洋蔥Ms位點多重PCR標記的開發與優化

王振寶+霍雨猛+劉冰江+繆軍+楊妍妍+高莉敏+孔素萍+程斐+陳寧+吳雄

摘要：以本課題組已獲得的洋蔥Ms位點側翼序列為基礎，設計、篩選引物獲得了一個兼容的多重PCR分子標記，并對其反應體系和反應程序進行了優化。優化后的擴增體系：10×PCR buffer （Mg2+ free） 2.5 μL、25 mmol/L MgCl2 4 μL、2.5 mmol/L dNTP 6 μL、DNA模板1 μL （約50 ng）、10 μmol/L引物各1 μL、5 U/μL rTaq聚合酶0.6 μL、用滅菌雙蒸水補齊至25 μL；反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，65.4℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個循環；最后72℃延伸10 min。優化后的體系和程序可以檢測到清晰的目的條帶，通過一次PCR反應即可鑒定Ms位點的3種基因型（MsMs、Msms、msms），操作簡單，穩定性好。

關鍵詞：洋蔥；雄性不育；Ms位點；多重PCR標記

中圖分類號：S633.203.6文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）09-0007-05

洋蔥（Allium cepa L.）為兩年生二倍體（2n=2x=16）蔬菜植物，廣泛種植于世界各地。于近代傳入我國，適應性強，耐貯藏和運輸，具有廣泛的生物活性和重要的藥用價值[1]，發展迅速。

洋蔥是世界上最早利用雄性不育選育雜交種的蔬菜作物之一，其雄性不育根據細胞質的類型可分為S型和T型。在S型雄性不育系統中，不育性是由單個核基因和細胞質基因共同控制，并且不育性狀可被顯性核基因（Ms）恢復。在洋蔥細胞質育性鑒定上，國內外多個研究團隊已成功開發出了幾種鑒定細胞質類型的分子標記[2～6]，這些分子標記能夠使育種者在幾小時內鑒定洋蔥細胞質的類型，不需要進行4～8年的測交驗證。在洋蔥育性恢復基因研究上，由于洋蔥基因組DNA巨大（17.9 pg，15 290 Mbp/C）[7]，是玉米基因組的6倍、番茄的16倍、擬南芥的107倍[8]，國內外研究進展緩慢，所開發的分子標記均具有各自的優缺點[9～12]，很難應用于多樣性遺傳背景親本材料基因型的鑒定，也無法滿足育種過程高通量篩選的需要。

山東省農業科學院蔬菜花卉研究所蔥姜蒜研究中心于2013年開發了兩個分別與顯性Ms和隱性ms等位基因共分離的SCAR標記，分別為DNF-566和RNS-357[13]。這兩個標記已通過2個BC1群體、29個育種系和7個雜交種的驗證，所鑒定的基因型與表型完全一致。但這兩個標記需要兩次PCR檢測，才可確定Ms位點的基因型。

本試驗在前期研究的基礎上[13]，擬篩選出洋蔥Ms位點兼容的多重PCR分子標記，然后進行擴增體系和程序的優化，開發通過一次PCR試驗即可鑒定洋蔥Ms位點基因型（MsMs、Msms、msms）的PCR檢測系統，進而用于洋蔥雄性不育系及保持系的選育，加速洋蔥育種系及雜交種選育進程，提高選育效率。

1材料與方法

1.1供試材料

洋蔥新鮮葉片采自山東省農業科學院蔬菜花卉研究所試驗基地，取樣后迅速放入液氮中冷凍，于-80℃保存備用。驗證標記所用群體為回交群體[118 ×（118×12-12）]，118為雄性不育系，12-12為對應恢復系。

1.2基因組總DNA的提取

洋蔥基因組總DNA的提取采用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒（天根生物，北京），方法參照操作說明書。

1.3引物設計

本研究所用引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。UM1、DM1、UM2、DM2為根據Ms側翼序列設計的引物，Um1、Dm1、Um2、Dm2為根據ms側翼序列設計的引物（表1）。設計引物時確保引物的3′端為多態性位點。

1.4引物組合

顯性Ms位點側翼序列2對引物（UM1、DM1和UM2、DM2）與隱性ms位點側翼序列2對引物（Um1、Dm1和Um2、Dm2）分別組合（表2），先在標準體系下對MsMs、Msms、msms 3種基因型單株進行PCR擴增，選擇能擴增出目的單倍型的引物組合進行反應體系的優化。

1.5試驗設計

1.5.1標準的PCR體系及程序PCR反應總體積為25 μL，其中基因組DNA 1 μL（約50 ng），10×PCR buffer（Mg2+ free）2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 1.5 μL（終濃度為1.5 mmol/L），2.5 mmol/L dNTP 3 μL（終濃度為0.3 mmol/L），4條10 μmol/L引物均為1 μL（終濃度為0.4 μmol/L），5 U/μL rTaq 0.2 μL（終用量為1 U），用滅菌雙蒸水補齊至25 μL。擴增程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個循環；最后72℃保溫10 min，4℃保存。PCR擴增產物經1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統上拍照記錄。

1.5.2多重PCR反應體系及程序的優化在標準反應體系及程序的基礎上，先后對Mg2+濃度、dNTP濃度及凍融次數、最佳退火溫度、DNA聚合酶及模板DNA的用量進行了優化。

2結果與分析

2.1不同引物組合的篩選

兩對顯性Ms等位基因特異性引物與兩對隱性ms等位基因特異性引物分別組合，共獲得4個組合（表2）。4個引物組合在標準體系下，擴增MsMs、Msms、msms 3種基因型的洋蔥，結果（圖1）表明，只有引物UM2、DM2與Um2、Dm2的組合（即多重PCR標記MK4）在3種不同基因型材料中都擴增出了特征帶（Ms：905 bp，ms：661 bp），MK1和MK2幾乎沒有Ms的特征條帶，MK3在Msms基因型材料中Ms特征條帶擴增效率低。因此，選擇MK4進行PCR反應體系的優化。endprint

2.2Mg2+濃度對PCR擴增結果的影響

Mg2+是Taq酶活性所必需的，濃度過低時，Taq酶活性顯著下降，無特異條帶或特異條帶擴增不明顯，濃度升高時，Taq酶活性增強，擴增效率提高。隨著Mg2+濃度的增加，在接近一定數值時，由于出現高鹽抑制現象，擴增條帶亮度減弱。本研究設計了8個Mg2+終濃度梯度，分別為1、2、3、4、5、6、7、8 mmol/L，由圖2可以看出，Mg2+濃度在3～6 mmol/L時，擴增的目的條帶均較清晰，因此后續試驗采用4 mmol/L MgCl2。

2.3dNTP濃度及凍融次數對PCR擴增結果的影響

dNTP是PCR擴增反應的原料，其濃度是影響PCR擴增結果的重要因素，并且其凍融次數對多重PCR的擴增有較明顯的影響。在優化得到4 mmol/L Mg2+濃度下，設置兩個dNTP終濃度（0.3、0.6 mmol/L），同時對dNTP母液的凍融次數進行檢測。結果（圖3）表明，在1～2次凍融次數（1T～2T）下，均可檢測到清晰明亮的擴增產物，隨著凍融次數的增加（3～4次，3T～4T），擴增效率逐漸降低。在較低的dNTP濃度下，這種現象更加明顯。高濃度的dNTP在一定程度上可以彌補因凍融次數增加而造成的PCR擴增效率降低的現象。為確保檢測體系的穩定性，選用0.6 mmol/L dNTP用于后續試驗。

2.4退火溫度對多重PCR擴增結果的影響

退火溫度是影響PCR反應的重要條件之一，同時它也具有相對的靈活性。在優化得到的4 mmol/L Mg2+和0.6 mmol/L dNTP濃度條件下，對PCR擴增反應的退火溫度進行優化，在55℃到68℃之間共設了8個溫度梯度。結果（圖4）表明，較低的退火溫度不會影響PCR反應，當溫度超過65.4℃，隱性ms等位基因擴增效率逐漸降低，當溫度達到68.0℃時，無擴增，而顯性Ms等位基因仍存在有效擴增。為確保顯性和隱性等位基因都能夠產生高特異性的有效擴增，退火溫度選擇65.4℃。

2.5DNA聚合酶的量對PCR擴增結果的影響

在上述優化結果的基礎上進行rTaq DNA聚合酶加入量的優化，共設置了8個rTaq梯度，分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 U。結果表明，在設定的范圍內，均可以擴增出目的條帶，隨著rTaq DNA聚合酶加入量的增加，PCR擴增效率逐漸增強（圖5）。為了兼顧擴增結果的準確性和試驗成本，選擇3.0 U rTaq聚合酶進行后續試驗。

2.6模板DNA的加入量對PCR結果的影響

對于一個穩定的PCR擴增體系，DNA模板的濃度在一定范圍內并不是影響擴增條帶強弱的主要因素，因此本研究在1 μL DNA模板（約50 ng）濃度下，先確定主要影響因素，然后設計了7個模板梯度，分別為：0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μL，同時以水為陰性對照（CK）。結果表明，模板濃度較低時，擴增效率較低，隨著模板濃度的增加，擴增效率越來越高，在設定的模板濃度梯度范圍內，未對PCR反應造成抑制（圖6）。因此，選擇1.0 μL模板DNA加入量進行PCR擴增。

2.7優化后的體系和程序

通過對擴增體系及反應程序的優化建立了顯性Ms和隱性ms等位基因的多重PCR分子標記（MK4）檢測系統。25 μL PCR擴增體系包括2.5 μL 10×PCR buffer（Mg2+ free），4 μL 25 mmol/L的MgCl2 （終濃度為4 mmol/L）、6 μL 2.5 mmol/L的dNTP（終濃度為0.6 mmol/L）、DNA模板1 μL （約50 ng）、10 μmol/L的引物各1 μL（終濃度為0.4 μmol/L）、5 U/μL rTaq聚合酶0.6 μL（終用量為3 U），用滅菌雙蒸水補齊至25 μL，退火溫度為65.4℃，35個循環。對MsMs、Msms、msms 3種基因型洋蔥育種系進行擴增（圖7），結果表明，3種基因型的材料，均得到了清晰可見的目的條帶，擴增結果與基因型完全相符。

為了驗證開發優化的MK4標記，對239株BC1分離群體進行單株檢測。結果表明，所有的可育單株均可擴增出905、661 bp兩條帶，而所有不育單株均只擴增出661 bp條帶（圖8），標記檢測結果與表型完全相符。因此，確定開發的MK4標記能夠用于田間材料的鑒定。

3結論與討論

本研究通過引物篩選、體系和程序優化獲得了一個可同時檢測顯性Ms和隱性ms等位基因的多重PCR分子標記MK4（UM2、DM2、Um2、Dm2）；PCR擴增體系為10×PCR buffer（Mg2+ free）2.5 μL，25 mmol/L的MgCl2 4 μL、2.5 mmol/L的dNTP 6 μL、模板DNA 1 μL（約50 ng）、10 μmol/L引物各1 μL、5 U/μL rTaq聚合酶0.6 μL，用滅菌雙蒸水補齊至25 μL；擴增程序為94℃預變性5 min；94℃變性30 s，65.4℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個循環；最后72℃延伸10 min。該分子標記系統可以通過一次PCR試驗鑒定3種Ms座位基因型（MsMs、Msms、msms）的洋蔥材料，擴增結果與基因型完全相符。

多重PCR反應體系和程序與普通PCR極為類似，除了考慮各組分間的比例及退火溫度外，還應首先考慮多重PCR引物間的兼容性，引物的兼容性不好，就會造成擴增效率極低甚至無擴增，無法檢出相關的等位基因；第二，應該特別注意dNTP的凍融次數，隨著凍融次數的增加，擴增效率降低，然而高濃度dNTP可以部分抵消因凍融次數造成的擴增效率降低的現象；第三，本研究未對引物濃度進行優化，原因為終濃度為0.4 μmol/L時，兩個等位基因在表觀上的檢測亮度基本相似，未出現擴增嚴重不平衡的現象。但在其它多重PCR的開發和應用中，可以通過調整待檢測位點的引物濃度，調節擴增條帶的亮度，進而達到便于鑒定識別的目的。endprint

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