土生拉烏爾菌Y20產乳糖氧化酶發酵條件優化

寧 崇， 鄭 艷， 趙素潔， 孫宇強

（沈陽農業大學 食品學院，遼寧 沈陽 110086）

土生拉烏爾菌Y20產乳糖氧化酶發酵條件優化

寧 崇， 鄭 艷*， 趙素潔， 孫宇強

（沈陽農業大學 食品學院，遼寧 沈陽 110086）

以選育的土生拉烏爾菌（Y20）為生產菌株，在單因素和響應面分析的基礎上考察了不同發酵條件對乳糖氧化酶活性的影響。方差分析結果表明，發酵條件對乳糖氧化酶活性影響次序：初始pH＞發酵時間＞接種體積分數＞發酵溫度。響應面分析優化的最適發酵條件：發酵時間25 h，發酵溫度28℃，初始pH 7.2，接種體積分數2%。最優發酵條件下乳糖氧化酶的實際酶活可達78.36 U/g，與預測的酶活78.85 U/g接近。

土生拉烏爾菌Y20；乳糖氧化酶；響應面分析；優化

乳糖酸是一種新型的多羥基有機酸[1]，因其具有多種生理功能而被廣泛應用于食品、醫藥和精細化工行業[2-3]。目前，歐美等國家乳糖酸的生產主要采用化學合成法[4]。但該方法在氧化過程中伴有多種副產物的生成，致使產品分離純化比較困難，生產成本相對較高，因此乳糖酸一直未能成為大眾的化工商品，限制了其應用范圍。酶法生產乳糖酸始于1998年，主要采用兩步法。所用酶主要有纖維二糖酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖果糖氧化還原酶等，該法由于所用酶的底物專一性、穩定性等原因始終難以和化學合成法抗衡。

2001年Xu等發現的一種新的碳水化合物氧化酶——乳糖氧化酶[5]，該酶對乳糖氧化為乳糖酸具有較高的特異性[6]。乳糖氧化酶可以將單糖、二糖、多糖氧化，并將電子直接傳遞給氧氣，生成過氧化氫，再通過催化反應將過氧化氫還原為水[7]，在食品中是安全的。這種酶含有FAD，與已經報道的葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶或吡喃糖氧化酶不同，對寡聚糖和長碳鏈的聚合糖類有很高的活性，乳糖氧化酶對乳糖的親和性也很高[8]。

以選育的土生拉烏爾菌（Y20）為出發菌株，通過單因素及響應面分析設計試驗對乳糖氧化酶的發酵條件進行初步研究[9-11]，以期為該酶的發酵生產提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種 土生拉烏爾菌 Raoultella terrigena（Y20）：沈陽農業大學食品學院生物技術實驗室選育。

1.1.2 培養基配方 固體培養基：乳糖 10 g、蛋白胨10 g、NH4NO32 g、NaCl 2 g、KH2PO41 g、K2HPO41 g、MgSO40.5 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL；pH 7.2～7.4。

液體培養基：同固體培養基，不加瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 培養方法 將土生拉烏爾菌（Y20）在固體培養基上活化后，接種于液體培養基中，于28℃下培養24 h[12]。

1.2.2 發酵條件對菌株（Y20）產乳糖氧化酶能力的影響

1）發酵時間對菌株（Y20）產乳糖氧化酶能力的影響：將菌株以1%接種體積分數接種在乳糖氧化酶發酵培養基中，其他條件相同的情況下培養12、24、36、48、60 h，測定其酶活性。

2）發酵溫度對菌株（Y20）產乳糖氧化酶能力的影響：將菌株以1%的接種體積分數接種在乳糖氧化酶發酵培養基中，在其他條件相同的情況下于24、26、28、30、32℃培養24 h，測定其酶活性。

3）起始pH值對菌株（Y20）產乳糖氧化酶能力的影響：將菌株以1%的接種體積分數接種在產乳糖氧化酶發酵培養基中，其他條件相同的情況下分別調節pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，培養24 h，測定酶活性。

4）接種體積分數對菌株（Y20）產乳糖氧化酶能力的影響：將菌株以1%、2%、3%、4%、5%的不同接種體積分數接種于產乳糖氧化酶發酵培養基，在其他條件相同的情況下，測定其酶活性。

1.2.3 分析方法

1）乳糖氧化酶活性的測定：乳糖氧化酶可以氧化乳糖為乳糖酸，乳糖酸在酸性條件下可分解為葡萄糖酸和半乳糖，葡萄糖酸在酸性條件下發生內酯化，形成的內酯與羥胺堿反應，生成異羥肟酸。異羥肟酸與FeCl3能生成有色絡合物，從而可通過分光光度法定量分析葡萄糖酸的含量[13]。乳糖氧化酶活性由D-葡萄糖酸的量來檢驗，一個酶活單位定義為：每分鐘細胞產生1 μmol葡萄糖酸的量。

含0.4 mol/L的乳糖、0.2 mol/L磷酸氫二鈉、0.1 mol/L、pH 6.0的檸檬酸緩沖液0.5 mL及細胞懸液0.5 mL的混合液1.0 mL，在40℃下反應10 min后，加入50 μL、1 mol/L NaOH以終止反應。向混合物中加入50 μL、1mol/L HCl，中和NaOH。反應混合物加0.5mL、2 mol/L HCl，煮沸40 min，以水解乳糖酸為D-葡萄糖酸和D-半乳糖。在10 mL具塞試管中加入0.5 mL待測樣，再加入0.5 mL去離子水，混合均勻后，沸水浴中加熱20 min，冷卻至室溫。然后順序加入2 mL鹽酸羥胺和NaOH混合試劑、1 mL、4 mol/L HCl和1 mL FeCl3試劑，混合均勻，這時反應混合物的pH為1.2±0.2。放置10 min后比色（波長505 nm），以空白管（用0.5 mL去離子水替代樣品溶液，其余試劑用量與前相同）校零，讀取各管的吸光度OD505值，測定工作在10 min內完成[14]。

2）蛋白質質量濃度測定：采用紫外分光光度法，以牛血清蛋白標準品做蛋白質標準曲線，見圖1。將牛血清蛋白配置成質量濃度為0、0.25、0.5、0.75、1.00、1.25 mg/mL的溶液，在280 nm處測定吸光度值。以牛血清蛋白的質量濃度c為橫坐標，280 nm處的吸光度值做標準曲線。A=0.909 9c+0.005 2。相關系數：R=0.999 2。其中，A為牛血清蛋白在280 nm處的吸光度值；c為牛血清蛋白的質量濃度。

圖1 牛血清蛋白標準曲線Fig.1 Bovine serum protein standard curve

2 結果與分析

2.1 發酵條件對菌株（Y20）產乳糖氧化酶能力的影響

2.1.1 發酵時間對菌株（Y20）產乳糖氧化酶能力的影響 改變發酵培養條件中的發酵時間，其他條件不變，考察發酵時間對菌株產乳糖氧化酶能力的影響，結果見圖2。在發酵12～24 h時，隨著時間的推移，酶活逐漸增長；在發酵24～60 h時，隨著時間的推移，酶活性緩慢降低；在發酵24 h時達到峰值，乳糖氧化酶活性為70.24 U/g。

圖2 發酵時間對產乳糖氧化酶能力的影響Fig.2 Effect of fermentation time on lactose oxidase

2.1.2 發酵溫度對菌株（Y20）產乳糖氧化酶能力的影響 改變發酵培養條件中的發酵溫度，其他條件不變，考察發酵溫度對菌株產乳糖氧化酶能力的影響，結果見圖3。發酵溫度在24～28℃時，隨著溫度的提高，酶活逐漸升高；發酵溫度在28～32℃時，隨著溫度的提高，酶活逐漸降低；在發酵溫度28℃時達到峰值，酶活為73.19 U/g。

2.1.3 起始pH值對菌株（Y20）產乳糖氧化酶能力的影響 酸堿度對微生物的生長代謝有著重要影響，不同的微生物對酸堿有不同的適應性。確定了發酵液初始pH之后，在整個發酵過程中不再人為改變發酵液pH值的情況下，考察發酵過程中發酵液pH的變化對菌株（Y20）產乳糖氧化酶能力的影響。

圖3 發酵溫度對產乳糖氧化酶能力的影響Fig.3 Impact of fermentation temperature on lactose oxidase

不同的初始pH值不僅可以影響營養物質的可給性，同時也會影響代謝過程中酶的催化活性，進而影響到乳糖氧化酶活性。作者以2%的接種體積分數接種至不同pH值的發酵培養基中，發酵24 h，測定乳糖氧化酶活性。由圖4可知，在發酵液初始pH值為7.0時，乳糖氧化酶活性最高，因此確定該菌株的發酵初始pH值為7.0。

圖4 起始pH對產乳糖氧化酶能力的影響Fig.4 Effect of beginning of pH valve on lactose oxidase

2.1.4 接種體積分數對菌株（Y20）產乳糖氧化酶能力的影響 接種體積分數的大小直接影響乳糖氧化酶活性，合適的接種體積分數不僅可以提高產物的合成速率，也有利于減少染菌機會。改變發酵培養條件中的接種體積分數，其他條件不變，考察接種體積分數對菌株產乳糖氧化酶能力的影響，結果見圖5。接種體積分數為2%時，發酵液中乳糖氧化酶活性最高；隨著接種體積分數的增加，乳糖氧化酶活性開始下降，這主要是由于過高的接種體積分數使得菌體細胞的數量增殖過快，營養消耗過多，進而影響到代謝產物的生成量。

2.2 響應面法優化土生拉烏爾菌（Y20）產乳糖氧化酶的發酵條件

2.2.1 響應面設計及結果 為優化土生拉烏爾菌（Y20）產乳糖氧化酶發酵條件，采用經典的四因素三水平Box-Behnken試驗設計[15]，在單因素試驗基礎上，對發酵時間（A）、發酵溫度（B）、初始pH（C）、接種量（D）進行優化，具體方案及結果見表1-2。

圖5 接種體積分數對產乳糖氧化酶能力的影響Fig.5 Impact of amount of inoculation on lactose oxidase

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface design

表2 Box-Behnken Design實驗設計與實驗響應結果Table 2 Box-Behnken design and response result values

續表2

2.2.2 模型評價 利用Design-Exper7.0軟件對表2試驗數據進行二次多項式逐步回歸擬合，得到的數學模型為：

Y=75.66+2.16A+1.73B+2.44C-2.08D+0.38AB-0.01AC+0.11AD-0.54BC-0.03BD-0.34CD-11.48A2-12.01B2-18.59C2-7.82D2

模型方差分析結果和各項系數顯著性檢驗結果列于表3。

從表3可以看出，土生拉烏爾菌產乳糖氧化酶活性影響的大小順序為：初始pH＞發酵時間＞接種體積分數＞發酵溫度。

模型中的F=4 931.83，P＜0.05，說明本實驗采取的二次模型是極顯著的。PA、PB、PC、PAB、PBC、PCD、PA2、PB2、PC2、PD2均小于0.05，說明取發酵時間、發酵溫度、初始pH及其4個因素的二次項都具有顯著的影響。決定因素R2=0.999 8，也說明模型能夠很好地反應響應值的變化，擬合度好。

根據回歸方程，用Design-Expert7.0軟件做出響應面，考察擬合響應曲面的形狀。通過Design-Expert7.0軟件優化功能再次優化，結果見圖6—11。分別顯示了發酵時間與發酵溫度、發酵時間與初始pH、發酵時間與接種體積分數、發酵溫度與初始pH、發酵溫度與接種體積分數、初始pH與接種體積分數之間的相互作用對乳糖氧化酶活性的影響。

圖6 Y=f（A，B）的響應面和等高線圖Fig.6 Respond figic and contour plot for Y=f（A，B）

圖7 Y=f（A，C）的響應面和等高線圖Fig.7 Respond figic and contour plot for Y=f（A，C）

圖8 Y=f（A，D）的響應面和等高線圖Fig.8 Respond figic and contour plot for Y=f（A，D）

圖9 Y=f（B，C）的響應面和等高線圖Fig.9 Respond figic and contour plot for Y=f（B，C）

圖10 Y=f（B，D）的響應面和等高線圖Fig.10 Respond figic and contour plot for Y=f（B，D）

圖11 Y=f（C，D）的響應面和等高線圖Fig.11 Respond figic and contour plot for Y=f（C，D）

由圖6—11可以直觀地看出各因素對響應值的影響及其變化趨勢，可以找出最佳參數。在所選的范圍內存在極值，而且回歸模型確實存在最大值。乳糖氧化酶活性隨著考察因素的逐漸增大而升高；當繼續增加超過實驗取得的各因素的中心值時，乳糖氧化酶活性隨著考察因素的增加而降低。圖6說明，發酵時間與發酵溫度、發酵溫度與初始pH、初始pH與接種體積分數之間有顯著影響；發酵時間與初始pH、發酵時間與接種體積分數、發酵溫度與接種體積分數之間影響不夠顯著，正如方差結果所示。

通過最優化分析，最佳的發酵時間為24.93 h，最佳發酵溫度為28.13℃，最適初始pH為7.16，最佳接種體積分數1.88%，預測乳糖氧化酶活性為78.36 U/g。但考慮實際操作的局限性，設定發酵時間為25 h，發酵溫度28℃，初始pH為7.2，接種體積分數為2%。

2.2.3 驗證響應面優化土生拉烏爾菌（Y20）產乳糖氧化酶最佳發酵條件 在最優發酵條件下進行乳糖氧化酶發酵驗證實驗，實際酶活為78.36 U/g，與預測的酶活78.85 U/g接近。

3 結語

酶法生產乳糖酸始于1998年，乳糖在纖維二糖酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖果糖氧化還原酶等酶的催化下，通過二步法轉化為乳糖酸。此法由于所用酶的底物專一性、穩定性等原因，始終難以和化學合成法及電轉化法相抗衡。乳糖氧化酶和乳糖脫氫酶是最近幾年來發現的兩種能夠直接將乳糖轉化為乳糖酸的氧化還原酶類。雖然這兩種酶均具有底物專一性強，轉化率高的特點，但是由于乳糖脫氫酶是一種膜結合蛋白，分離純化過程極其復雜，且該酶容易失活，因而使其在酶法生產乳糖酸中失去競爭優勢。乳糖氧化酶最初是在真菌中發現的一種以FAD為輔助因子的，能夠將乳糖直接氧化成乳糖酸的一種氧化還原酶。該酶對乳糖具有較高的親和性，且穩定性較高。關于產酶的微生物菌種及產酶條件的研究鮮少見報道。

作者考察了發酵時間、發酵溫度、初始pH、接種體積分數四個因素對土生拉烏爾菌（Y20）產乳糖氧化酶的影響程度。模型擬合度較好，可對土生拉烏爾菌（Y20）產乳糖氧化酶的影響因素起動態分析和最優結果預測的作用。通過Design-Expert7.0軟件優化功能確證了本次實驗考察因素的最優工藝參數，即最佳的發酵條件為：發酵時間25 h，發酵溫度28℃，初始pH 7.2，接種體積分數2%，為土生拉烏爾菌（Y20）產乳糖氧化酶氧化乳糖提供一定的條件。

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Optimum Fermentation Condition of Production Lactose Oxidase by Raoultella terrigena Y20

NING Chong， ZHENG Yan*， ZHAO Sujie， SUN Yuqiang
（College of Food Science，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China）

The effects of fermentation conditions on lactose oxidase activity producing by Raoultella terrigena Y20，which was screened by our lab，were studied by single factor experiment and response surface methodology.The results showed that the four independent variables as initial pH value，fermentation time，inoculation amount and fermention temperature had significant and sequence effects on the lactose oxidase activity.The optimal fermention conditions were as follows，inoculum amount of 2%，initial pH at 7.2，fermented 25 h，temperature at 28℃.Under the optimal conditions，the lactose oxidase activity was 74.96 U/g，which was almost consistent with predicted value of 78.87 U/g.

Raoultella terrigena Y20，lactose oxidase，response surface methodology，optimum

TQ920.6

A

1673—1689（2015）08—0879—07

2014-04-23

遼寧自然科學基金項目（201202190）。

*通信作者：鄭 艷（1973—），女，遼寧丹東人，農學博士，副教授，主要從事食品生物技術、發酵工程和酶工程方面的研究。E-mail：zhengyan0403@163.com