents，protein contents and total phenolic contents in aqueous extracts of D.candidum from different areas of Hainan

海南省八個(gè)不同產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛水提物的得率，中性糖，酸性糖，蛋白質(zhì)，總多酚含量見表2，其中儋州產(chǎn)區(qū)的鐵皮石斛水提物具有最高得率(214.96 mg/g)，其次為昌江(180.00 mg/g)，五指山(179.44 mg/g)，瓊中、三亞、保亭產(chǎn)區(qū)所得鐵皮石斛水提物得率相對(duì)較低。中性糖為鐵皮石斛水提物的主要成分，其含量由大到小對(duì)應(yīng)的產(chǎn)區(qū)依次為:五指山＞昌江＞樂東＞陵水＞儋州＞保亭＞瓊中＞三亞。酸性糖含量由大到小對(duì)應(yīng)的產(chǎn)區(qū)依次為:三亞＞保亭＞瓊中＞儋州＞五指山＞樂東＞陵水＞昌江，酸性糖的含量大小順序與中性糖的含量大小順序基本呈現(xiàn)出相反的趨勢(shì)。鐵皮石斛水提物中所含蛋白質(zhì)和多酚的含量相對(duì)較少，昌江產(chǎn)區(qū)蛋白質(zhì)含量最高(13.46 mg/g)，三亞產(chǎn)區(qū)多酚含量最高(31.13 mg/g)。

2.3 鐵皮石斛醇提物及水提物DPPH 自由基清除活性的測(cè)定

表3 海南不同產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛醇提物及醇提物DPPH 自由基清除活性Table 3 Scavenging activity against DPPH radical of alcohol extracts and aqueous extracts of D.candidum from different areas of Hainan

DPPH 自由基清除活性試驗(yàn)是常用的用來(lái)評(píng)價(jià)化合物抗氧化活性的指標(biāo)之一，當(dāng)DPPH 自由基與抗氧化劑發(fā)生反應(yīng)后，顏色由深紫色變成亮黃色，通過(guò)測(cè)定波長(zhǎng)517 nm 下的吸光值，比較被測(cè)物質(zhì)DPPH 自由基清除活性［10］。表3 結(jié)果顯示，比較同一產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛醇提物及水提物的DPPH 自由基清除活性，醇提物表現(xiàn)出較好的DPPH 自由基清除活性，水提物DPPH 自由基清除活性相對(duì)較低。瓊中、三亞、保亭產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛醇提物顯示較強(qiáng)DPPH 自由基清除活性，此三個(gè)產(chǎn)區(qū)醇提物中總多酚，總黃酮含量相對(duì)較高(表1)，儋州、五指山、昌江、樂東、陵水產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛水提物未顯示DPPH 自由基清除活性，結(jié)合水提物主成分分析(表2)，相比其他產(chǎn)區(qū)，以上五個(gè)產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛水提物中所含酸性糖，總多酚含量較低，推測(cè)可能與該產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛DPPH 自由基清除活性較低有關(guān)。

2.4 鐵皮石斛醇提物及水提物三價(jià)鐵還原/抗氧化性的測(cè)定

圖1 海南不同產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛醇提物及水提物還原力(n=3，means ± SD)Fig.1 Reducing power of alcohol extracts (A)and aqueous extracts (B)of D.candidum from different areas of Hainan (n=3，means ± SD)

還原力試驗(yàn)是另一種用來(lái)評(píng)價(jià)化合物抗氧化活性的指標(biāo)之一，抗氧化物質(zhì)將鐵氰化鉀中三價(jià)鐵離子還原成二價(jià)鐵離子，生成藍(lán)色螯合物普魯士藍(lán)，通過(guò)在700 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值來(lái)評(píng)價(jià)抗氧化性強(qiáng)弱［11］。圖1 結(jié)果顯示，同一產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛，醇提物(A)比水提物(B)表現(xiàn)出更高的還原力。同DPPH 自由基清除活性試驗(yàn)結(jié)果相似，不同產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛還原力活性有較大差異，瓊中、三亞、保亭產(chǎn)區(qū)醇提物表現(xiàn)出較高的還原力，其對(duì)應(yīng)的水提物及儋州產(chǎn)區(qū)水提物顯示出較高的還原力，且表現(xiàn)出一定的濃度依賴性。

2.5 鐵皮石斛提取物對(duì)α-淀粉酶抑制活性的測(cè)定

α-淀粉酶抑制劑能抑制腸道內(nèi)唾液及胰α-淀粉酶的活性，阻礙食物中淀粉及其他碳水化合物的消化吸收，從而起到降血糖的作用［12］。圖2 顯示同等濃度下(5 mg/mL)，儋州產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛水提物表現(xiàn)出最高的α-淀粉酶抑制活性。與DPPH 自由基清除活性，還原力試驗(yàn)結(jié)果不同，相同產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛，其水提物比醇提物表現(xiàn)出更高的α-淀粉酶抑制活性，可能與水提物中含有較高含量的多糖有關(guān)，Gourgue［13］等人曾報(bào)道過(guò)多糖結(jié)構(gòu)中大量游離羧基可以抑制酶的活性。

圖2 海南不同產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛醇提物及水提物α-淀粉酶抑制活性(n=3，means ± SD)Fig.2 Inhibitory effects on α-amylase of alcohol extracts and aqueous extracts of D.candidum from different areas of Hainan (n=3，means ± SD)

2.6 鐵皮石斛中的活性成分與抗氧化性，降血糖活性的線性關(guān)系

表4 鐵皮石斛醇提物及水提物中主要成分含量與DPPH 自由基清除活性，還原力，α-淀粉酶抑制活性的Pearson 相關(guān)系數(shù)Table 4 Correlation coefficients (Pearson’s correlation coefficient)of the contents of main components in alcohol extracts and aqueous extracts of D.candidum with the DPPH radical scavenging activity，reducing power and α-amylase inhibition activity

為了研究鐵皮石斛中有效成分對(duì)抗氧化，降血糖活性的影響，通過(guò)SPSS 軟件計(jì)算Pearson 相關(guān)系數(shù)(P＜0.05)，Pearson 相關(guān)系數(shù)越接近1，說(shuō)明該成分與對(duì)應(yīng)的活性相關(guān)性越高。從表4 可以看出，醇提物總黃酮含量與DPPH 自由基清除活性，還原力有顯著的線性相關(guān)性(r=0.867，P＜0.01;r=0.836，P＜0.01)，總多酚表現(xiàn)出相對(duì)較高的相關(guān)性(r=0.904，P＜0.01;r=0.861，P＜0.01)，可推測(cè)得出總多酚可能是鐵皮石斛醇提物中主要的抗氧化活性成分之一。水提物中性糖，蛋白質(zhì)含量與DPPH自由基清除活性，還原力無(wú)相關(guān)性，說(shuō)明鐵皮石斛水提物中以上兩種成分抗氧化活性較小。水提物酸性糖，總多酚含量與DPPH 自由基清除活性，還原力有很好的線性相關(guān)性(r=0.752，0.762;r=0.725，r=0.807)。此外，水提物，醇提物中檢測(cè)的成分與α-淀粉酶抑制活性無(wú)明顯相關(guān)性，對(duì)于鐵皮石斛的α-淀粉酶抑制活性及有效成分還有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本研究對(duì)海南八個(gè)不同產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛水提物及醇提物主要成分，DPPH 自由基清除活性，還原力和α-淀粉酶抑制活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。其中瓊中、三亞、保亭產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛水提物及八個(gè)產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛醇提物均表現(xiàn)出較高的DPPH 自由基清除活性及還原力活性，儋州產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛水提物表現(xiàn)出較高的α-淀粉酶抑制活性。鐵皮石斛中性糖，蛋白質(zhì)含量與抗氧化活性的線性相關(guān)系數(shù)較小，酸性糖，總多酚，總黃酮與抗氧化活性有較好的線性相關(guān)性，其中醇提物中總多酚表現(xiàn)出相對(duì)最高的線性相關(guān)(r=0.904，P＜0.01;r=0.861，P＜0.01)。由此推斷總多酚是鐵皮石斛中抗氧化的活性成分之一。參考上述研究結(jié)果，可根據(jù)鐵皮石斛在藥品及保健食品中的用途，選擇性的采收某些產(chǎn)區(qū)的鐵皮石斛以及針對(duì)性的提取活性成分，提高鐵皮石斛在開發(fā)過(guò)程中的資源利用率。

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