對苯酚氯仿法和鹽析法提取DNA的歸納

姜海霞

提取生物大分子的基本思路是選用一定的物理或化學(xué)方法分離具有不同理化性質(zhì)的生物大分子。對于DNA的提取而言，就是要利用DNA與RNA、多糖、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物化性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分。苯酚氯仿法和鹽析法是高中生物提取DNA的兩種常規(guī)方法，下面對苯酚氯仿法和鹽析法提取DNA的原理、注意事項(xiàng)、常見問題與對策等進(jìn)行了歸納分析。

1.兩種提取DNA的原理理解

1.1苯酚氯仿法原理

苯酚是蛋白質(zhì)的變性劑，反復(fù)抽提，可使蛋白質(zhì)變性，同時抑制了DNase的降解作用。SDS能將細(xì)胞膜裂解，在EDTA、蛋白酶K的存在下消化蛋白質(zhì)分子，使核蛋白變性降解，從而使DNA從核蛋白中游離出來。蛋白質(zhì)表面帶有親水基團(tuán)，容易進(jìn)行水合作用，使蛋白質(zhì)分子能進(jìn)入到水溶液中形成穩(wěn)定的膠體溶液。當(dāng)有機(jī)溶液存在時，蛋白質(zhì)的這種膠體穩(wěn)定性遭到破壞，變性沉淀。離心后有機(jī)溶劑在試管底層，DNA存在于上層水相中，蛋白質(zhì)則沉淀于兩相之間。

1.2鹽析法原理

DNA在NaCl溶液中的溶解度隨著NaCl的濃度變化而改變：在NaCl溶液濃度低于0.14mol/L時，DNA的溶解度隨NaCl溶液濃度的增加而逐漸降低；在0.14mol/L時，DNA溶解度最小；當(dāng)NaCl溶液濃度繼續(xù)增加時，DNA的溶解度又逐漸增大。利用這一原理，可以使DNA在鹽溶液中溶解或析出。為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)？這是因?yàn)橛酶邼舛鹊柠}溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；而用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。

2.兩種提取DNA的注意事項(xiàng)

兩種提取DNA的大體方法均是：材料準(zhǔn)備→破碎細(xì)胞，釋放內(nèi)容物→核酸分離、純化→沉淀或吸附核酸并去除雜質(zhì)→核酸溶解在適量緩沖液或水中。其中注意的事項(xiàng)歸納如下：

材料準(zhǔn)備：最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融；提取血液基因組DNA時，要選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞）；組織培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成DNA降解；含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集。

細(xì)胞裂解：針對不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀夥绞剑海?）對植物材料采用液氮研磨；（2）對動物組織采用勻漿或液氮研磨；（3）組織培養(yǎng)細(xì)胞時加人蛋白酶K；（4）在細(xì)菌中加入溶菌酶破壁；（5）在酵母菌中加入破壁酶。

核酸分離、純化：采用苯酚氯仿抽提時應(yīng)充分混勻，但動作要輕柔，離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間。針對不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法。（1）蛋白質(zhì)的去除：①酚/氯仿抽提；②使用SDS；③高鹽洗滌；④蛋白酶處理。（2）多糖的去除：①高鹽法，高鹽可溶解多糖；②用多糖水解酶將多糖降解；③在提取緩沖液中加一定量的氯苯，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。（3）多酚的去除：①在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：β-巰基乙醇、半胱氨酸等；②加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP、PEGf聚乙二醇），它們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與DNA的結(jié)合。（4）鹽離子的去除：70%的乙醇洗滌。

核酸沉淀、溶解：當(dāng)沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分。沉淀時加入1/10體積的NaAc，有利于充分沉淀。沉淀后應(yīng)用70%的乙醇洗滌，以除去鹽離子等。若長期儲存DNA建議使用TE緩沖液溶解，TE中的EDTA能螯和Mg²⁺或Mn²⁺離子，抑制DNase。

3.DNA提取常見問題與對策

（1）DNA樣品不純的原因及對策：

①DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)，可采用重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)。

②DNA在溶解前，有酒精殘留，可采用重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)。

③DNA中殘留有金屬離子，可采用增加70%乙醇洗滌的次數(shù)（2～3次）。

（2）DNA降解的原因及對策：

①材料不新鮮或反復(fù)凍融，可采用盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融。

②未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性，可采用液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液；在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時，可增加裂解液中螯合劑的含量。

③提取過程操作過于劇烈，DNA被機(jī)械打斷，細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔。

④外源核酸酶污染，可采用所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌。

⑤反復(fù)凍融，可采用將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融。

（3）DNA提取量少的原因及對策：

①實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少，盡量選用新鮮和幼嫩的材料。

②破壁或裂解不充分，動植物要勻漿研磨充分；酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁；高溫裂解時，時間適當(dāng)延長。

③沉淀不完全，可采用低溫沉淀，延長沉淀時間；加輔助物，促進(jìn)沉淀。

④洗滌時DNA丟失，洗滌時，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒。