低溫馴化速度對鯽魚離水儲藏酶活性的影響

曾 鵬， 申 江， 陳天及

（1.上海海洋大學 食品學院，上海201306；2.天津商業大學 機械工程學院，天津300134）

低溫馴化速度對鯽魚離水儲藏酶活性的影響

曾 鵬1， 申 江*2， 陳天及1

（1.上海海洋大學 食品學院，上海201306；2.天津商業大學 機械工程學院，天津300134）

為研究低溫馴化及儲藏溫度對鯽魚活體離水后儲藏的影響，成年鯽魚(Carassius carassius)放置于水箱中，采用每小時5℃和1℃速率,由25℃勻速降溫降至0℃，分別在4℃和0℃冷庫中離水儲藏24 h，測定鯽魚新陳代謝及抗氧化相關酶的活力，并探討低溫馴化及離水儲藏對魚體生理狀態的影響。結果表明，1℃/h降溫有利于乳酸脫氫酶（LDH）活力的保存。經過1℃/h降溫馴化后，0℃儲藏異檸檬酸脫氫酶活力功能得到了一定保存，腦琥珀酸脫氫酶（SDH）未受影響。丙氨酸氨基轉移酶（ALT）活力體現為受儲藏溫度影響，0℃下其活力得到保存。0℃儲藏導致丙二醛（MDA）的積聚，同時低溫儲藏中血液過氧化氫酶（CAT）集聚而肝臟未表現出明顯變化。

丙二醛；線粒體；低溫馴化；氨基酸

魚體降溫到生理冰溫點附近的溫度，就會處于休眠狀態以延長存活時間，使之可離水儲運的技術稱為魚體冰溫技術。該技術使得低溫馴化增加了生物體的低溫耐受性，并且低溫下其新陳代謝降到最低水平，從而能保持活體的長時間儲藏[1]。

生物對環境的代償作用可以在多種環境改變誘導下發生。例如溫度、壓力、重金屬、缺氧等。通常認為對環境的適應可以為生物體提供有益的代償。其中，對溫度的馴化適應稱為“溫度適應”[2]。在不適合生存的溫度下，變溫生物可以通過溫度適應策略來滿足正常生理功能。極端溫度下生活的魚類及不同季節溫度下魚類酶動力學研究為魚類低溫馴化機理提供了大量資料[3-4]。酶的活性因為有其最適溫度的限制，偏離此最適溫度的生物，其酶功能都會受到不利影響而導致酶功能的下降。具有不同溫度馴化性的魚類，其酶的最適溫度也有變化以適應馴化溫度對酶活性的影響，保證機體正常生理活動[5]。溫度馴化過程通常通過提高代謝酶的活力，即通過改變酶的濃度或者通過酶可替換結構的改變產生不同最適熱性質酶（同工酶），或者改變細胞膜的磷脂組成進而保證酶功能，以應對溫度的改變[6-7]。

溫度馴化可以引發生理代償機制，但是環境的快速變化卻會導致應激反應。在脅迫應激條件下機體代謝會紊亂，從而導致自由基的大量積聚和細胞組分的氧化狀態，而 機體內抗氧化酶通過氧化還原將自由基降解，以維持機體的正常狀態。 抗氧化酶活力的變化可以反映出魚體受到環境影響程度，通常作為機體受脅迫程度的指標。例如，酶活力指標可以在魚體受到嚴重傷害前作為水體污染的指標。這些指標同細胞損傷聯系，可以作為早期檢測標準之一[8]。

鯽魚肉質鮮美，分布廣泛，中國各地常年均有生產，為中國重要食用魚類之一。市場上鯽魚以鮮活品為主，死魚通常不被消費者接受。作者以鯽魚的酶活性為指標，研究離水及低溫狀態的生理狀態，反映活體低溫馴化能力及低溫損傷，為鯽魚的無水保鮮的初步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 低溫馴化及儲藏溫度

成年鯽魚20±2℃采集自天津本地養殖鯽魚，體重189.91±13.65 g。選取5條鯽魚作為對照組。20條成年鯽魚分別放養在2個50 L聚乙烯水箱中，每箱10尾。由室溫18°C采用兩種降溫速率：5℃/h和1℃/h，降溫到0℃，用溫度巡檢儀(MX100,日本恒河產)與HPt熱電阻(精度±0.12℃)監控水體溫度。

溫度降至0℃時，試驗鯽魚分為兩組，各取10尾魚分別放置于4℃和0℃兩座電腦控溫冰溫冷庫中離水儲藏。24 h后復水觀察存活率，并取5條活魚取樣實驗。

1.2 取樣

1.2.1 血樣 心臟靜脈取血，用肝素鈉小管采集樣品，低溫離心20 min（4℃、4 000 r/min），然后-80℃保存待測。

1.2.2 肝臟及腦組織樣品 組織分離后，-80℃冷凍。稱重后按1∶10加入50 mmol/L的磷酸鉀溶液（pH 7.0，包含0.5 mmol/L EDTA）研磨破碎，然后低溫離心20 min（4℃、4 000 r/min），取上清液離心30 min（4℃、12 000 r/min），得上清液（PMS）及沉淀（線粒體）。

1.3 有氧及無氧代謝

1.3.1 肝臟和腦異檸檬酸脫氫酶（IDH） 異檸檬酸脫氫酶活性測定：線粒體原液加入反應體系（EDTA 0.33 nmol/L，二硫蘇糖醇0.1 mmol/L，Tris-HCl 33 mmol/L，pH 7.0，MgSO41.4 mmol/L，NADP 0.1 mmol/L，異檸檬酸1.5 mmol/L），記錄30℃、340 nm吸光值每分鐘的變化[9]。

1.3.2 琥珀酸脫氫酶（SDH）酶活性的測定 pH 7.2的磷酸鹽緩沖液 （K3PO4·3H2O 35 mmol/L，MgCl 25 mmol/L，NaN32 mmol/L）2.7 mL，線粒體蛋白 0.1 mL，25 mmol/L K3Fe（C N）660 μL，25 mmol/L琥珀酸鈉60 μL，注在冰浴中加各試劑和樣品，將各管內體積用磷酸鹽緩沖液擴充至3 mL后，420 nmol/L比色，讀取初值，30℃水浴30 min，取出放入冰浴以終止反應，比色，讀取終值。

1.3.3 肝臟乳酸脫氫酶（LDH）酶活性的測定 反應速率以NADH氧化導致340 nm吸光值的減少確定。反應體系包括0.1 mL、6.6 mmol/L NADH，0.1 mL、30 mmol/L丙酮酸鈉，2.8 mL、0.2 mol/L Tris-HCl buffer（pH 7.3）；加入0.1 mL肝臟組織PMS樣品，記錄25℃下的ΔA340/min[10]。

1.4 氨基酸代謝

1.4.1 腦谷氨酸脫氫酶（GDH）酶活性的測定 反應速率以NADH氧化導致340 nm吸光值的減少確定。0.125 mmol/L NADH加入1 mL反應混合物（包含 50 μL PMS，200 mmol/L NH4Cl，30 mmol/L α-KGA溶于100 mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH 8.0），記錄A340nm的減少。1單位NAD-GD定義為氧化1 nmol NADH/（min·mg）需要的酶量[11]。

1.4.2 肝轉氨酶活力的測定 反應體系包括1 mL底物：2 mmol/L α-酮戊二酸，0.2 mol/L天冬氨酸 用于 谷氨酸氨基轉移酶（ALT）和2 mmol/L α-酮戊二酸，0.2 mol/L丙氨酸 用于谷草轉氨酶（AST）；底物與0.2 mL上清液在40℃水浴孵育30 min（AST）或60 min（ALT）。加入1 mmol/L、1 mmol/L DNPH終止反應。20 min后，每個反應體系加入10 mL、0.4 mol/L NaOH。以水做空白對照，30 min后記錄505 nm光吸收[12]。

1.4.3 腦谷氨酸脫氫酶（GDH）的測定 反應速率以NADH氧化導致340 nm吸光值的減少確定。0.125 mmol/L NADH加入1 mL反應混合物 （包含50 μL PMS，200 mmol/L NH4Cl，30 mmol/L α-KGA溶于100 mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH 8.0），記錄A340nm的減少。1單位NAD-GDH定義為每分鐘氧化1 nmol NADH需要的酶量[13]。

1.5 抗氧化酶及腦MDA

1.5.1 過氧化氫酶（CAT）活性測定 測定管（U）取上述溶血液30 μL加入1 mL預溫至37℃的基質液，置37℃水浴。準確計時60 s，加入1 mL鉬酸銨終止反應，空白1（B1）：依次加入1 mL基質液，1 mL鉬酸銨，30 μL溶血液；空白2（B2）：加入1mL基質液，1 mL鉬酸銨，30 μL蒸餾水。5 min后分光光度計，405 nm、10 mm小比色皿，以蒸餾水調零比色。

1.5.2 腦丙二醛（MDA）測定 取腦組織PMS樣品0.2 mL于試管中，加入pH 7.4的PBS 0.8 mL，充分混勻以后加1.80 mol/L TCA 0.5 mL。用漩渦混勻器充分混勻，放置冰浴2 h。取出后2 000 r/min離心15 min，吸取上清液1 mL。加入100 mmol/L TBA 0.25 mL。置沸水中燒煮20 min后流水冷至室溫。波長535 nm，光徑1 cm的微量比色皿比色。同樣方法制作一對照管，但不放置沸水浴。數據處理使用SPSS 11采用雙因素Avona分析。

2 結果與討論

2.1 代謝酶

不同降溫組血糖差異明顯。 II組降溫血糖低（p=0.00），顯示長時間低溫馴化導致血糖的大量消耗。同時I組中0℃儲藏較4℃也有下降（p=0.04），見表1。

Ⅱ組異檸檬酸脫氫酶活力在0℃較4℃儲存組高（P=0.02），各組均低于正常組，差異極顯著 （p= 0.00）。顯示有氧代謝的抑制，而低溫馴化及較低溫度儲藏對其活力有一定的保護作用。

表1 血糖及糖代謝酶比較Table 1 Blood glucose and glycometabolism enzymes

僅Ⅰ組腦異檸檬酸脫氫酶在4℃的明顯升高（p=0.05），其他較正常組無明顯差異。腦SDH各組無明顯差異，同時觀測到，作為線粒體內膜上的酶，其結果反應膜脂流動性在馴化及離水低溫下保持穩定。LDH乳酸脫氫酶受低溫馴化影響，I組含量均較正常組降低（p=0.02）。尤其I組在4℃較低（p= 0.00），較高溫度儲藏對其活力有明顯損傷。而1℃降溫同正常組無明顯差異。Ⅱ組4℃乳酸含量較高（p=0.05），低溫馴化保留了酶活力，同時較高的儲藏溫度提高了乳酸的集聚。

2.2 氨基酸

Alt受儲藏溫度影響，0℃儲藏活力較正常組明顯下降 （p=0.03）。而4℃較正常無明顯差異，GDH及AST僅顯示Ⅰ組在4℃較正常組有明顯降低，見表2。

2.3 CAT及腦MDA

肝臟中抗氧化酶活力沒有明顯差異。血液CAT活力受降溫速率影響，5℃快速降溫組血液CAT含量較高，而慢速降溫組CAT活力降低（p=.047）。不受儲藏溫度是0℃或是4℃的影響（p=0.67），顯示降溫過程中血液中R抗氧化酶活力受到影響，低溫馴化導致血液CAT含量升高。

MDA含量受儲藏溫度影響，0℃儲藏導致MDA集聚，其含量較正常值明顯升高（p=0.45）。同時II組即較長的馴化時間組，其腦MDA含量較短期馴化I組較高，而4℃儲藏MDA含量增加量較少。

表2 氨基酸代謝酶活力Table 2 Enzymes of amino acid metabolism

表3 抗氧化酶活性Table 3 Antioxidases activity

3 結語

3.1 代謝

代謝缺氧及低溫都會對酶活力產生影響[14]。環境脅迫下，魚類表現為代謝降低，同時需要保證抗氧化能力，即溫度變化會導致血糖增加并導致糖原分解加劇[15]。寒冷導致糖原異生從而血糖增加，而溫度升高會導致糖原分解加強[16-17]。

各儲藏組均顯示血糖的大量消耗，同時低溫離水條件下肝臟有氧代謝受到了明顯抑制。異檸檬酸脫氫酶的變化顯示，低溫下代謝受到明顯抑制，同時經過低溫馴化后，Ⅰ組于0℃儲藏異檸檬酸脫氫酶活力功能得到了一定保存。腦SDH結果表明，膜脂流動性在長時間馴化及離水低溫下保持穩定。淡水熱帶魚Prochilodus lineatus在30℃熱馴化時，糖分解酶（己糖激酶HK，磷酸果糖激酶PFK，丙酮酸激酶PK，乳酸脫氫酶LDH）總體呈減少趨勢，其結果導致糖代謝提供的能量減少[18]。

LDH是魚類低溫馴化研究較多的酶之一，Km是酶促反應中的速率常數,較低的表觀Km值反映了酶對底物較高的親和力，泥鰍卵母細胞經不同溫度馴化后，其LDH最低表觀Km值跟隨馴化溫度波動而變化，顯示酶在溫度變化后仍能保證與底物的高親和力，維持正常的酶促反應速率[19]。經過低溫馴化而肝臟中乳酸脫氫酶也得到了保存，保留了正常的無氧代謝能力。

低溫酶功能的馴化體現了機體代謝途徑發生轉換和重組，通過不同組織同工酶的表達可以滿足代謝馴化。在溫度馴化過程中，從肌肉和肝臟組織中都發現，LDH同蘋果酸脫氫酶同工酶表達增加[7]。但同時也有結果顯示，某些酶的同工酶表達沒有受到影響，而其結構的細微變化是酶的熱馴化的機理。對細胞基質丙氨酸轉氨酶研究指出，不同溫度環境下馴化魚類具有相同的亞基，即54 000和56 000亞基。這些結果表明，肝臟丙氨酸轉氨酶，馴化不同的生命模式，保持不變的結構。然而就動力學水平而言，肝臟丙氨酸轉氨酶對L-丙氨酸底物的親和力及抑制劑影響顯示出極大的差別。這些功能上的變化似乎體現酶動力學僅有細微變化，能夠滿足魚類的代謝以馴化不同環境需求[3]。通常認為酶結構只需要一個或很少氨基酸序列即可滿足溫度馴化的需要[6]。經過低溫馴化后，鯽魚酶活力的保留有利于逆境下保留機體代謝能力。

3.2 氨基酸代謝

I組4℃儲藏條件下GDH、AST下降，而 Leu較其他組低顯示了轉氨酶活力下降，表現出腦內氨基酸直接利用減少；結合轉氨酶的活力降低，對氨基酸的利用降低，LDH也較低，顯示其無氧代謝能力的下降，Leu的消耗增加。腦GDH及肝臟AST僅顯示Ⅰ組4℃較正常組有明顯降低。其他各組均保留活性。谷氨酸脫氫酶，作為不需氧的氨基酸脫氫酶，其活力的保留可在低溫下為魚體直接提供能量。

魚類氨基酸成分隨魚獲物捕獲季節及所食物料成分改變而不同。例如，Lys和Arg成分在夏季收獲的魚中含量較高[20]。氨基酸在冷馴化過程中具有多種作用。有文獻報道，香魚在冷馴化中有甘油大量積聚，而這些甘油的合成起初使用葡萄糖為糖原，然后使用氨基酸作為碳源[21]。活體組織通過積聚氨基酸抵抗冷脅迫[22]。親水性氨基酸例如Asp，Thr，Ser能使機體中的結合水增加，有助于應對低溫[23]。His、Tyr、Cys和Met具有易被氧化的結構，glu具有防止肌肉蛋白質變性及抗氧化的重要作用[24]。各種游離氨基酸的變化對在降溫無水脅迫中的抗氧化作用可能有重要意義，而對于低溫儲藏的生理機理仍需進一步研究。

3.3 抗氧化

0℃儲藏導致MDA的積聚，顯示零度儲藏下脂類過氧化加劇。而腦SDH各組無明顯差異，作為線粒體膜功能指標，其結果反應膜脂流動性在馴化及離水低溫下保持穩定。通常認為低溫影響細胞膜脂質結構。而機體通過等粘性調節馴化逆境，等粘性調節理論認為通過改變膜脂肪結構，保持膜流動性的最適狀態，以應對壓力及溫度變化[25]。冷馴化后細胞膜流動性增加。魚類通過增加膜脂不飽和度改變提高細胞膜流動性[26]。而低溫脅迫也可以導致膜脂流動性下降，進而對細胞造成損害并影響體內酶活性，同時膜流動性的改變會導致膜結合蛋白活性改變[27]。 酶動力學顯示，5-核苷酸酶最大反應速度同肌肉微粒體磷酸中飽和/不飽和脂肪酸的濃度相關，而后者受生存溫度的影響[28]。肌質網中的Ca-ATPase活性同生存溫度相關。Arrhenius plot顯示其酶活力在魚體生活溫度附近存在平衡區間，酶動力學特性可能是受到脂類環境與酶交互作用的調節[29]。

溫度脅迫會使魚體產生抗氧化反應，導致脂類過氧化產物MDA增加，抗氧化酶活性升高，在最適溫度最低，并且在高于或者低于這一物種最適溫度時升高[30]。高溫馴化使酶增加脂過氧化和酶過氧化。金魚熱應激后短期暴露到熱溫度，會顯著影響氧化指標，輕微影響抗氧化酶。脂類過氧化水平在開始的數個小時快速增加。在23℃馴化34～48 h后，谷胱甘肽過氧化物酶顯著增加，同時谷胱甘肽s轉化酶升至1.7倍[31]。金魚超氧化物歧化酶（SOD）活性受到熱休克的影響，在肝臟、腦、腎臟中增加，由熱馴化導致新的分子合成與抗氧化防御上升[32]。

CAT活力在血液中的肝臟中的差異顯示酶特性具有組織特異模式。翠鱧（Channa punctata）受溫度脅迫，CAT只有肝臟中增加，推測對非生物因素應激反應的組織特異性有利于減少生理系統壓力下對重要器官的生命活力功能紊亂損害[33]。

實驗結果表明，0℃儲藏下鯽魚存活率較高：組Ⅰ存活8條，組Ⅱ存活9條，4℃儲藏下兩組均存活7條。低溫馴化提高代謝酶活性對存活率影響僅在較低儲藏溫度即0℃組有差別，而0℃儲藏下較高的存活率可能與其較高的抗氧化酶如肝CAT活力一致。

低溫馴化有利于離水無氧儲藏中的無氧代謝能力，降低血液氧化反應。使魚類產生低溫馴化而采取的降溫措施為鯽魚無水儲藏保留了一定的有氧代謝能力。而氨基酸代謝、腦組織脂類過氧化主要受儲藏溫度的影響。

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Effect of Low Temperature Domestication Speed on the Enzyme Acitivity in the Waterless Storage of Crucian

ZENG Peng1， SHEN Jiang*2， CHEN Tianji1
（1.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2.School of Mechanical Engineering，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China）

This work studied the impact of hyperthermia acclimation and storage temperature on waterless storage of live Crucian Carps.Crucian Carps were hyperthermia acclimated at the speed of 5℃/h and 1℃/h，and then cultured for 24 hours at 4℃and 0℃in waterless ice storage rooms to observe variations activity of metabolic enzyme and antioxidant enzyme.The results showed that the temperature adaption set as 1℃/h increased the activity of Lactate Dehydrogenase（LDH）.The activity of isocitrate dehydrogenase（IDH）was maintained comparatively well under such condition，while brain succinate dehydrogenas（SDH）didn't change.Alaninetraensaminase（ALT）activity was maintained at 0℃storage，and Malondialdehyde（MDA）acitivity was accumulated at 0℃.No obvious change was discovered in liver，which was caused by accumulated Catalase（CAT）low temperature storage.

malondialdehyde，mitochondrion amino acids，low temperature acclimation，amino acids

S 984.1

A

1673—1689（2015）08—0849—07

2014-04-11

高等學校博士學科點專項科研項目（20093104110004）。

*通信作者：申 江（1960—），男，河北邯鄲人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事冷鏈技術與設備的研究。E-mail:shenjiang@tjcu.edu.cn