雪松松針總黃酮醇提工藝優化

冉維廣+薛長暉+姚文紅

摘要：利用乙醇浸提法提取雪松松針中的黃酮類化合物，以蘆丁為對照品，采用NaAc-AlCl3比色法考察總黃酮提取率，通過單因素試驗和正交試驗對提取工藝進行優化。結果表明，該方法的最佳提取工藝為：以1 g松針為原料，按照1∶45的料液比加入50%乙醇作為提取劑，于75℃恒溫回流提取2 h。最佳工藝條件下雪松松針的總黃酮提取率為3.64%，RSD為4.04%。該方法穩定可靠，工藝合理可行。

關鍵詞：雪松松針；總黃酮；分光光度法；工藝優化

中圖分類號：S789.4文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）09-0120-04

松針富含多種營養成分[1]，具有解毒、提高人體免疫力等作用，在醫藥、衛生保健等方面存在巨大的開發利用價值[2，3]。目前，對雪松松針的研究主要集中在對其揮發油類、黃酮類成分的分析上[4]，缺乏對其提取工藝的系統研究。本試驗著重對雪松松針中總黃酮的最佳提取工藝進行研究，以期為雪松松針總黃酮的大規模提取及其產品的深加工提供可行性依據。

1材料與方法

1.1材料與儀器

雪松松針，采自青島農業大學；蘆丁標準品，上海鼎杰生物科技有限公司；無水乙醇、結晶三氯化鋁、乙酸鈉、60～90℃石油醚等，均為分析純。

UV-1601型紫外分光光度計，日本島津公司；AR1140電子天平，上海奧斯豪國際工貿公司；KDM電子調溫電熱套，龍口市先科儀器公司；雙列六孔電熱恒溫水浴鍋，龍口市先科儀器公司；C30孔玻璃儀器氣流烘干器， 鄭州長城科工貿有限公司；SHB-B88循環水式真空泵，鄭州長城科工貿有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1松針樣品的前處理由于葉綠素等油溶性雜質易溶于石油醚[5]，而黃酮不溶于石油醚[6]，因此本試驗采用石油醚浸提法對松針樣品進行前處理，以除去葉綠素等油溶性雜質。

1.2.2提取工藝最優參數的確定以總黃酮提取率為評價指標，采用單因素試驗，依次對乙醇濃度、提取溫度、提取時間、料液比進行試驗，以確定各因素最優值。在此基礎上，采用四因素三水平正交試驗進行進一步的工藝優化。

1.2.3總黃酮提取率的測定①標準曲線制作：天然產物中總黃酮含量的測定通常是以蘆丁為標準品通過紫外可見分光光度法進行的[7]。本試驗以蘆丁為標準品，繪制標準曲線。方法為：準確移取0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、5.00 mL蘆丁標準品溶液于25 mL容量瓶，加入70%乙醇10.00 mL稀釋，準確移入0.1 mol/L AlCl3 溶液2.00 mL、1.00 mol/L NaAc溶液3.00 mL，用70%乙醇定容至刻度搖勻，顯色25 min，于282 nm波長下測定其吸光度，以標準品濃度（C）對吸光度（A）進行線性回歸，所得標準曲線方程為：A=0.0068+28.66724×C，R=0.9998，線性關系良好（見圖1）。

②松針樣品總黃酮的測定：準確稱取1 g松針待測樣于250 mL燒瓶中，回流提取，冷卻30 min，過濾，濾液定容至100 mL容量瓶。按照上述方法測定吸光度，根據公式求得總黃酮提取率。

2結果與分析

2.1松針樣品前處理效果

由圖2可以看出，經石油醚浸提后的吸收曲線（B）更加平緩，雜質峰明顯減少，低波長處吸收峰的覆蓋率降低，282 nm處出現了新的吸收峰，

峰型平緩，表明石油醚浸提除雜效果顯著。

2.2單因素試驗結果與分析

2.2.1乙醇濃度對總黃酮提取率的影響控制體系溫度為75℃、料液比為1∶35、提取時間為3 h，設置不同的乙醇濃度對雪松松針中總黃酮進行提取，結果（圖3）顯示，隨著乙醇濃度的增大，提取率先升高后降低，乙醇濃度為50%時提取率最高。因此，選取乙醇濃度40%、50%、60%三水平進行正交試驗。

2.2.2浸提溫度對總黃酮提取率的影響控制料液比為1∶35、提取時間3 h、乙醇濃度70%，設置不同的體系溫度回流提取雪松松針中的總黃酮，結果（圖4）表明，隨著溫度的升高，提取率逐漸升高至85℃時提取率最高，后略有降低。天然產物的提取過程中，溫度對提取效果的影響較為復雜。松針中含有較多種類的活性物質，在不同溫度下，會發生一些化學反應而降低黃酮含量[8]。較高的溫度不但容易導致部分黃酮的分解[9]，而且不符合低能耗的原則，因此，選擇 65、75、85℃為正交試驗提取溫度的三個水平。

2.2.3料液比對總黃酮提取率的影響控制體系溫度為75℃、提取時間為3 h、乙醇濃度為70%，設置不同的料液比回流提取雪松松針中的總黃酮，結果（圖5）表明，料液比為1∶45時總黃酮提取率最高。因此，選取1∶25、1∶35、1∶45為正交試驗料液比的三個水平。

2.2.4提取時間對提取率的影響控制體系溫度為75℃、乙醇濃度為70%、料液比為1∶35，改變松針中總黃酮的浸提時間，結果（圖6）表明，回流提取時間為3 h時，黃酮提取率最高。因此，選取2、3、4 h為正交試驗提取時間的三個水平。

2.3正交試驗結果與分析

在單因素試驗的基礎上，進行四因素三水平正交試驗，研究浸提溫度、提取時間、料液比和乙醇濃度對雪松松針中總黃酮提取率的影響，結果（表1）顯示，各因素對總黃酮提取率的影響順序是：浸提溫度>料液比>乙醇濃度>提取時間；各因素最優組合為：浸提溫度75℃，料液比1∶45，乙醇濃度50%，提取時間3～4 h。因提取時間對總黃酮提取率的影響最小，且提取時間過長不僅會影響黃酮的穩定性，還會降低其提取效率，為節能降耗、提高效率，最終確定提取時間為2 h。

綜上所述，雪松松針中總黃酮提取的最佳工藝條件為：浸提溫度75℃，料液比1∶45，乙醇濃度50%，提取時間2 h。endprint

2.4驗證試驗

準確稱取1 g松針待測樣，置于250 mL燒瓶中，加入50%的乙醇45 mL，于75℃恒溫水浴回流提取2 h，冷卻30 min后過濾至100 mL容量瓶中，定容，得待測液。取2.00 mL待測液于25 mL容量瓶中，加入70 %的乙醇10.00 mL稀釋，準確移入0.1 mol/L AlCl3 溶液2.00 mL、1.00 mol/L NaAc溶液3.00 mL，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，顯色25 min，于282 nm波長下測定吸光度，計算總黃酮提取率。結果（表2） 表明，平均提取率為3.64%。雖與提取3～4 h相比，總黃酮提取率有所降低，但縮短了提取時間，提高了提取效率，降低了能耗，優化后的工藝條件有效可行。

3小結

本試驗采用紫外分光光度法，以蘆丁為標準品，以乙醇水溶液為提取劑，采用溶劑回流浸提法提取雪松松針中的總黃酮，并通過AlCl3-NaAc顯色體系，在282 nm波長下測定總黃酮提取率。通過單因素試驗和正交試驗，確定了最佳提取工藝為：1 g雪松松針待測樣，按照1∶45的料液比，加入50%乙醇為提取劑，保持溫度為75℃回流提取2 h，所得總黃酮提取率為3.64%，RSD 4.04%。該提取工藝方法簡單可行，效果穩定可靠。

參考文獻：

[1]Liu D Y， Shi X F，Wang D D，et al. A new flavonoid in pine needles of Cedrus deodara[J]. Chinese Herbal Medicines， 2011， 3 （1）： 5-6.

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[9]李倩，鐘玲，池汝安，等. 離子液體微波輔助提取葛根總黃酮[J]. 武漢工程大學學報， 2011， 33 （11）：31-34.endprint

2.4驗證試驗

準確稱取1 g松針待測樣，置于250 mL燒瓶中，加入50%的乙醇45 mL，于75℃恒溫水浴回流提取2 h，冷卻30 min后過濾至100 mL容量瓶中，定容，得待測液。取2.00 mL待測液于25 mL容量瓶中，加入70 %的乙醇10.00 mL稀釋，準確移入0.1 mol/L AlCl3 溶液2.00 mL、1.00 mol/L NaAc溶液3.00 mL，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，顯色25 min，于282 nm波長下測定吸光度，計算總黃酮提取率。結果（表2） 表明，平均提取率為3.64%。雖與提取3～4 h相比，總黃酮提取率有所降低，但縮短了提取時間，提高了提取效率，降低了能耗，優化后的工藝條件有效可行。

3小結

本試驗采用紫外分光光度法，以蘆丁為標準品，以乙醇水溶液為提取劑，采用溶劑回流浸提法提取雪松松針中的總黃酮，并通過AlCl3-NaAc顯色體系，在282 nm波長下測定總黃酮提取率。通過單因素試驗和正交試驗，確定了最佳提取工藝為：1 g雪松松針待測樣，按照1∶45的料液比，加入50%乙醇為提取劑，保持溫度為75℃回流提取2 h，所得總黃酮提取率為3.64%，RSD 4.04%。該提取工藝方法簡單可行，效果穩定可靠。

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2.4驗證試驗

準確稱取1 g松針待測樣，置于250 mL燒瓶中，加入50%的乙醇45 mL，于75℃恒溫水浴回流提取2 h，冷卻30 min后過濾至100 mL容量瓶中，定容，得待測液。取2.00 mL待測液于25 mL容量瓶中，加入70 %的乙醇10.00 mL稀釋，準確移入0.1 mol/L AlCl3 溶液2.00 mL、1.00 mol/L NaAc溶液3.00 mL，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，顯色25 min，于282 nm波長下測定吸光度，計算總黃酮提取率。結果（表2） 表明，平均提取率為3.64%。雖與提取3～4 h相比，總黃酮提取率有所降低，但縮短了提取時間，提高了提取效率，降低了能耗，優化后的工藝條件有效可行。

3小結

本試驗采用紫外分光光度法，以蘆丁為標準品，以乙醇水溶液為提取劑，采用溶劑回流浸提法提取雪松松針中的總黃酮，并通過AlCl3-NaAc顯色體系，在282 nm波長下測定總黃酮提取率。通過單因素試驗和正交試驗，確定了最佳提取工藝為：1 g雪松松針待測樣，按照1∶45的料液比，加入50%乙醇為提取劑，保持溫度為75℃回流提取2 h，所得總黃酮提取率為3.64%，RSD 4.04%。該提取工藝方法簡單可行，效果穩定可靠。

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