基于SPR技術的磺胺二甲氧嘧啶高靈敏檢測

趙 媛， 徐麗廣， 吳曉玲， 劉麗強， 胥傳來

（江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122）

基于SPR技術的磺胺二甲氧嘧啶高靈敏檢測

趙 媛， 徐麗廣， 吳曉玲， 劉麗強， 胥傳來*

（江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122）

磺胺類藥物的過量使用會對人體造成過敏性反應，并可能具有致癌性，而磺胺二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine，SDM）在食品中磺胺類藥物的使用中占有很大的比例，因此基于表面等離子體共振（Surface plasmon resonance，SPR）技術建立了奶粉樣品中SDM的快速、高靈敏檢測方法。通過待測樣品與SPR芯片表面修飾的SDM抗體分子特異性識別引起金膜表面折射率變化，進而導致SPR角的變化以實現檢測。建立SPR響應信號和SDM濃度間的標準曲線，最低檢測限達到0.19 ng/mL，奶粉樣品添加回收率在94.0%～98.3%。和傳統方法相比，SPR技術具有較高的靈敏度、準確性且操作簡便，SPR傳感芯片完整性好且可重復用于實際樣品檢測中。

表面等離子體共振；生物傳感器；共振信號；磺胺二甲氧嘧啶

SDM是一種磺胺類藥，具有較強的抗細菌及原蟲感染的作用，常被用作飼料添加劑及畜禽疾病的治療和預防，同時SDM也具有的一定毒性，引起過敏、造血系統障礙、急性溶血性貧血等[1]，因此磺胺二甲氧嘧啶在肉類、乳類、禽蛋等食品性動物組織中的殘留問題備受關注[2-6]。中國農業部2002年發布的動物性食品中獸藥最高殘留量，嚴格規定了動物性食品中磺胺類藥物最大殘留量為25 ng/mL。目前針對磺胺二甲氧嘧啶大致分為一下幾種，TTC法是中國制定的抗生素殘留量的檢驗標準 （GB5409-85），但耗時長、要求操作人員具有一定的專業知識并且實驗過程中菌液的制備和水浴過程的控制都要求嚴格遵守操作規程，否則易出現假陽性，以致出現檢驗結果的不穩定性[6-7]。高效液相色譜檢測法屬于一種理化檢測方法，檢測程序復雜，費用相對較高，需購買色譜儀等檢測設備，不適合小型檢驗室 使 用[2-5]。 酶 聯 免 疫 法 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一種結合了酶化學反應的敏感性和抗原抗體免疫反應的特異性相結合的方法[8-9]，但操作繁瑣，耗時長，檢測靈敏度不高，有時容易出現假陽性結果[6-7]。

SPR技術利用了金屬薄膜光學耦合產生的物理光學現象，是一種具有高靈敏度的光學分析手段[10-15]。在傳感芯片表面固定一層生物分子識別膜，然后將待測樣品流過芯片表面，若樣品中有能夠與芯片表面的生物分子識別膜相互作用的分子，會引起金膜表面折射率變化，最終導致SPR角變化，通過檢測SPR角度變化，獲得被分析物的濃度、親和力、動力學常數和特異性等信息，SPR檢測器追蹤溶液中分子與芯片表面分子的結合、解離整個過程的變化，目前已廣泛應用于生命科學、食品安全、環境檢測、生物醫學等領域[14，16]。作者基于表面等離子體共振原理建立針對磺胺二甲氧嘧啶的高靈敏檢測。和傳統方法相比[17-18]，SPR技術無需標記步驟、所需樣品量極少、檢測過程簡單，可以實現磺胺二甲氧嘧啶的實時、快速、無損傷檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磺胺二甲氧嘧啶抗體：質量濃度1 mg/mL，作者所在實驗室自制，半抑制率（IC50）為0.8 ng/mL，LOD為0.31 ng/mL；磺胺二甲氧嘧啶：純度大于90%，干粉，購自Sigma（上海）貿易有限公司；碳二亞胺（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀及其他分析試劑：購自阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

梅特勒-托利多分析電子天平：上海儀器有限公司產品；Milli-Q Integral Cabinet 3型超純水制備儀：美國Millipore公司產品；XW-80A旋渦混合器：上海精科實業有限公司產品；可調移液器：美國Eppendorf公司產品。

1.3 芯片表面修飾磺胺二甲氧嘧啶抗體

首先將磺胺二甲氧嘧啶抗體溶解在10 mmol/L pH 5.0的乙酸鈉溶液中，控制其終濃度為0.05 mg/ mL。其次向傳感器內通入pH為7.4 PBS緩沖溶液（包括137 mmol/L氯化鈉，2.7 mmol/L氯化鉀，4.3 mmol/L磷酸氫二鈉，1.4 mmol/L磷酸二氫鉀和1/ 1 000甲醇），控制流量為10 μL/min，觀察基線，待其穩定后加入相同體積的4.2 mg/mL EDC和5.0 mg/mL NHS溶液，反應5～10 min，活化羧基纖維素，從而形成有活性的NHS-纖維素層。第三，通入PBS緩沖溶液進行沖洗，待基線穩定后加入已配制好的磺胺二甲氧嘧啶抗體溶液，抗體上的羧基和纖維素上的氨基形成共價鍵偶聯。隨后，通入1 mol/L的乙醇胺溶液以封閉為參與反應的NHS-纖維素位點。

1.4 基于SPR技術的磺胺二甲氧嘧啶檢測

將磺胺二甲氧嘧啶溶液按照二倍濃度進行梯度稀釋，分散在pH 7.4 PBS緩沖液中，濃度變化包括5、2.5、1.25、0.63、0.32 ng/mL。將不同濃度的磺胺二甲氧嘧啶溶液依次通入SPR儀，優化流入流速和反應結合時間，觀察SPR信號隨時間的變化趨勢。反應結束，用pH 7.4的PBST緩沖液 （包括6.7 mmol/L的磷酸氫二鈉、1.25 mmol/L的磷酸二氫鉀、150 mmol/L的氯化鈉和0.005%的Tween-20）進行洗脫，以去除結合上的磺胺二甲氧嘧啶，便于下一個樣品的測試。

2 結果與分析

2.1 實驗原理

實驗主要原理如圖1所示，基片的表面鍍有一層金膜，構成傳感芯片的核心部分。在金膜表面修飾一種生物分子如磺胺二甲氧嘧啶抗體，當待測溶液流過芯片表面時，待測分子與芯片表面的磺胺二甲氧嘧啶抗體發生結合，導致金膜表面介質折射率的改變，得到不同角度的反射光的光強，其中使反射光完全消失的入射角即為共振角，金膜表面自由電子受入射光激發而產生電子震蕩，入射光的能量被轉移，形成表面等離子體。記錄角度和反射光強之間變化曲線圖，曲線圖中對應波谷處為該曲線的共振角，對應的角度即為共振信號，記錄時間和共振信號間的變化曲線即為SPR傳感曲線，分析不同濃度待測溶液下體系共振信號的變化達到對目標物的檢測。

圖1 基于SPR技術的SDM檢測原理圖Fig.1 Schematic illustration of SPR-based SDM detection

2.2 SPR芯片再生測試

在進行實際樣品測定中，由于要接觸不同濃度的待測樣品，SPR芯片在反復吸附、洗滌等多個循環過程后使得表面偶聯分子失去活性或脫落，因此傳感芯片的完整性和重復性是完成待測樣品高靈敏檢測的關鍵。其中金屬膜的化學穩定性是一個需要考慮的重要因素，和其他金屬膜相比如銀膜或銅膜相比，金膜的穩定性最好，不易被空氣氧化且不易與其他物質發生反應，具有化學惰性，適合長期使用。如圖2所示，結合不同質量濃度的磺胺二甲氧嘧啶（0.32、0.63、1.25、2.50、5.0 ng/mL）后的 SPR芯片，經過多次洗滌和再生之后，測得的響應信號較弱，且彼此間并沒有太大的差別，不存在非特異性吸附和交叉感染，SPR可以實時觀測到分子結合、薄膜形成等表面現象，并能給出高靈敏度、高選擇性同時最小的非特異結合的信號。再生后的芯片中金膜尚且完整，可重復利用。

2.3 基于SPR技術的磺胺二甲氧嘧啶檢測

將不同質量濃度的磺胺二甲氧嘧啶溶液通入芯片表面，待測的磺胺二甲氧嘧啶會與修飾在SPR傳感芯片表面的磺胺二甲氧嘧啶抗體直接發生特異性親和識別反應，待測分子和芯片表面的抗體結合引起金膜和溶液界面折射率的上升，從而導致共振角發生變化，共振角對應的角度為共振信號，從而得到時間與對應共振信號的傳感曲線。如圖3所示，當待測溶液濃度大，結合產物多，引起傳感器的響應大；當待測溶液濃度小，結合產物少，引起傳感器的響應小。因此，待測溶液濃度與傳感器響應信號之間存在正比關系（圖4），當在300 s時，響應信號達到最大，建立樣品濃度和300 s處響應信號間的標準曲線，顯示出較好的線性（R2為0.99），計算出針對磺胺二甲氧嘧啶的LOD為0.19 ng/mL。基于SPR技術的檢測方法比傳統ELISA方法具有更高的靈敏度，且穩定性好，檢測時間短，操作簡單，可以作為ELISA的一種替代技術，應用于待測樣品的測定。

圖2 SPR芯片的再生鑒定Fig.2 Renewable identification of SPR chips

圖3 不同質量濃度SDM隨時間變化的SPR響應信號Fig.3 Time-variant changes of SPR response signal f SDM with different concentrations

圖4 SDM濃度和SPR響應信號的標準曲線Fig.4 Standard curve represented the relationship between SDM concentration and SPR response signal

2.4 添加回收試驗

取已采用理化方法確認為陰性的奶粉樣品1.0 g共4份，充分溶解于1 mL的超純水中，分別添加不同劑量的SDM，使其終質量濃度為0.5、1.0、2.0和4.0 ng/mL。分別加入5 mL乙腈溶液，混合均勻后離心，取上清液真空抽干，分散在1 mL pH 7.4 PBS緩沖液中，加入1 mL正己烷去脂，離心去上層，重復3次，取下層水相用0.22 μm濾膜進行過濾。將不同含有不同濃度SDM的濾液依次通入SPR儀中，記錄不同SDM濃度下SPR響應信號，分析檢測濃度并計算樣品回收率在94.0%～98.3%，結果見表1。

表1 奶粉樣品中SDM添加回收率Table 1 Recovery of SDM spiked in milk powder

3 結語

通過在SPR芯片表面修飾針對磺胺二甲氧嘧啶的抗體，鑒于待測抗原和抗體間的特異性親和原理，采用表面等離子共振技術實現了針對磺胺二甲氧嘧啶濃度的高靈敏檢測，其LOD達到0.19 ng/ mL，奶粉樣品添加回收率在94.0%～98.3%。和傳統ELISA方法相比，表面等離子共振技術操作簡單、樣品用量少、檢測時間快且靈敏度較高，可以沿向小型化、自動化、多樣化和高通量應用目標，推廣到食品安全和環境監測應用中。

[1]徐慧敏，蔡宏文，李天元，等.磺胺類藥物過敏和交叉過敏的研究進展[J].中國藥理學與毒理學雜志，2012，26（6）：897-901. XU Huimin，CAI Hongwen，LI Tianyuan，et al.Progress in sulfonamide hypersensitivity and cross-hypersensitivity[J].Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology，2012，26（6）：897-901.（in Chinese）

[2]ZOU Qionghui，XIE Mengxia，WANG Xiangfeng，et al.Determination of sulphonamides in animal tissues by high performance liquid chromatography with pre-column derivatization of 9-fluorenylmethyl chloroformate[J].Journal of Separation Science，2007，30：2647-2655.

[3]Ibarra I，Miranda J，Rodriguez J，et al.Magnetic solid phase extraction followed by high-performance liquid chromatography for the determination of sulphonamides in milk samples[J].Food Chemistry，2014，157：511-517.

[4]Gamba V，Terzano C，Fioroni L，et al.Development and validation of a confirmatory method for the determination of sulphonamides in milk by liquid chromatography with diode array detection[J].Anal Chim Acta，2009，637：18-23.

[5]Forti A，Scortichini G.Determination of ten sulphonamides in egg by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Anal Chim Acta，2009，637：214-219.

[6]趙旭壯，李明元.動物性食品中磺胺類藥物殘留檢測研究進展[J].中國食品衛生雜志，2012，24（3）：292-296. ZHAO Xuzhuang，LI Mingyuan.Development of sulfonamides residues detection in edible animal products[J].Chinese Journal of Food Hygiene，2012，24（3）：292-296.（in Chinese）

[7]黃華，陳君慧，馮楠，等.動物源性食品中磺胺類藥物殘留前處理和檢測方法研究進展 [J].食品工業科技，2013，34（4）：378-381. HUAG Hua，CHEN Junhui，FENG Nan，et al.Research progress in the pre-processing and detection method of sulfonamides drugs residues in animal derived foods[J].Science and Technology of Food Industry，2013，34（4）：378-381.（in Chinese）

[8]張勛，匡華，徐麗廣，等.綠色無毒黃曲霉毒素B1免疫檢測方法[J].食品與生物技術學報，2013，32（12）：1293-1297. ZHANG Xun，KUANG Hua，XU Liguang，et al.Green and Nontoxic Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Aflatoxin B1 Detection[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2013，32（12）：1293-1297.（in Chinese）

[9]匡華，勇倩倩，劉麗強，等.食品中蘇丹紅I酶聯免疫檢測方法的建立及酶學性質研究[J].食品與生物技術學報，2013，32（10）：1049-1056.KUANG Hua，YONG Qianqian，LIU Liqiang，et al.Establishment of ELISA for Sudan I Residues in Food[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2013，32（10）：1049-1056.（in Chinese）

[10]Valera E，Muriano A，Pividori M，et al.Development of a Coulombimetric immunosensor based on specific antibodies labeled with CdS nanoparticles for sulfonamide antibiotic residues analysis and its application to honey samples[J].Biosensors and Bioelectronics，2013，43，211-217.

[11]王莉，魏萬貴，蔡勤，等.酶聯免疫法檢測動物源性食品中磺胺間二甲氧嘧啶殘留 [J].中華預防醫學雜志，2006，40（3）：196-199. WANG Li，WEI Wangui，CAI Qin，et al.Enzyme linked immunosorbent assay for Sulfadimethoxine residues detection in animal derived food[J].Chinese Journal of Preventive Medicine，2006，40（3）：196-199.（in Chinese）

[12]Ermini M，Mariani S，Scarano S，et al.Bioanalytical approaches for the detection of single nucleotide polymorphisms by Surface Plasmon Resonance biosensors[J].Biosensors and Bioelectronics，2014，61：28-37.

[13]JIANG Zhongxiu，QIN Yun，Peng Zhen，et al.The simultaneous detection of free and total prostate antigen in serum samples with high sensitivity and specificity by using the dual-channel surface plasmon resonance[J].Biosensors and Bioelectronics，2014，62：268-273.

[14]SHI Dachuan，HUANG Junfu，CHUAI Zhengran，et al.Isothermal and rapid detection of pathogenic microorganisms using a nano-rolling circle amplification-surface plasmon resonance biosensor[J].Biosensors and Bioelectronics，2014，62：280-287.

[15]Verma R，Gupta B.Detection of heavy metal ions in contaminated water by surface plasmon resonance based optical fibre sensor using conducting polymer and chitosan[J].Food Chemistry，2015，166：568-575.

[16]肖桂娜，蔡繼業.基于局域表面等離子體共振效應的光學生物傳感器[J].化學進展，2010，22（1）：194-200. XIAO Guina，CAI Jiye.Optical biosensors based on localized surface plasm on resonance effect[J].Progress in Chemistry，2010，22（1）：194-200.（in Chinese）

[17]Wiltschi B，Knoll W，Sinner E.Binding assays with artificial tethered membranes using surface plasmon resonance[J].Methods，2006，39：134-146.（in Chinese）

[18]鄭榮升，魯擁華，林開群，等.表面等離子體共振傳感器研究的新進展[J].量子電子學報，2008，25（6）：657-664. ZHENG Rongsheng，LU Yonghua，LIN Kaiqun，et al.Recent progress of research on surface plasmon resonance sensors[J]. Chinese Journal of Quantum Electrnics，2008，25（6）：657-664.（in Chinese）

High Sensitive Detection of Sulfadimethoxine Based on SPR Technique

ZHAO Yuan， XU Liguang， WU Xiaoling， LIU Liqiang， XU Chuanlai*
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The overdose of sulfa drugs will cause allergic reactions and possibly carcinogenic. Among the all sulfa drugs used in food，sulfadimethoxine（SDM）takes up a large proportion.In this research，a new method based on surface plasmon resonance（SPR）was proposed for the rapid and high sensitive detection of SDM in milk powder.The detection was based on the changes of SPR angles，which was subsequently caused by the changes in the refractive index of gold film induced by the specific recognition of samples by the SDM antibody modified on the surface of SRP chips.A standard curve represented the relationship between SRP response signal and SDM concentration.The limit of detection（LOD）for SDM was as low as 0.19 ng/mL，and the milk powder recovery was in the range of 94.0%～98.3%.Compared with the traditional methods，SPR technique has highsensitivity，high accuracy and easy operation.SPR sensor chips can be repeatedly used for sampledetection in practical application with good integrity.

surface plasmon resonance，biosensor，resonance signal，sulfadimethoxine

TS 207.3

A

1673—1689（2015）07—0699—05

2014-08-25

國家重大科學儀器設備開發專項項目。

趙 媛（1986—），女，江蘇徐州人，工學博士，副教授，主要從事食品安全檢測研究。E-mail：zhaoyuan0731@126.com

*通信作者：胥傳來（1965—），男，江蘇鹽城人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事食品安全研究。E-mail：xcl@jiangnan.edu.cn