小分子靶標核酸適配體研究進展

王紅旗， 張 玲， 劉冬梅， 王 敏，葛艷靜， 周 玲， 劉繼紅*

（1.河南省農業科學院 農業質量標準與檢測技術研究所，河南 鄭州，450002；2.河南省糧食質量安全與檢測重點實驗室，河南 鄭州450002；3.農業部農產品質量安全風險評估實驗室（鄭州），河南 鄭州450002）

小分子靶標核酸適配體研究進展

王紅旗1，2，3， 張 玲1，2，3， 劉冬梅1，2，3， 王 敏1，2，3，葛艷靜1，2，3， 周 玲1，2，3， 劉繼紅*1，2，3

（1.河南省農業科學院 農業質量標準與檢測技術研究所，河南 鄭州，450002；2.河南省糧食質量安全與檢測重點實驗室，河南 鄭州450002；3.農業部農產品質量安全風險評估實驗室（鄭州），河南 鄭州450002）

核酸適配體是能夠與靶分子高親和力、高特異性結合的單鏈寡核苷酸。目前，在生物傳感、疾病診斷和治療等方面，以核酸適配體作為分子識別元件已經開發了許多具有應用可行性的各種檢測方法。盡管核酸適配體具有這些方面的應用可能性，但是目前能夠結合小分子的核酸適配體非常少。小分子具有多種多樣的生物功能以及臨床、商業價值，因此針對小分子靶標展開研究，開發新型、實用的分子識別探針用于檢測這些小分子具有重要的研究意義。作者主要介紹了針對小分子靶標核酸適配體開發所面臨的技術挑戰，以及在生物傳感和食品安全應用方面所存在的機遇。

核酸適配體；小分子；食品安全；生物傳感；指數富集配基系統進化技術

1 核酸適配體與指數富集配基系統進化技術（SELEX）

1.1 核酸適配體與SELEX技術

20多年前，研究人員利用人工合成的方法獲得了一段能夠特異性結合靶標分子的RNA片段，即“核酸適配體”，從而徹底革新了人們對分子識別事件的傳統認識[1-2]。核酸適配體既可以是RNA也可以是DNA，廣泛應用在食品安全檢測中作為危害因子的特異性分子識別元件，在物質分離富集過程中作為能夠與靶目標發生特異性結合的配基以及在醫學上用于臨床診斷和治療。相對于傳統的分子識別元抗體來說，核酸適配體具有自身的優勢[3]：靶標范圍非常廣泛——從金屬離子、有機小分子、蛋白質到病毒甚至細胞；靶標沒有免疫原性或免疫原性低，可以是毒性靶標；篩選過程不依賴生物體，無需在生理條件下進行；可體外人工合成——成本低廉、批次間差異小、純度高、化學穩定性和熱穩定性高；易于化學修飾和標記。

相對于其他人工合成的分子識別元件如分子印跡聚合物（Molecular Imprinted Polymers，MIPs）來說，核酸適配體選擇性更高，因此其在生物傳感和食品安全應用方面顯示出廣闊的應用前景。當然，核酸適配體也不是完美無瑕的，與抗體或MIPs不同的是，核酸適配體的三級結構與檢測方法所采用的分析條件緊密相關，在血液中很容易降解；與抗體相比，核酸適配體的化學多樣性略顯不足。然而，目前這些問題部分已經得以解決，比如可以通過化學修飾來提高核酸適配體的核酸酶耐受性或增加可供選擇的核苷酸的多樣性等。

指數富集配基系統進化技術（Systematic Evolution Of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX技術）[3]最早報道于20世紀60年代。隨著現代生物技術的發展，聚合酶鏈反應（PCR）技術、反轉錄酶的提取技術，長片段核酸序列的固相化學合成技術等技術的出現，該技術通過與這些現代生物技術的聯合被廣泛應用。雖然有報道稱一些研究小組對SELEX篩選過程進行了適當的改進，但是SELEX技術的大致流程依然保持不變，大致分為結合、分離、洗脫、放大四個步驟，見圖1。首先通過化學合成構建一個約含有1015個不同序列的單鏈寡核苷酸文庫，將靶標與文庫一起孵育以便于靶標與相應的核酸充分結合，然后通過分離程序將結合與未結合的核酸分離，接著利用洗脫程序將結合的核酸洗脫，最后以這些洗脫的核酸為模板進行PCR擴增并用于下一輪篩選。通過不斷地的結合、分離、洗脫與擴增，一些與靶標不結合或親和力較小以及中親和力的核酸相繼被淘汰，而具有高親和力的核酸適配體逐漸被富集起來。

圖1 SELEX篩選過程示意圖Fig.1 Schematic of SELEX

SELEX技術最大的優點在于其篩選過程中結合條件的多樣性以及文庫設計的靈活性。最早的SELEX技術改進是引入了負相或反相篩選步驟，目的是消除篩選過程中與固相載體或結構相似性化合物有親和力的非特異性結合序列。目前SELEX技術的改進主要包括改變篩選壓力、篩選平臺、篩選文庫以及實現過程的自動化等。文庫的改進包括引入已知功能的固定序列或者增加文庫結構的多樣性，其中文庫的多樣性可以通過初始文庫的設計或者突變PCR來實現。無論哪種改進方式，最終目的都是為了獲得親和力有所改善的核酸適配體或者簡化SELEX的篩選過程。

1.2 識別小分子的核酸適配體

目前，小分子靶標核酸適配體的數量不到核酸適配體總數的1/4，見圖2。

圖2 各類靶標的核酸適配體所占的比例Fig.2 Ratio of all kinds of aptamers

蛋白質和細胞相對分子質量較大的靶標具有較多的功能基團和結構單元，通過特定的核酸序列與靶標之間的氫鍵、靜電及疏水相互作用篩選成功的幾率較大[5]。在發現蛋白質或細胞的核酸適配體更容易篩選出來后，針對小分子靶標核酸適配體篩選工作變得越來越少，但是篩選小分子靶標核酸適配體仍然具有很大的吸引力，因為小分子靶標在許多生物過程中扮演著重要的角色。小分子靶標可以是毒素或致癌物等有毒有害物質，也可以是藥物或營養成分等有益物質。生物分析方面，小分子作為細胞信號傳導分子、色素或作為防御機制的一部分具有重要的實際檢測價值，而核酸適配體因易快速制備、經濟適用、尺寸較小、通用性強，在該領域具有巨大的應用前景。但是，相關的小分子靶標要么是生理上微量存在的，要么是受血液或體液中非特異性化合物嚴重污染的，而已知的相關小分子靶標的親和力處于微摩爾至納摩爾的居多，還不足夠強，因此這類基于核酸適配體的小分子靶標分析方法大多需要通過有效的信號放大途徑或工具，如采用納米金、量子點、磁性微球以及各種酶等提高測定方法的靈敏度。在農產品及食品質量安全領域，針對真菌毒素、重金屬離子、農藥殘留等危害因子，結合納米材料在光學、電學等方面表現出的優良特性，開發了許多基于核酸適配體的高靈敏、高特異性快速檢測技術，然而目前這些方法主要是針對基質比較簡單的實際樣品，且多是單一靶標的檢測，有待進一步提高檢測方法的抗復雜基質干擾的能力以及提高方法的檢測通量。在醫藥領域，核酸適配體具有很多潛在的優勢，如易于微型化的構建、快速靈敏、特異性高、成本低廉，在新藥和藥物輸送系統的發展中可以作為診斷治療工具和生物傳感探針，目前這方面的應用瓶頸在于感興趣靶標核酸適配體的篩選以及核酸適配體的半衰期。表1列出了已被表征過的能夠識別小分子靶標DNA核酸適配體。

表1 文獻中已經報道的小分子靶標DNA核酸適配體（截止到2014年）Table 1 DNA aptamers for small molecule target reported in the open literature（upto 2014）

續表1

2 小分子靶標核酸適配體篩選的挑戰

2.1 小分子靶標核酸適配體篩選的理論挑戰

雖然小分子靶標核酸適配體的數量比較少，但相關研究卻最徹底、最廣泛。據過去10年文獻報道的次數，ATP核酸適配體僅次于凝血酶核酸適配體位居第二，可卡因和茶堿的核酸適配體分別位居第五和第七。茶堿RNA核酸適配體是第一例具有極高選擇性的核酸適配體，與茶堿的親和力比跟咖啡因（分子結構上與茶堿只有一個甲基的不同）的親和力強10 000倍，且與茶堿的抗體相比選擇性提高了10倍[42]。普遍認為小分子靶標核酸適配體的親和力較弱，位于低微摩爾到中微摩爾之間，難于滿足大多數傳感器應用的要求。Carothers等[43]研究表明，靶標的相對分子質量與核酸適配體的親和力成正比例關系，該研究結果與其他小組的研究結果一致。然而，茶堿（相對分子質量180）是個例外；最近新篩選到的一些小分子靶標核酸適配體的Kd值也低至納摩爾，如雙酚A[45]和土霉素[46]。另外，“天然適配體”核糖開關也具有很強的親和力，如鳥嘌呤核糖開關的Kd值為5 nmol/L，維生素B1焦磷酸酯的核糖開關的Kd值在皮摩爾范圍 。據此推斷：靶標含有的可旋轉化學鍵越少，其相應的核酸適配體的親和力越高。

20世紀90年代，研究者們曾鼓吹SELEX技術簡單易行、成本低廉、成功率高，促進了一批有關篩選的研究見諸報道。其實SELEX篩選技術相當費時費力，成功率不足30%[47]。此外，幾乎每一個核酸適配體的實際應用都申請了專利，一定程度上限制了核酸適配體篩選的創新。目前，很少有課題組在開發新型小分子靶標核酸適配體上投入過多的時間和資金，特別是考慮到在篩選過程中可能要面臨的技術挑戰。

2.2 小分子靶標核酸適配體篩選的技術挑戰

2.2.1 靶標的固定 分離步驟是SELEX篩選的關鍵。對于蛋白質和細胞等大分子靶標，可以分別采用硝酸纖維素膜和離心、熒光激活細胞分選術（FACS）以及對貼壁細胞進行溫和洗滌等方式實現結合與不結合文庫的分離，不需要對靶標進行化學修飾，有利于獲得自由態靶標的核酸適配體。然而這種經典的篩選方法卻不適用于小分子靶標。小分子靶標核酸適配體篩選的首要困難在于靶標在磁珠、聚合物微球、瓊脂糖等固相基質上的固定。早期的篩選主要基于商品化的固定有靶標的瓊脂糖基質或者采取人工偶聯的方法。偶聯的前提是小分子靶標上必須有可利用的功能團，這種要求往往難以滿足。即使在偶聯可以實現的情況下，大量的柱填裝料會帶來比較嚴重的文庫非特異性吸附問題。另外，對小分子靶標進行化學修飾會導致篩選到能夠結合基質或鏈接臂的核酸適配體的幾率大大增加。如果篩選到的核酸適配體的親和力部分來自與固相基質或者化學修飾基團，那么其實際應用功效則會大大降低。據報道，羅丹明的核酸適配體與自由靶標的結合弱于與固相基質上的靶標[48]。

2.2.2 親和力的測定 （Kd） 親和力的測定是制約小分子靶標核酸適配體快速發展的重要因素。傳統的Kd值測定方法必須固定核酸適配體或者靶標，通過不斷增加另一組分的濃度進行滴定從而產生結合曲線。常用的Kd值測定方法見表2，其中可有效測定小分子靶標核酸適配體Kd值的方法相當少?；诎袠?核酸適配體復合物尺寸動態變化的分離模式檢測技術和基于表面質量敏感型的檢測方法，一般需要將靶標或者核酸適配體固定在表面上。當用于小分子靶標時候，針對將核酸適配體在表面固定進行測定的情況，這類方法的靈敏度面臨考驗，因為小分子靶標結合引起的總體質量變化比較小；將小分子靶標固定在表面上進行測定，又會再一次面臨化學修飾影響親和力的問題。基于構象變換原理的檢測方法雖然可以用于小分子，但不是一種通用的檢測方法，因為并非所有的核酸適配體在與小分子靶標結合時都能發生可量測的構象變換[49]。其他的Kd值測定方法通常要求靶標自身具有熒光或紫外吸收特性，然而實際應用中許多小分子靶標不具備這個特性。新近開發的一些檢測方法如自動化微芯片電泳技術和原子力光譜技術能夠部分克服以上所述難題，但依然缺乏一種通用的小分子靶標核酸適配體親和力測定技術。

表2 核酸適配體Kd的測定方法Table 2 Methods for determining Kd of aptamer

3 小分子靶標核酸適配體的機遇

由于小分子核酸適配體的篩選比較困難，目前已經報道的小分子靶標核酸適配體非常少。然而在生物傳感和化學生物學領域，小分子靶標核酸適配體卻有著廣闊的應用前景。各種天然或人工合成的化合物大都屬于小分子，包括氨基酸、甾族化合物、糖類化合物和核苷酸等，既可以用作治療的藥物、染料、輔酶因子、生理代謝物以及神經遞質等各種有益物質，又可以充當各種有害物質如環境污染物、食品摻雜物、致癌物以及濫用藥物等。隨著小分子生物功能認識的不斷深入，化學合成小分子藥物數量逐漸增多，環境和食品污染物監控需求不斷增加，現在比過去更加迫切需要有效的小分子檢測/監測工具或手段。目前已經報道的基于核酸適配體的小分子檢測方法大都是針對ATP、可卡因或者茶堿三種明星靶標，包括電化學、熒光、比色等檢測方法。這些方法的通用性仍需要其他小分子靶標的驗證。如表1所示，許多核酸適配體序列可以用于小分子生物傳感檢測方法的開發，其中一些小分子靶標與環境監測、農產品以及食品質量安全、醫療診斷密切相關。為此，我們應該加快推進基于核酸適配體的生物傳感技術從概念型走向實用型并用于實際樣品的分析應用。

Li等[67]報道了一種著名的通用型“結構開關型”小分子靶標生物傳感檢測方法，該方法利用了核酸適配體固有的結合特性：既可以結合同源靶標又可以與其互補鏈雜交，核酸雙鏈轉換成靶標-適配體復合物的同時伴隨構象變換，從而將特異性的分子識別事件轉換成可量測的信號（光、電、熱、質量等）。如果核酸適配體與小分子靶標結合時能夠發生較大的構象變化，那么這種檢測策略就相當吸引人，因為它可以避開其他檢測方法在小分子檢測方面所面臨的諸多困難。不管是DNA還是RNA核酸適配體 ，無論是在溶液中還是在界面上 ，都可以采用這種檢測策略。目前該檢測策略已經用于ATP、茶堿、可卡因、組氨酸、OTA、L-精氨酸、絡氨酸、GTP和精氨酸等小分子的檢測。最近有報道將核酸適配體與其他功能序列偶聯嵌合的檢測技術，小分子靶標核酸適配體尤其適合用于偶聯嵌合序列的制備。如將紡錘型核糖酶的一個莖環序列用ATP核酸適配體序列替代，從而可以用ATP來調控核糖酶的活性 ；孔雀石綠（MG）核酸適配體與核黃素單核苷酸核酸（FMN）適配體構成的偶聯體，可以用來檢測FMN。類似的設計還用于ATP和茶堿傳感器的研發。

小分子靶標核酸適配體還是一種重要的研究工具，可用于闡明一些具有重要生理作用的小分子調節關鍵細胞調控回路的作用。例如，我們可以利用小分子靶標核酸適配體干擾細胞內的生理重要性小分子，從而進一步提高對生物體系的認識。Marletta等利用亞鐵血紅素RNA和DNA核酸適配體在細胞內進行表達，利用反饋抑制系統實現了亞鐵血紅素大腸桿菌生物合成的預期調控。小分子靶標核酸適配體還對體內疾病治療藥物的開發起著一定的主導作用。最近有報道稱多巴胺的DNA核酸適配體可用于精神分裂癥潛伏期的動物的治療。

4 展望

小分子靶標核酸適配體在篩選和應用的過程中遭遇了一系列的理論或技術上的挑戰，嚴重制約了其進一步研究和商業化的進程。然而，我們仍需繼續努力不斷拓展小分子靶標核酸適配體的數量和范圍。目前，其研發和應用的瓶頸在于自由態靶標篩選策略的開發及Kd值的測定技術：開發不需要對小分子靶標進行固定或化學修飾的SELEX篩選技術；開發新的真正意義上的Kd值測定方法。理想情況下，Kd值的測定應該在核酸適配體與靶標在溶液中自由結合的情況下進行，以便消除基質引起的非特異性結合。新近出現的核酸適配體數據庫（http：//aptamerbase.semanticscience.org/）包含大量的核酸適配體篩選條件和結合常數測定方法的信息可供查詢。另外，基于核酸適配體的檢測新方法的開發也需要進一步拓寬模型靶標的范圍，不能僅僅局限于幾種明星靶標，應該進一步挖掘已經篩選到核酸適配體的大量未曾開發過的新靶標資源。目前，這種轉變趨勢已經出現，大量的基于赭曲霉毒素A（OTA）的核酸適配體生物傳感器已經報道，如固相親和凈化柱和生物傳感器，并在實際的樣品檢測條件下進行了相應的檢測性能評估?？梢灶A見，隨著代謝組學、藥物開發以及合成生物學等領域的快速發展，小分子靶標核酸適配體的應用很快也將呈現迅猛增長趨勢。

參考文獻：

[1]Tuerk C，Gold L.Systemic evolution of ligands by exponential enrichment：RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase [J].Science，1990，249（4968）：505-510.

[2]Ellington A D，Szostak J W.In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands[J].Nature，1990，346（6287）：818-822.

[3]Jayasena S D.Aptamers：an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics[J].Clinical Chemistry，1999，45（9）：1628-1650.

[4]Ellington A D，Szostak J W.Selection in vitro of single-stranded DNA molecules that fold into specific ligandbinding structures [J].Nature，1992，355（6363）：850-852.

[5]Renaud A，Faverie De La，Hamon F，et al.Nucleic acids targeted to drugs：SELEX against a quadruplex ligand[J].Biochimie，2011，93（8）：1357-1367.

[6]EHuizenga D，Szostak W.A DNA aptamer that binds adenosine and ATP[J].Biochemistry，1995，34（2）：656-665.

[7]Wang L，Liu X，Zhang Q et al，Selection of DNA aptamers that bind to four organophosphorus pesticides[J].Biotechnology Letters，2012，34（5）：869-874.

[8]Harada K，Frankel A D.Identification of two novel arginine binding DNAs[J].EMBO Journal，1995，14（23）：5798-5811.

[9]Xu S，Yuan H，Chen S，et al.Selection of DNA aptamers against polychlorinated biphenyls as potential biorecognition elements for environmental analysis[J].Analytical Biochemistry，2012，423（2）：195-201.

[10]Song K M，Jeong E，Jeon W，et al.Aptasensor for ampicillin using gold nanoparticle based dual fluorescence-colorimetric methods[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry，2012，402（6）：2153-2161.

[11]Li Y，Geye C R r，Sen D.Recognition of anionic porphyrins by DNA aptamers[J].Biochemistry，1996，35（21）：6911-6922.

[12]Chen Xiujuan，Huang Yukun，Duan Nuo，et al.Selection and identification of ssDNA aptamers recognizing zearalenone[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry，2013，405（20）：6573-6581.

[13]Wilson C，J W Szostak.Isolation of a fluorophorespecific DNA aptamer with weak redox activity[J].Chemistry and Biology，1998，5（11）：609-617.

[14]Ma Xiaoyuan，Wang Wenfeng，Chen Xiujuan，et al.Selection，identification，and application of Aflatoxin B1 aptamer[J]. Eoropean Food Research and Technology，2014，238（6）：919-925.

[15]Yang Q，Goldstein I J，Mei H-Y，et al.DNA ligands that bind tightly and selectively to cellobiose[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1998，95（10）：5462-5467.

[16]Renaud A，Faverie De La，Hamon F，et al.Nucleic acids targeted to drugs：SELEX against a quadruplex ligand[J].Biochimie，2011，93（8）：1357-1367.

[17]Kato T，Takemura T，Yano K，et al.In vitro selection of DNA aptamers which bind to cholic acid[J].Biochimica et Biophysica Acta Gene Structure and Expression，2000，1493（1-2）：12-18.

[18]Joeng C B，Niazi J H，S J，et al.ssDNA aptamers that recognize diclofenac and 2-anilinophenylacetic acid[J].Bioorganic and Medicinal Chemistry，2009，17（15）：5380-5387.

[19]Okazawa A，Maeda H，Fukusaki E，et al.In vitro selection of hematoporphyrin binding DNA aptamers[J].Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters，2000，10（23）：2653-2656.

[20]Kim Y S，Hyun C J，Kim I A，et al.Isolation and characterization of enantioselective DNA aptamers for ibuprofen[J].Bioorganic and Medicinal Chemistry，2010，18（10）：3467-3473.

[21]Vianini E，Palumbo M，Gatto B.In vitro selection of DNA aptamers that bind L-tyrosinamide[J].Bioorganic and Medicinal Chemistry，2001，9（10）：2543-2548.

[22]Masud M M，Kuwahara M，Ozaki H，et al.Sialyllactose-binding modified DNA aptamer bearing additional functionality by SELEX[J].Bioorganic and Medicinal Chemistry，2004，12（5）：1111-1120，

[23]Mann D，Reinemann C，Stoltenburg R，et al.In vitro selection of DNA aptamers binding ethanolamine[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2005，338（4）：1928-1934，

[24]He J，Liu Y，Fan M，et al.Isolation and identification of the DNA aptamer target to acetamiprid[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59（5）：1582-1586.

[25]Shoji A，Kuwahara M，Ozaki H，et al.Modified DNA aptamer that binds the（R）-isomer of a thalidomide derivative with high enantioselectivity[J].Journal of the American Chemical Society，2007，129（5）：1456-1464.

[26]Song K M，Cho M，Jo H，et al.Gold nanoparticle-based colorimetric detection of kanamycin using a DNA aptamer[J].Analytical Biochemistry，2011，415（2）：175-181.

[27]Sando S，Narita A，Aoyama Y.Light-up Hoechst-DNA aptamer pair：generation of an aptamer-selective fluorophore from a conventional DNA-staining dye[J].Chem Bio Chem，2007，8（15）：1795-1803.

[28]Yang X，Bing T，Mei H，et al.Characterization and application of a DNA aptamer binding to l-tryptophan[J].Analyst，2011，136（3）：577-585.

[29]Kim Y S，Jung H S，Matsuura T，et al.Electrochemical detection of 17β-estradiol using DNA aptamer immobilized gold electrode chip[J].Biosensors and Bioelectronics，2007，22（11）：2525-2531.

[30]Jo M，Ahn J Y，Lee J，et al.Development of singlestranded DNA aptamers for specific bisphenol a detection[J]. Oligonucleotides，2011，21（2）：85-91.

[31]Hayashi G，Hagihara M，Dohno C，et al.Photoregulation of a peptide-RNA interaction on a gold surface[J].Journal of the American Chemical Society，2007，129（28）：8678-8679.

[32]Barthelmebs L，Jonca J，Hayat A et al.Enzyme-Linked Aptamer Assays（ELAAs），based on a competition format for a rapid and sensitive detection of Ochratoxin A in wine[J].Food Control，2011，22（5）：737-743.

[33]Niazi J H，Lee S J，M B Gu.Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines[J].Bioorganic and Medicinal Chemistry，2008，16（15）：7245-7253.

[34]Cruz-Aguado J A，Penner G.Determination of ochratoxin A with a DNA aptamer[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56（22）：10456-10461.

[35]Ohsawa K，Kasamatsu T，Nagashima J I，et al.Argininemodified DNA aptamers that show enantioselective recognition of the dicarboxylic acid moiety of glutamic acid[J].Analytical Sciences，2008，24（1）：167-172.

[36]Walsh R，DeRosa M C.Retention of function in the DNA homolog of the RNA dopamine aptamer[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2009，388（4）：732-735.

[37]Wochner A，Menger M，Orgel D，et al.A DNA aptamer with high affinity and specificity for therapeutic anthracyclines[J]. Analytical Biochemistry，2008，373（1）：34-42.

[38]Miyachi Y，Shimizu N，Ogino C，et al.Selection of a DNA aptamer that binds 8-OHdG using GMP-agarose[J].Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters，2009，19（13）：3619-3622.

[39]Rink S M，Shen J C，Loeb L A.Creation of RNA molecules that recognize the oxidative lesion 7，8-dihydro-8-hydroxy-2-deoxyguanosine（8-oxodG）in DNA[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1998，95（20）：11619-11624.

[40]Mehta J，Rouah-Martin E，Van Dorst B，et al.Selection and characterization of PCB-binding DNA aptamers[J].Analytical Chemistry，2012，84（3）：1669-1676.

[41]Niazi J H，Lee S J，Kim Y S，et al.ssDNA aptamers that selectively bind oxytetracycline [J].Bioorg Med Chem，2008，16：1254-1261.

[42]Jenison R D，Gill S C，A Pardi，et al.Highresolution molecular discrimination by RNA[J].Science，1994，263（5152）：1425-1429. [43]Carothers J M，Goler J A，Kapoor Y，et al.Selecting RNA aptamers for synthetic biology：investigating magnesium dependence and predicting binding affinity[J].Nucleic Acids Research，2010，38（8）：2736-2747.

[44]Pfeffer P，H Gohlke.Drug Score RNA—knowledge based scoring function to predict RNA—Ligand interactions[J].Journal of Chemical Information and Modeling，2007，47（5）：1868-1876.

[45]M Jo，Ahn J Y，Lee J，et al.Development of singlestranded DNA aptamers for specific bisphenol a detection[J]. Oligonucleotides，2011，21（2）：85-91.

[46]Niazi J H，Lee S J，Kim Y S，et al.Development of single-stranded DNA aptamers for specific bisphenol A detection[J].Bioorg Med Chem，2008，16：1254-1261.

[47]Gold L，Ayers D，Bertino J，et al.Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery[J].PLoS One，2010，5（12）：15004.

[48]Wilson C，J W Szostak.Isolation of a fluorophorespecific DNA aptamer with weak redox activity[J].Chemistry and Biology，1998，5（11）：609-617.

[49]White R J，Rowe A A，Plaxco K W，et al.Re-engineering aptamers to support reagentless，self-reporting electrochemical sensors [J].Analyst，2010，135（3）：589-594.

[50]Flinders J，DeFina S C，Brackett DM，et al.Recognition of planar and nonplanar ligands in the malachite green—RNA aptamer complex[J].Chem Bio Chem，2004，5（1）：62-72.

[51]Cruz-Aguado J A，Penner G，Fluorescence polarization based displacement assay for the determination of small molecules with aptamers[J].Analytical Chemistry，2008，80（22）：8853-8855.

[52]Guedin A，Lacroix L，Mergny J L，et al.Thermal melting studies of ligand DNA interactions[J].Methods in Molecular Biology，2010，613：25-35.

[53]Lin P，Chen R，Lee C，et al.Studies of the binding mechanism between aptamers and thrombin by circular dichroism，surface plasmon resonance and isothermal titration calorimetry[J].Colloids and Surfaces B，2011，88：552-558.

[54]Yang C，Lates V，Prieto-Sim'on B，et al.Aptamer-DNAzyme hairpins for biosensing of Ochratoxin A [J].Biosensors and Bioelectronics，2012，32：208-212.

[55]Y Sultan，R Walsh，C Monreal，et al.Preparation of functional aptamer films using layer-by-layer selfassembly[J]. Biomacromolecules，2009，10（5）：1149-1154.

[56]Deng Q，German I，Buchanan D，et al.Retention and separation of adenosine and analogues by affinity chromatography with an aptamer stationary phase[J].Analytical Chemistry，2001，73（22）：5415-5421.

[57]Hu J，Easley C.A simple and rapid approach for measurement of dissociation constants of DNA aptamers against proteins and small molecules via automated microchip electrophoresis[J].Analyst，2011，136（17）：3461-3468.

[58]Drabovich A P，Berezovski M，Okhonin V，et al.Selection of smart aptamers by methods of kinetic capillary electrophoresis[J]. Analytical Chemistry，2006，78（9）：3171-3178.

[59]Bao J，Krylova S M，Reinstein O，et al.Label-free solution-based kinetic study of aptamer small molecule interactions by kinetic capillary electrophoresis with UV detection revealing how kinetics control equilibrium[J].Analytical Chemistry，2011，83：8387-8390.

[60]Turgeon R T，Fonslow B R，M Jing，et al.Measuring aptamer equilibria using gradient micro free flow electrophoresis[J]. Analytical Chemistry，2010，82（9）：3636-3641.

[61]Hall B，S Arshad，K Seo，et al.In vitro selection of RNA aptamers to a protein target by filter immobilization[J].Current Protocols in Molecular Biology，2009，88：2431-24327.

[62]Baaske P，Wienken C J，Reineck P，et al.Optical thermophoresis for quantifying the buffer dependence of aptamer binding[J]. Angewandte Chemie，2010，49（12）：2238-2241.

[63]Potty A S R，Kourentzi K，H Fang，et al.Biophysical characterization of DNA aptamer interactions with vascular endothelial growth factor[J].Biopolymers，2009，91（20）：145-156.

[64]Girolamo A De，McKeague M，Miller J D，et al.Determination of ochratoxin A in wheat after clean-up through a DNA aptamer-based solid phase extraction column[J].Food Chemistry，2011，127（3）：1378-1384.

[65]Regulski E E，Breaker R R.In-line probing analysis of riboswitches[J].Methods in Molecular Biology，2008，419：53-67.

[66]McManus S A，Y Li.Multiple occurrences of an efficient self-phosphorylating deoxyribozyme motif[J].Biochemistry，2007，46（8）：2198-2204.

[67]Nutiu R，Li Y.Structure-switching signaling aptamers[J].Journal of the American Chemical Society，2003，125（16）：4771-4778.

Research Progress of Aptamer for Small Molecule Target

WANG Hongqi1，2，3， ZHANG Ling1，2，3， LIU Dongmei1，2，3， WANG Min1，2，3，
GE Yanjing1，2，3， ZHOU Ling1，2，3， LIU Jihong*1，2，3
（1.Institute of Quality Standards and Testing Teclmology for Agro-Products，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China；2.Henan Key Laboratory of Grain Quality and Safety and Testing，Zhengzhou 450002，China；3.Laboratory of Quality&Safety Risk Assessment for Agro-Products（Zhengzhou），Ministry of Agriculture，Zhengzhou 450002，China）

Aptamer as a single-stranded oligonucleotide can bind to target with high affinity and selectivity.Although many viable approaches for biosensing，diagnostics，and therapeutics have emerged，relatively few aptamers binding to small molecules exist.Small molecules are very important targets with diverse biological functions and clinical and co mMercial uses.Therefore，developing novel and effective molecular recognition probes for these compounds are greatly interesting.This paper will highlight various challenges during aptamer development relative to smallmolecule targets，as well as opportunities for their application in biosensing and food safety.

aptamer，small molecule，food safety，biosensor，SELEX

Q527

A

1673—1689（2015）08—0790—09

2014-07-28

國家自然科學基金項目（21305031）；國家公益性行業（農業）項目（201203094）；河南省科技攻關項目（122102310048）。

王紅旗（1979—），男，河南鄭州人，理學博士，副研究員，主要從事農產品質量安全檢測技術方面的研究。E-mail：huda2000@126.com

*通信作者：劉繼紅（1976—），女，河南鄭州人，理學博士，副研究員，主要從事農產品質量安全檢測技術及農產品風險評估方面的研究。E-mail：ljha3100@163.com