滇重樓的psbA-trnH 條形碼分子鑒定研究

劉 濤 ，趙英良，楊 瑩，王 玲，李 瑪，王欣林，周 博，楊生超*

1云南農(nóng)業(yè)大學(xué);2 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，昆明 650201

重樓屬(Paris L.)隸屬于百合科(Liliaceae)，全屬共28 種，均為多年生草本，分布于歐亞大陸的熱帶及溫帶地區(qū)［1］。該屬是一個(gè)有著重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物類群，藥用歷史悠久，但藥用重樓的基源一直比較混亂，本屬蚤休亞屬(Paris subg.Daiswa sensus)的所有種類均具有粗壯的根狀莖［1］。為澄清藥用重樓基源混亂的問(wèn)題，李恒對(duì)《滇南本草》等古籍文獻(xiàn)進(jìn)行考證，表明藥用重樓應(yīng)以滇重樓(Pairs polyphylla Smith var.yunnanensis ［Franch.］Hand-Mazz)為正品，其它種類均為代用品［2］。

滇重樓(P.polyphylla)為多年生草本植物，味苦，有小毒，具有清熱解毒、消腫止痛之功效，具有抗腫瘤、止血、止咳平喘、抗菌、抗病毒等作用，也可用于療瘡癰腫、咽喉腫痛、驚風(fēng)抽搐的治療，是很多中成藥如宮血寧膠囊、三七血傷寧膠囊和清熱解毒片等著名中成藥的主要原料［3］。因滇重樓以根狀莖入藥，根據(jù)形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)等特征難以對(duì)正品及代用品進(jìn)行區(qū)分，使得在藥材的收購(gòu)及工廠化生產(chǎn)中無(wú)法將滇重樓與其它種區(qū)別開(kāi)來(lái);鑒于不同種類的重樓在藥用成分甾體皂甙的種類、含量等方面存在顯著的差異［4］，滇重樓及代用品的混用將給中醫(yī)用藥醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)的質(zhì)量控制帶來(lái)了極大的隱患。因此，對(duì)滇重樓及其代用品的鑒定方法和手段進(jìn)行研究，摸索一套在藥材收購(gòu)和生產(chǎn)中行之有效的鑒定方法，對(duì)于醫(yī)藥生產(chǎn)的質(zhì)量控制及保護(hù)重樓屬植物中的珍惜、瀕危種類有著重要的意義。

對(duì)于滇重樓的藥材的鑒定目前主要還是利用傳統(tǒng)的形態(tài)鑒別方式，盡管也有學(xué)者利用滇重樓中皂甙類物質(zhì)進(jìn)行藥材品質(zhì)的判斷依據(jù)，但由于滇重樓的藥理作用并非僅僅由單一成分決定，同時(shí)各品種所含皂甙類化學(xué)成分及含量有較大差別，因此僅用皂甙類物質(zhì)鑒別藥材的品質(zhì)和真?zhèn)我膊痪呖陀^性。分子方面，張金渝等利用RAPD 技術(shù)從植物系統(tǒng)分類的角度對(duì)重樓屬中的4 種植物進(jìn)行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)不同種類指紋圖譜有明顯的差異［5］;何俊等采用ISSR 技術(shù)對(duì)主要分布于云南的滇重樓不同居群進(jìn)行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)不同居群的指紋圖譜也有明顯的差異，認(rèn)為遺傳多樣性主要存在于居群間［6］;但由于有限的采樣數(shù)量和所采用分子標(biāo)記的低分辨率，加之上述作者并未從分子鑒定的角度對(duì)滇重樓進(jìn)行研究，因此重樓屬不同種類和居群的遺傳多樣性和分子鑒定還有待進(jìn)一步的研究。

DNA 條形碼(DNA barcoding)技術(shù)以穩(wěn)定的基因組信息為依據(jù)，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)物種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)化［7，8］。但到目前為止，還沒(méi)有應(yīng)用DNA Barcoding技術(shù)對(duì)滇重樓進(jìn)行分子鑒別，更沒(méi)有滇重樓的專用條形碼的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用DNA Barcoding 技術(shù)對(duì)重樓屬下滇重樓進(jìn)行分子鑒定。為重樓藥材的快速準(zhǔn)確鑒定提供保障，也為臨床用藥安全奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用材料共12 個(gè)物種35 個(gè)樣品，包括試驗(yàn)樣品及GenBank 下載序列。其中，滇重樓藥材樣品24 個(gè)(來(lái)自不同局群)，其余重樓種類樣品各1個(gè)。所有材料經(jīng)云南農(nóng)業(yè)大學(xué)何忠俊教授鑒定，憑證樣品保存于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院。實(shí)驗(yàn)材料及序列的GenBank 登錄號(hào)見(jiàn)表1。

表1 本實(shí)驗(yàn)中所采集的滇重樓樣本信息Table 1 Origins of P.polyphylla samples used in this study

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣本DNA 的提取

硅膠干燥樣品各0.5 g，液氮研磨，用植物基因組DNA 提取試劑盒(DNeasy Plant Mini Kit，QIAGEN)提取基因組DNA。

2.2 PCR 擴(kuò)增及測(cè)序

引物為psbA/trnH 引物，引物psbA 的堿基序列:GTTATGCATGAACGTAATGCTC，下游引物trnH的堿基序列:CGCGCATGGTGGATTCACAAATC;樣本DNA 加入psbA/trnH 引物進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)熱循環(huán)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min;然后進(jìn)入循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94 ℃變性30sec，54 ℃退火30 sec，72 ℃延伸90 sec，共30 個(gè)熱循環(huán)，最后延伸72 ℃延伸7min;4 ℃冷卻后取出;擴(kuò)增反應(yīng)在PCR 儀上進(jìn)行。PCR 反應(yīng)體系(25 μL):ddH2O 17.8 μL，10 × PCR buffer(Mg+2+Plus)2.5 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)1.5 μL，Tag 酶(5 u/μL)0.2 μL，正向引物(10μmol/L)1 μL，反向引物(10 μmol/L)1 μL，模板DNA(50 ng/μL)1.0 μL。將擴(kuò)增成功的PCR 產(chǎn)物(出現(xiàn)明顯PCR 條帶)進(jìn)行純化后(采用上海生工核酸凝膠純化試劑盒)，送上海生工測(cè)序中心使用ABI3730XL測(cè)序儀(Applied Biosystems Co.，USA)雙向測(cè)序。RNA 酶、dNTP、PCR reaction buffer，均購(gòu)自寶生生物公司。

2.3 數(shù)據(jù)處理和分析

測(cè)序峰圖采用序列拼接軟件Codoncode Aligner v2.06(CodonCode Co，USA)校對(duì)拼接，去除低質(zhì)量序列及引物區(qū)，利用ClustalX v2.0 進(jìn)行多序列比對(duì)并查錯(cuò)。利用軟件MEGA5.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)分析比對(duì)［9］，并基于Kimura 2-parameter(K2P)模型進(jìn)行種內(nèi)種間遺傳距離分析，用鄰接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹(shù)。利用BLAST 比對(duì)和NJ 樹(shù)對(duì)滇重樓及其同屬近緣種進(jìn)行鑒定分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 基因組DNA 提取及PCR 擴(kuò)增

提取的重樓樣品基因組DNA 電泳檢測(cè)顯示條帶主帶明顯，邊緣有彌散狀出現(xiàn)，說(shuō)明DNA 有少部分降解。NanoDrop 檢測(cè)結(jié)果表明所提取基因組DNA 的A260/A280 值均處于1.6～1.8 間，且DNA濃度均較高(＞100 ng/μL)，說(shuō)明樣品污染小，可作為PCR 反應(yīng)模版擴(kuò)增。經(jīng)PCR 反應(yīng)，所有樣品的均顯示較亮條帶，可用于測(cè)序分析。PCR 擴(kuò)增效率和測(cè)序成功率是評(píng)價(jià)DNA 條形碼序列的一個(gè)重要指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)表明，psbA-trnH 片段在重樓屬植物中擴(kuò)增非常容易，測(cè)序成功率高，適合做為重樓屬植物的條形碼序列。

3.2 滇重樓及其它種重樓psbA-trnH 序列分析

本研究中重樓藥材的psbA-trnH 序列分析表明，基于K2P 模型的遺傳距離分析，滇重樓種內(nèi)變異較小，其K2P 遺傳距離為0～0.018，平均K2P 遺傳距離為0.007，不同重樓種間變異較大，平均K2P 遺傳距離為0.025，滇重樓與其它種最小種間K2P 遺傳距離為0.040。種間最小遺傳距離明顯大于滇重樓的種內(nèi)最大遺傳距離。利用中藥材DNA 條形碼鑒定系統(tǒng)對(duì)滇重樓及其它重樓的序列進(jìn)行比對(duì)，顯示所有地區(qū)的滇重樓在位點(diǎn)1-4 上的堿基都為CTGA，而其余重樓為AGAC;所有地區(qū)的滇重樓在位點(diǎn)19上的堿基缺失，而其余重樓為A;所有地區(qū)的滇重樓在位點(diǎn)77 上的堿基都為C，而其余重樓為T;所有地區(qū)的滇重樓在位點(diǎn)138 上的堿基都為C，而其余重樓為T;所有地區(qū)的滇重樓在位點(diǎn)792 上的堿基都為G，而其余重樓為T 或C;所有地區(qū)的滇重樓在位點(diǎn)1110-1113 上的堿基都為GGCG，而其余重樓為TCGA;所有地區(qū)的滇重樓在位點(diǎn)1116 上的堿基都為G，而其余重樓為T;所有地區(qū)的滇重樓在位點(diǎn)1119-1120 上的堿基都為CC，而其余重樓為TA、TG或GA。詳細(xì)情況見(jiàn)表2。通過(guò)這些滇重樓的DNA條形碼可以非常容易的對(duì)滇重樓進(jìn)行鑒定。

表2 實(shí)驗(yàn)樣本的psbA-trnH 片段信息位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)情況Table 2 The informative sites statistics of psbA-trnH fragment in this experiment

基于psbA-trnH 序列構(gòu)建的NJ 系統(tǒng)聚類樹(shù)見(jiàn)圖1，結(jié)果顯示，滇重樓單獨(dú)聚為一支，其近緣種聚為一支，表現(xiàn)出良好的單系性。因此，psbA-trnH 序列作為條形碼可快速準(zhǔn)確鑒別滇重樓及其它重樓。理想的DNA 條形碼序列應(yīng)當(dāng)具有明顯的種間變異，同時(shí)種內(nèi)變異足夠小。實(shí)驗(yàn)表明，psbA-trnH 片段在滇重樓種內(nèi)變異幅度在0.0%～1.8%之間，而種間變異程度在4.0%～6.2%之間，因此該序列適合做為重樓屬植物的條形碼序列，且很容易將不同種重樓鑒別開(kāi)來(lái)。

4 討論

圖1 基于psbA-trnH 序列構(gòu)建的NJ 樹(shù)Fig.1 NJ tree based on psbA-trnH sequences

近年來(lái)，由于DNA 分子標(biāo)記技術(shù)在植物學(xué)中的廣泛應(yīng)用，使藥用植物的鑒別工作也取得了空前的發(fā)展。傳統(tǒng)的鑒定手段人為干擾因素較多，而DNA分子標(biāo)記在中藥鑒別中不受生長(zhǎng)發(fā)育階段、供試部位、環(huán)境條件的影響，能從分子水平上客觀地反映待測(cè)材料之間的差異，特別適合藥材近緣品種和道地藥材的鑒定。從國(guó)內(nèi)外研究狀況來(lái)看，由于DNA 分子標(biāo)記技術(shù)能客觀反映物種間親源關(guān)系和遺傳多樣性，近年來(lái)，不少學(xué)者都已成功嘗試把它們用于藥用植物的鑒定。但這些分子標(biāo)記技術(shù)往往表現(xiàn)出通用性低，可重復(fù)性不強(qiáng)的特點(diǎn)［10］。與其他分子鑒定方法相比，DNA 條形碼技術(shù)可使鑒定過(guò)程更加趨于標(biāo)準(zhǔn)化，在中藥鑒定領(lǐng)域中展示了廣闊的應(yīng)用前景［8］。

滇重樓是我國(guó)重要的民族中藥，因同屬重樓在形態(tài)上難以區(qū)分，使得在藥材的收購(gòu)及工廠化生產(chǎn)中無(wú)法將滇重樓與其它種區(qū)別開(kāi)來(lái)，給中醫(yī)用藥醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)的質(zhì)量控制帶來(lái)了極大的隱患。為了確保臨床用藥安全，本研究采用DNA 條形碼技術(shù)對(duì)中藥材滇重樓及同屬其他種進(jìn)行鑒定研究。結(jié)果表明psbA-trnH 條形碼序列可有效鑒別滇重樓藥材，為滇重樓藥材鑒定的標(biāo)準(zhǔn)化奠定了基礎(chǔ)，具有重要的應(yīng)用和參考價(jià)值。

本研究為排除滇重樓不同產(chǎn)地個(gè)體間存在的變異信息，找到滇重樓特有的區(qū)別與其它重樓的信息位點(diǎn)，便從取樣策略上，廣泛采集了滇重樓所分布的區(qū)域，以此來(lái)確保滇重樓條形碼的準(zhǔn)確性。通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，葉綠體上的psbA-trnH 片段在滇重樓種內(nèi)變異很小，即不同產(chǎn)地間個(gè)體的序列相似性達(dá)到(98.2%～100%)，說(shuō)明該片段在滇重樓種內(nèi)的信息位點(diǎn)很穩(wěn)定;而種間比較發(fā)現(xiàn)，滇重樓與重樓屬下的其它重樓種間的序列相似性低于96%，即該片段在種間變異幅度較大，可以輕易地將不同種重樓區(qū)分開(kāi)來(lái)。因此僅從序列的相似性程度就可以將滇重樓與其它重樓種區(qū)分開(kāi)來(lái)。

為了找到滇重樓特有的DNA 條形碼，發(fā)明人通過(guò)序列比對(duì)分析，找出了滇重樓內(nèi)部穩(wěn)定的信息位點(diǎn)，而這些位點(diǎn)恰恰區(qū)別于重樓屬下的其它重樓植物，詳細(xì)信息見(jiàn)表2。通過(guò)這些特有的信息位點(diǎn)，可以輕易的將滇重樓植物與重樓屬下的其他重樓植物鑒別開(kāi)來(lái)。另外，psbA-trnH 片段序列兩端的序列都很保守，便于通用引物的設(shè)計(jì)，十分適合做滇重樓的DNA 條形碼，該條形碼的發(fā)現(xiàn)對(duì)于滇重樓道地藥材的保護(hù)利用具有十分重要的作用。

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