蛹蟲草Cordyceps militaris JN168菌株的誘變育種及液態發酵產蟲草素

劉金彬， 沈建增， 蔡宇杰*， 廖祥儒， 羅軍俠， 張大兵

（1.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122；3江蘇漢邦科技有限公司，江蘇 淮安223001）

蛹蟲草Cordyceps militaris JN168菌株的誘變育種及液態發酵產蟲草素

劉金彬1，2， 沈建增3， 蔡宇杰*1，2， 廖祥儒1，2， 羅軍俠3， 張大兵3

（1.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122；3江蘇漢邦科技有限公司，江蘇 淮安223001）

利用離子束、亞硝基胍及離子束-亞硝基胍誘變法處理蛹蟲草Cordyceps militaris JN168，初步獲得了幾株較高產蟲草素的菌株。通過進一步篩選得到復合誘變菌2，并對該菌的液態發酵培養基組分進行了優化。實驗結果表明：蛹蟲草液態發酵產蟲草素的最佳培養基組分為（g/L），葡萄糖40，酵母浸粉25，MgSO4·7H2O 0.6，K2HPO4·3H2O 0.6，KH2PO40.6。優化后蟲草素產量提高了5倍，最高達1 045.65 mg/L。

蛹蟲草；蟲草素；誘變；液態發酵；優化

蛹蟲草是中國名貴的中藥，是一類極具保健功能的大型藥用真菌，屬于真菌界、真菌門、子囊菌亞門、糞殼菌綱、肉座菌目、麥角菌科、蟲草屬[1]，是蟲草屬的模式種，學名為Cordyceps militaris，又名北冬蟲夏草、北蟲草[2]。近來大量文獻報道，蛹蟲草可產多種活性物質，像蟲草素、甘露醇、蟲草多糖等[3-4]。蟲草素作為主要有效成分引起了人們的高度重視。

蟲草素又名蟲草菌素、3′-脫氧腺苷等，是第一個從真菌中分離出來的核苷類抗生素[3]。1951年，Cunningham等觀察到被蛹蟲草寄生的昆蟲組織不易腐爛，隨后從中分離到蟲草素。蟲草素分子式為C10H13N5O3，相對分子質量為251，熔點為230～231℃，溶于水、熱乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚和氯仿，紫外光的最大吸收波長為259 nm[5-6]。很長時間以來，國內外學者對蟲草素的藥理作用和產品開發研究具有極高的興趣。大量實驗研究表明，蟲草素對DNA和RNA合成、hnRNA和mRNA轉錄后修飾以及腺苷酸環化酶等均具有抑制作用，具有抗炎、抗真菌、抗癌及抗病毒等多種生理活性[9]。1997年，FDA批準美國波士頓大學醫學中心進行蟲草素治療急性淋巴性白血病和慢性粒細胞白血病的一期臨床試驗[4]；2008年，FDA批準美國OncoVista公司進行蟲草素與腺苷脫氨酶抑制劑噴司他丁聯合用藥，治療末端脫氧核苷酸陽性白血病細胞（TDT+）的一期、二期臨床試驗。目前，由蟲草素制成的抗白血病的新藥已經進入三期臨床。

目前蟲草素的生產主要有化學合成和生物合成兩種方法[7]。與生物合成法相比，化學合成蟲草素得率低，合成過程中使用了大量有機溶劑（如氯仿等），對環境會造成污染等缺陷。蛹蟲草發酵合成蟲草素有寄主培養、固態培養、代料栽培和液體培養等多種方式。固態培養過程，蛹蟲草產生的蟲草素有98%從菌絲體分泌到周圍的發酵培養基中[8]，因而液態發酵對于生產蟲草素具有明顯優勢。作者對蛹蟲草進行了亞硝基胍-離子束的復合誘變育種，并對發酵條件進行了優化，以期提高蟲草素產量，促進蟲草素的產業化生產。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 蛹蟲草Cordyceps militaris JN168：保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO：M2011333。

1.1.2 培養基

1）斜面培養基（g/L）：葡萄糖20，酵母浸膏10，MgSO4·7H2O 1.0，K2HPO4·3H2O 0.5，KH2PO40.5，瓊脂20；pH自然，121℃滅菌20 min。

2）種子培養基（g/L）：葡萄糖30，酵母浸膏10，MgSO4·7H2O 1.0，K2HPO4·3H2O 1.0，KH2PO41.0；pH自然，121℃滅菌20 min。

3）發酵培養基（g/L）：葡萄糖40，酵母浸粉10，MgSO4·7H2O 1.0，K2HPO4·3H2O 1.0，KH2PO41.0；pH自然，121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 誘變劑的配制 準確稱取500 mg 1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍（NTG），放入干凈燒杯中，先加入5 mL丙酮或甲酰胺進行溶解，然后加入95 mL、pH 6.0的0.1 mol/L磷酸緩沖液，配制成5 mg/mL的溶液。

1.2.2 孢子懸液的制備 將菌株 Cordyceps militaris JN168接種在種子斜面培養基，在25℃培養6～7 d，加入13 mL、pH 6.0的磷酸緩沖液，用接種環刮下孢子或用移液槍吹打下孢子（盡量不要弄下菌絲體）[12]，將孢子懸液倒入無菌試管，用無菌磷酸緩沖液適量稀釋制成OD600值在0.6～0.8之間的孢子懸液。

1.2.3 NTG誘變 取一定量5.0 mg/mL的NTG溶液，分別稀釋成1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL各1.5 mL。從不同質量濃度的NTG溶液中，各取0.5 mL加入到4個無菌離心管，并標記為1號。重復2次以上實驗，分別標記為2號、3號。然后取3個滅菌離心管各加0.5 mL磷酸緩沖液作為對照。在15個離心管中各加0.5 mL孢子懸液。將1號及一個對照在30℃下振蕩10 min，將2號及一個對照在30℃下振蕩20 min，剩下的3號及對照處理30 min。時間到達后，立即稀釋一定倍數停止藥品作用，然后涂平板，并在25℃下培養4 d并計數。

1.2.4 離子束誘變 在超凈工作臺中，分別取9片金屬載片置于酒精燈外焰灼燒30 s，待冷卻后放到滅菌的玻璃平板中，取20 μL孢子懸液涂在金屬載片上。將裝有樣品載片的平板移至ARTP誘變系統操作倉，用無菌鑷子將載片放在相應孔位，調節載片臺下方旋鈕，使載片處于氣流端口3 mm處，并關閉操作倉門。在其他參數一定的條件下，分別把處理時間設定為0、6、8、10、12、14、16、18、20 s。待樣品處理完畢后，用無菌鑷子將載片放至裝有1 mL磷酸緩沖液的滅菌離心管中。將離心管放在振蕩器上振蕩3 min，形成新的孢子懸液。對新的孢子懸液進行適當稀釋，取100 μL稀釋液涂布平板，并在25℃培養箱中培養4 d后計數。

1.2.5 復合誘變 挑選出經亞硝基胍誘變后的高產菌株，用1.2.4的方法進行再次誘變。

1.2.6 致死率的計算 平板培養4 d后，小的菌落已經長成，拿出平板在光亮處數平板菌落數，并記下菌落數目，按照下列公式算出致死率。

1.2.7 誘變菌株穩定性檢測 選擇菌落邊緣整齊，表面光滑，菌絲緊密，色澤光亮，顏色呈現橘紅色、金黃色的菌株[10-11]，洗下孢子經行培養皿培養，再從中挑選，然后反復傳代實驗，直到選出形態、顏色穩定的菌株，之后進行搖瓶檢測。檢測結果穩定的菌株可以作為種子菌株進行搖瓶實驗。

1.2.8 液態發酵 按1.2.2制好的孢子懸液，以體積分數10%接種于種子培養基中，25℃、200 r/min搖瓶培養4 d，獲得種子培養液。然后，按體積分數10%接種，將種子培養液接種于發酵培養基中，250 mL三角瓶裝液50 mL，培養溫度25℃，轉速150 r/min，培養周期8 d。

1.2.9 生物量的測定 通過真空泵將得到的發酵液進行抽濾處理，收集濕菌體，置于60℃下恒溫干燥至恒重，用分析天平稱質量。

1.2.10 蟲草素濃度的測定 將1.2.8抽濾下來的發酵液以10 000 r/min離心10 min，取上清液2 mL，經0.45 μm纖維濾膜過濾，除掉一些雜質，然后用高效液相色譜法測定蟲草素質量濃度。檢測條件：紫外檢測波長為260 nm，流動相為 15%的甲醇，進樣量20 μL，柱溫30℃，流速1 mL/min[13]。

2 結果與分析

2.1 誘變菌株生長特性研究

從多次誘變實驗中，選擇幾株長勢良好，具有代表性的菌株，對其生長情況進行進一步研究。原始菌株生長緩慢，且不穩定，容易退化，最主要的是蟲草素的產量并不是很理想。經過幾天的光照培養，原始菌株及誘變菌的平板長勢見圖1。

圖1 蛹蟲草Cordyceps militaris JN168原菌及誘變菌14-3、1-16、2-18、復合誘變2的平板形態特性Fig.1 Morphological character of Cordyceps militaris JN168 on plate(a)and mutant strains(b、c、d、e、f)

圖1中各圖片顯示了不同菌在轉色后的顏色及形態特征（各圖片皆是轉色穩定時拍攝）。可以看出，誘變后菌株的形態及生長狀況發生很大的差異。誘變菌14-3和誘變菌1-16的形態發生略微差異，但是顏色變化有很大差異。然而，誘變菌2-18和復合誘變菌2菌株的形態和顏色變化都很大，尤其是形態變化，兩株菌在平板中都長出很高的子實體，顏色由原菌的橘黃色變為橘紅色。誘變菌8-1是典型的負突變菌株，顏色變為白色，蟲草素產量也會很低。所以轉色后為白色或形態畸變的初篩時舍棄。

2.2 誘變菌株液態發酵產蟲草素的質量濃度驗證

2.2.1 NTG誘變菌株產蟲草素質量濃度測定 經過多次傳代后，選出長勢良好的菌株，接種于斜面培養基培養，待其長滿斜面后，制成孢子懸液，進行搖瓶實驗驗證，結果見圖2。從圖2可以看出，誘變菌蟲草素的產量基本上比原菌低，原菌產量為203.57 mg/L，但誘變菌株1-16的產量為289.29 mg/L，比原菌提高85.72 mg/L。誘變菌1-16轉色比原菌深，所以選擇誘變菌1-16進一步進行傳代培養。

圖2 NTG誘變菌液態發酵產蟲草素的質量濃度Fig.2 Production of cordycepin by NTG mutant strain in liquid fermentation

2.2.2 第二次NTG誘變菌株產蟲草素質量濃度測定 在第一次實驗的基礎之上，選擇更佳的誘變濃度及誘變時間進行處理。涂平板并進行培養。待菌落轉色后，挑出轉色好的菌株繼續培養，經過數代、數十代的傳代培養，挑出穩定的菌株進行搖瓶驗證實驗，結果見圖3。從圖3可以看出，誘變菌2-18蟲草素的產量遠高于原菌產量。誘變菌2-18的產量達553.51 mg/L，而原菌產量只有300.72 mg/L，所以選擇誘變菌2-18進一步試驗。

2.2.3 離子束誘變菌株產蟲草素濃度測定 ARTP（常壓室溫等離子體）技術是使用氦氣作為工作氣體，通過射頻輝光放電產生富含各種高能活性粒子的等離子體。ARTP所產生的活性粒子能夠對菌株、植株、細胞等的遺傳物質造成損傷，并誘發生物細胞啟動SOS修復機制。SOS修復過程為一種高容錯率修復，因此修復過程中會產生種類豐富的錯配位點，并最終穩定遺傳進而形成突變株。ARTP對生物的遺傳物質損傷效果明顯、損傷機制豐富、尤其是對于真核生物的遺傳物質均有很強的損傷效果。離子束處理時間和孢子死亡率關系見圖4。

圖3 NTG誘變菌液態發酵產蟲草素的質量濃度Fig.3 Production of cordycepin by NTG mutant strain in liquid fermentation

圖4 蛹蟲草Cordyceps militaris JN168離子束處理時間與死亡率的關系Fig.4 Relationship between ion beam processing time and death rate of Cordyceps militaris JN168

從圖4可以看出，隨著處理時間的增長，孢子的死亡率也不斷增加。當處理時間為14 s時，孢子的死亡率達78%，在16、18 s時，孢子死亡率幾乎不再改變。當超過18 s時，孢子死亡率頓時提高，幾乎全部死亡。根據文獻報道，產量形狀的誘變育種傾向于致死率70%～80%，因此選擇14 s為最佳處理時間。

因為致死曲線只能作為一種參考，所以在14 s左右多選擇幾個處理時間。誘變后的菌株經多次傳代培養后，進行搖瓶實驗驗證，結果見圖5。原菌產量為203.57 mg/L，并且有4株菌高于原菌產量，產量最高的為誘變菌14-3，其產量為362.62 mg/L，高于原菌產量159.05 mg/L，所以選擇誘變菌14-3作為這次誘變的目的菌株，進行下一步實驗。

圖5 離子束誘變菌液態發酵產蟲草素的質量濃度Fig.5 Production of cordycepin by ion beam mutant strain in liquid fermentation

2.2.4 復合誘變菌株產蟲草素濃度驗證 復合誘變利用兩種原理不同的誘變方法，先后對菌株進行誘變，在菌株自我修復的過程中，再對誘變菌株進行誘變。在整個誘變過程中，菌株遺傳物質的損傷加大，生物細胞SOS修復更加紊亂，致使菌株的死亡率提高，存活下來的菌株在培養過程出現正突變的幾率變大。所以，誘變菌株更有可能高于原菌產量。經過多次分離、純化，得到復合誘變菌2等幾株菌，如圖1（e）所示。

原始菌株在平板及其他器皿培養過程中，很少會出現子實體。而且子實體的產生，在大多數情況下需要溫差刺激。然而，復合誘變菌2并不需要溫差刺激，并且子實體的產生時間稍微縮短。將菌株接種于斜面，培養至長滿斜面為止。然后制成孢子懸液進行搖瓶實驗，結果見圖6。發酵8 d后，原菌產量為231.62 mg/L，復合誘變菌2的產量高達620.74 mg/L，選擇復合誘變菌2繼續實驗。

2.3 液態發酵培養基優化

將得到的4株誘變菌進一步分離、純化，在各代培養培養過程中，選擇長勢良好的菌落進行液態發酵，發酵后產蟲草素的情況見圖7。誘變菌1-16和誘變菌14-3在多次傳代過程中，蟲草素產量表現并不是很穩定，分別在250 mg/L和300 mg/L左右徘徊。誘變菌2-18的蟲草素產量變化很不穩定，不宜進行下一步實驗。復合誘變菌2的蟲草素產量相當穩定，產量維持在600 mg/L左右，可以作為目的菌株，進行下一步實驗。

圖6 復合誘變菌液態發酵產蟲草素的質量濃度Fig.6 Production of cordycepin by compound mutation strain in liquid fermentation

圖7 誘變菌株液態發酵產蟲草素的穩定性Fig.7 Stability study of liquid fermentation to produce cordycepin by mutant strains

2.3.1 葡萄糖質量濃度對Cordyceps militaris JN168菌體生長和產蟲草素質量濃度的影響

葡萄糖作為還原糖的一種，也是培養基主要的碳源之一。對菌體的生長有重要的作用，而且對該菌產物蟲草素的影響更為明顯。將發酵培養基中葡萄糖質量濃度設為20、30、40、50、60 mg/mL，進行不同質量濃度的葡萄糖對Cordyceps militaris JN168產菌體和蟲草素的實驗。由圖8可以看出，葡萄糖質量濃度為40 mg/mL時，蟲草素質量濃度最高，達732.24 mg/L。隨葡萄糖質量濃度的增加，菌體質量濃度也不斷增加，但在葡萄糖質量濃度為50 mg/mL時，菌體質量濃度達到最大。

圖8 葡萄糖質量濃度對蛹蟲草菌體生長和產蟲草素的影響Fig.8 Effect of maltose concentration on cell growth and the production of cordycepin

2.3.2 酵母浸粉質量濃度對 Cordyceps militaris JN168菌體生長和產蟲草素的影響 酵母浸粉作為重要的氮源，對菌株的生長也是不可或缺，對實驗中菌體的產物也尤為重要。設定培養基中酵母浸粉質量濃度為10、15、20、25、30、35、40、45 mg/mL，進行不同質量濃度的酵母浸粉對Cordyceps militaris JN168產菌體和蟲草素的影響實驗。由圖9可以看出，酵母浸粉質量濃度為25 mg/mL時，蟲草素質量濃度最高。菌體質量濃度與蟲草素的產量并沒有確定的關系，菌體質量濃度也并不是很有規律。從圖9可以看出，菌體質量濃度取得最高值時，酵母浸粉質量濃度為30 mg/mL。

圖9 酵母浸粉質量濃度對蛹蟲草菌體生長和產蟲草素的影響Fig.9 Effect of yeast extract powder concentration on cell growth and the production of cordycepin

2.3.3 硫酸鎂質量濃度對Cordyceps militaris JN168菌體生長和產蟲草素的影響 鎂離子是許多重要酶（己糖激酶、檸檬酸脫氫酶、羧化酶等）的激活劑，能促進碳水化合物的新陳代謝、磷酸鹽的轉化等，其水平與細胞內聚胺水平相關，從而影響核糖體穩定性和RNA合成。過多的鎂離子反而對菌體的生長及產物的形成有抑制作用。所以，合適的鎂離子質量濃度對菌體的產物尤為重要。將培養基中MgSO4·7H2O質量濃度設定為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL，進行不同質量濃度的MgSO4·7H2O對Cordyceps militaris JN168產菌體和蟲草素的影響實驗。由圖10可以看出，MgSO4·7H2O質量濃度為0.6 mg/mL時，蟲草素質量濃度最高，最高時達到879.27 mg/L。菌體質量濃度在MgSO4·7H2O質量濃度為1.0 mg/mL時最大，達到33 mg/mL。

圖10 MgSO4·7H2O質量濃度對蛹蟲草菌體生長和產蟲草素的影響Fig.10 Effect of MgSO4·7H2O concentration on cell growth and the production of cordycepin

2.3.4 磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀濃度對Cordyceps militaris JN168菌體生長和產蟲草素的影響K2HPO4·3H2O和 KH2PO2不僅提供磷離子和鉀離子，而且對培養液的pH有一定的影響，所以K2HPO4·3H2O和KH2PO2合適的質量濃度對菌體生長和產物形成尤為重要。選取K2HPO4·3H2O和KH2PO2的質量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL進行試驗。由圖11可以看出，在K2HPO4· 3H2O和KH2PO2質量濃度為0.6 mg/mL時，蟲草素產量最高，達1 045.65 mg/L，但菌體質量濃度最低。當K2HPO4·3H2O和KH2PO2質量濃度為0.8 mg/mL，菌體濃度最高，達23.36 mg/mL。

3 結語

蟲草素具有抗癌、抗白細胞、抗菌等多種生物活性和豐富的藥用價值，由于蟲草的天然資源有限，人工生產蟲草素已經迫在眉睫。目前蟲草素的生產主要是化學合成和生物合成兩種方法。然而，化學合成多采用一些有機溶劑，不但對產物有一定的影響，而且還會污染環境，因此生物合成就有了不可比擬的優勢。盡管如此，生物合成還是有一些弊端難以克服，像產量低、周期長等。所以提高產量和縮短周期就成了科研人員及工作人員亟待解決的難題。

圖11 K2HPO4·3H2O和KH2PO4質量濃度對蛹蟲草菌體生長和產蟲草素的影響Fig.11 Effect of K2HPO·43H2O and KH2PO4concentration on cell growth and the production of cordycepin

本研究經過實驗，得出以下幾項結論：

1）通過誘變育種和多次傳代培養，得到兩株比較有價值的菌株誘變菌14-3和復合誘變菌2。

2）通過優化得到最優培養基：葡萄糖40 g/L，酵母浸粉25 g/L，MgSO4·7H2O 0.6 g/L，K2HPO4·3H2O 0.6 g/L，KH2PO40.6 g/L。

3）在不添加前體物質，發酵時間8 d的條件下，得到蟲草素產量為1 045.65 mg/L，與岳翠翠等報道的633.47 mg/L相比，提高了412.18 mg/L[12]。

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Mutation Breeding and Cordycepin Production Study of Cordyceps militaris JN168

LIU Jinbin1，2， SHEN Jianzeng3， CAI Yujie*1，2， LIAO Xiangru1，2， LUO Junxia3， ZHANG Dabing3
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Hanbon Science and Technology Co. Ltd，Huaian 223001，China）

Cordycepin is the major effective component of Cordyceps militaris，which is getting more and more attention for its hygienic and medical effects.In this study，we obtained several strains with high cordycepin yield from Cordycepsmilitaris JN168 by using ion beam，nitrosoguanidine and ion beam-nitrosoguanidine mixed mutation.After further screened，the high yield compound mutation strain 2 was obtained.Furthermore，the liquid medium composition of this strain was optimized for the fermentation of cordycepin.The results showed that the components of optimized medium were as follows：glucose 40 g/L，yeast extract 25 g/L，MgSO4·7H2O 0.6 g/L，K2HPO4·3H2O 0.6 g/L，KH2PO40.6 g/L.With this optimized medium，the yield of cordycepin increased 5 times，reaching 1 045.65 mg/L.

Cordyceps militaris，cordycepin，mutation，liquid fermentation，optimization

TQ 920.1

A

1673—1689（2015）08—0806—08

2014-03-19

國家自然科學基金項目（21275066）。

*通信作者：蔡宇杰（1973—），男，江蘇無錫人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事生物工程方面的研究。E-mail：yjcai@jiangnan.edu.cn