熟地黃對急性血瘀癥大鼠血液流變性和凝血功能的改善作用

劉若軒，李常青，鄧志軍，郭潔文，李麗明，齊耀群，李阿榮

(1.廣州市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州510130；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣東廣州510405)

熟地黃對急性血瘀癥大鼠血液流變性和凝血功能的改善作用

劉若軒1，李常青2，鄧志軍1，郭潔文1，李麗明1，齊耀群1，李阿榮1

(1.廣州市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州510130；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣東廣州510405)

目的研究熟地黃水提物對急性血瘀癥大鼠血液流變性和凝血功能的改善作用。方法以腎上腺素結(jié)合冰水浴建立大鼠急性血瘀癥模型，給予不同劑量的熟地黃水提物，測定血液流變學(xué)及凝血功能的相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果與模型組比較，大鼠給予熟地黃水提物中、高劑量組能顯著降低血液流變學(xué)相關(guān)指標(biāo)，延長凝血酶時(shí)間、凝血活酶時(shí)間和凝血酶原時(shí)間，降低纖維蛋白原含量。結(jié)論熟地黃水提物通過降低紅細(xì)胞壓積和紅細(xì)胞沉積、縮短血小板聚集時(shí)間、延長凝血酶時(shí)間和降低纖維蛋白原含量，改善急性血瘀癥大鼠的血液流變性和凝血功能。

熟地黃；血瘀；血液流變性；凝血功能

脈復(fù)生是廣州市中醫(yī)醫(yī)院研制并用于治療血栓閉塞性脈管炎(TAO)的特色中藥制劑，臨床實(shí)踐與既往藥效試驗(yàn)均證實(shí)其對TAO效果顯著[1-2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)脈復(fù)生中的熟地黃成分具有抗炎作用，應(yīng)與其阻斷ERK1/2和NF-κB的信號通路、促進(jìn)活化的巨噬細(xì)胞炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)。本研究通過大劑量皮下注射腎上腺素結(jié)合冰水浴建立大鼠急性血瘀癥模型，觀察熟地黃水提物對模型大鼠血液流變性及凝血功能的影響，為闡明脈復(fù)生的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

熟地黃，購于廣州至信藥業(yè)有限公司，批號150101，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)李常青研究員鑒定為玄參科植物地黃(Rehmannia glutinosa Libosch.)經(jīng)炮制加工而成，符合《中華人民共和國藥典》(2010 版)項(xiàng)下規(guī)定；鹽酸腎上腺素注射液，無錫濟(jì)民可信禾藥業(yè)股份有限公司，批號130630；阿司匹林腸溶片，河南天地藥業(yè)股份有限公司，批號140205；枸櫞酸鈉，天津富宇化學(xué)試劑有限公司，批號03121201。

1.2 試劑

凝血酶時(shí)間(TT)試劑盒、凝血活酶時(shí)間(APTT)試劑盒、凝血酶原時(shí)間(PT)試劑盒、血漿纖維蛋白原(Fib)試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司，余為市售分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級SD大鼠60只，雄性，體質(zhì)量180～220 g，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2013-0020。

1.4 儀器

LG-PABER-1型血小板聚集凝血因子分析儀(北京世帝科學(xué)儀器公司)；Coulter-TT血常規(guī)測定儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；LBY-BX2紅細(xì)胞變形儀(北京普利生儀器有限公司)；LG-R-80B型血液黏度儀、EHK-40紅細(xì)胞沉降壓積儀(天津市亞坤電子科技發(fā)展有限公司)；LBY-N6C全自動(dòng)血液黏度儀(北京普利生儀器有限公司)；KDC-220HR高速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司)。

2 方法

2.1 熟地黃水提物的制備

將熟地黃適量加3倍量水浸泡后常規(guī)煎煮2次，合并濾液，濃縮至含生藥1 g/mL的供試藥液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 分組給藥

60只SD大鼠隨機(jī)分為6組:空白對照組(等容積生理鹽水)、模型組(等容積生理鹽水)、陽性對照組(阿司匹林腸溶片0.1 g/kg)、熟地黃水提物低、中、高劑量組(按生藥量計(jì)分別為1、2、4 g/kg)。2.3 大鼠急性血瘀證模型的制備[4]

大鼠給予鹽酸腎上腺素注射液0.8 mg/kg，共2次，間隔時(shí)間為4 h。第1次皮下給予鹽酸腎上腺素注射液0.8 mg/kg 2 h后，將大鼠置于0～2℃冰水浴中游泳4 min，造成大鼠急性血瘀癥模型。第2次皮下注射鹽酸腎上腺素后大鼠禁食不禁水，12 h后腹主動(dòng)脈取血測血液流變學(xué)和凝血功能相關(guān)指標(biāo)。

2.4 紅細(xì)胞沉降率及紅細(xì)胞壓積測定

10%(φ)水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，以3.8%枸櫞酸鈉1∶9抗凝，吸取1 mL全血置于壓積管中靜置1 h并讀數(shù)記錄紅細(xì)胞沉降率(ESR)，然后12 000 r/min離心10 min，讀數(shù)記錄紅細(xì)胞壓積(HCT)。

2.5 全血黏度和血漿黏度的測定

取枸櫞酸鈉抗凝血0.8 mL，血漿使用LG-R-80B電腦血液黏度測試儀測定全血黏度(WBV)；另取全血于3 000 r/min離心15 min，吸取血漿，使用LG-R-80B電腦血液黏度測試儀測定血漿黏度。

2.6 血小板凝聚率(PAR)測定

取枸櫞酸鈉抗凝血2 mL，1 000 r/min離心10 min，制備富血小板血漿，再以3 500 r/min離心10 min，制備貧血小板血漿，調(diào)節(jié)血小板密度約2.5× 108/mL，以終濃度5 μmol/L的ADP為血小板凝聚誘導(dǎo)劑，采用比濁法于37℃測定1、5 min血小板凝聚率及5 min內(nèi)血小板最大凝聚率，按下列公式計(jì)算血小板聚集抑制率:血小板聚集抑制率＝(模型組血小板聚集率—給藥組血小板聚集率)/模型組血小板聚集率×100%。

2.7 TT、APTT、PT和Fib含量的測定

取枸櫞酸鈉抗凝1 mL，3 500 r/min離心15 min，取上層血漿，按試劑盒說明方法于37℃測定APTT、TT、PT和Fib的含量。

2.8 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 熟地黃水提物對急性血瘀大鼠HCT和ESR的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠的HCT和ESR明顯增加(P＜0.01)，提示造模成功；與模型組比較，熟地黃水提物低、中、高劑量組均可顯著降低HCT (P＜0.05或P＜0.01)，中、高劑量組能顯著降低ESR (P＜0.05或P＜0.01)。見表1。

3.2 熟地黃水提物對急性血瘀大鼠全血黏度和血漿黏度的影響

如表2所示，與空白對照組比較，模型組全血測定切變率在200、100、50、1/s下的全血黏度及血漿黏度明顯增高；與模型組比較，熟地黃水提物中、高劑量均可顯著降低上述各切變率下的全血黏度及血漿黏度。

3.3 熟地黃水提物對急性血瘀大鼠PAR的影響

如表3所示，與空白對照組比較，模型組大鼠的PAR明顯增加；與模型組比較，熟地黃水提物中、高劑量組均可顯著降低PAR。

3.4 熟地黃水提物對急性血瘀大鼠TT、APTT、PT和Fib含量的影響

如表4可見，與空白對照組比較，模型組的TT、APTT、PT顯著縮短，F(xiàn)ib含量顯著升高；與模型組比較，熟地黃水提物中、高劑量組均能顯著延長TT、APTT、PT，F(xiàn)ib含量顯著降低。

表1 熟地黃水提物對急性血瘀大鼠紅細(xì)胞壓積和紅細(xì)胞沉降率的影響Table 1 Effect of the aqueous extract of prepared Radix Rehmanniae on haematocrit and erythrocyte sedimentation rate in acute blood-stasis rats(±s，n＝10)

表1 熟地黃水提物對急性血瘀大鼠紅細(xì)胞壓積和紅細(xì)胞沉降率的影響Table 1 Effect of the aqueous extract of prepared Radix Rehmanniae on haematocrit and erythrocyte sedimentation rate in acute blood-stasis rats(±s，n＝10)

與空白對照組比較:??P＜0.01；與模型組比較:＃P＜0.05，＃＃P ＜0.01。

組別 劑量/ (g·kg－1) ESR/ (mm·h－1) HCT/%空白對照組 － 57.2±1.24 0.32±0.14模型組 － 62.4±0.65??0.89±0.19??阿司匹林組 0.1 57.7±0.11＃＃0.41±0.05＃＃熟地黃水提物低劑量組 1 61.2±0.99 0.77±0.11＃中劑量組 2 60.2±0.24＃0.62±0.06＃＃高劑量組 4 58.3±0.39＃＃0.55±0.17＃＃

表2 熟地黃水提物對急性血瘀大鼠全血黏度和血漿黏度的影響Table 2 Effect of the aqueous extract of prepared Radix Rehmanniae on whole blood viscosity and blood plasma viscosity in acute blood-stasis rats(±s，n＝10)

表2 熟地黃水提物對急性血瘀大鼠全血黏度和血漿黏度的影響Table 2 Effect of the aqueous extract of prepared Radix Rehmanniae on whole blood viscosity and blood plasma viscosity in acute blood-stasis rats(±s，n＝10)

與空白對照組比較:??P＜0.01；與模型組比較:＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別 劑量/ (g·kg－1)全血黏度/(mPa·s) 200/s 100/s 50/s 10/s血漿黏度/(mPa·s) 50/s空白對照組 － 3.6±0.03 3.9±0.27 5.3±0.14 22.1±1.42 1.32±0.09模型組 － 4.9±0.34??5.2±0.17??7.1±0.32??29.7±0.96??1.63±0.17??阿司匹林組 0.1 3.8±0.0.15＃＃4.1±0.09＃＃5.6±0.25＃＃23.2±0.79＃＃1.36±0.11＃＃熟地黃水提物低劑量組 1 4.8±0.21 4.9±0.12＃6.9±0.41 27.2±1.13＃1.59±0.08＃中劑量組 2 4.5±0.19＃＃4.6±0.26＃＃6.6±0.37＃25.4±1.21＃＃1.45±0.05＃＃高劑量組 4 4.2±0.07＃＃4.3±0.31＃＃6.0±0.08＃＃23.9±2.32＃＃1.37±0.02＃＃

表3 熟地黃水提物對急性血瘀大鼠PAR的影響Table 3 Effect of the aqueous extract of prepared Radix Rehmanniae on platelet aggregation rate in acute blood-stasis rats(±s，n＝10)

表3 熟地黃水提物對急性血瘀大鼠PAR的影響Table 3 Effect of the aqueous extract of prepared Radix Rehmanniae on platelet aggregation rate in acute blood-stasis rats(±s，n＝10)

與空白對照組比較:??P＜0.01；與模型組比較:＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別 劑量/ (g·kg－1) PAR/% 1 min 5 min凝聚抑制率/%空白對照組 － 20.2±2.37 21.7±1.94 －模型組 － 39.4±4.92??37.4±2.15??－阿司匹林組 0.1 25.7±3.19＃＃22.1±1.36＃＃49.9熟地黃水提物低劑量組 1 37.1±4.32 36.3±2.91 11.7中劑量組 2 35.6±1.96＃31.2±2.25＃＃24.2高劑量組 4 31.9±3.21＃＃28.9±1.72＃＃31.9

表4 熟地黃水提物對急性血瘀大鼠TT、APTT、PT及Fib的影響Table 4 Effect of the aqueous extract of prepared Radix Rehmanniae on thrombin time，the activated partial thromboplastin time，prothrombin time and fibrinogen in acute blood-stasis rats(±s，n＝10)

表4 熟地黃水提物對急性血瘀大鼠TT、APTT、PT及Fib的影響Table 4 Effect of the aqueous extract of prepared Radix Rehmanniae on thrombin time，the activated partial thromboplastin time，prothrombin time and fibrinogen in acute blood-stasis rats(±s，n＝10)

與空白對照組比較:??P＜0.01；與模型組比較:＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別 劑量/(g·kg－1) t(TT)/s t(APTT)/s t(PT)/s ρ(Fib)/(g·L－1)空白對照組 － 32.1±2.35 23.1±2.19 19.6±1.27 3.2±0.21模型組 － 24.7±1.32??15.4±1.72??12.3±1.32??8.5±0.32??阿司匹林組 0.1 29.2±0.97＃＃21.9±2.21＃＃17.9±1.25＃＃4.1±0.10＃＃熟地黃水提物低劑量組 1 25.5±2.85 16.1±0.97 13.7±0.23 8.2±0.23中劑量組 2 26.3±0.69＃17.4±1.02＃15.2±0.21＃7.1±0.42＃高劑量組 4 27.1±1.07＃19.2±2.12＃＃16.8±0.19＃6.2±0.65＃＃

4 討論

血瘀主要是指各種致瘀因素，如氣滯、氣虛、痰凝、寒凝、血熱和外傷等導(dǎo)致血行不暢、脈道壅塞而引起的病證，同時(shí)伴有全血黏度、紅細(xì)胞壓積升高、體外血栓形成的干濕量及長度增加，抑或影像學(xué)顯示血管狹窄、閉塞或血流阻滯、血小板聚集性或血液流變性等理化指標(biāo)異常提示循環(huán)瘀滯。血瘀證動(dòng)物模型的建立一般采取仿照病因病機(jī)造模以及重復(fù)病理過程造模[5]。本實(shí)驗(yàn)仿氣滯所致血瘀，根據(jù)人在暴怒時(shí)機(jī)體分泌大量腎上腺素的特點(diǎn)，給予大鼠高劑量腎上腺素模擬暴怒狀態(tài)，后以冰水浸泡模擬寒邪侵襲，使機(jī)體迅速復(fù)制成濃、黏、凝、聚狀態(tài)的血瘀證模型，結(jié)果可見模型大鼠的血液流變性等理化指標(biāo)異常，提示循環(huán)瘀滯，再次體現(xiàn)了該證的臨床表征[6]。

研究[7-8]證實(shí)血液流變性及凝血功能的異常是急性血瘀癥的重要病理表現(xiàn)，其主要影響因素是Fib升高引起分子間牽連增大了血液黏度，而橋聯(lián)作用又進(jìn)一步增高紅細(xì)胞的聚集性，加重血液黏度。血液流變性的改變在TAO及周圍血管閉塞性病變中作用重要，APTT、PT和TT是檢測內(nèi)、外源性凝血和凝血共同通路變化的主要篩選指標(biāo)，其中TT與Fib呈負(fù)相關(guān)，TT縮短，F(xiàn)ib含量相應(yīng)升高。

熟地黃是我院院內(nèi)制劑脈復(fù)生合劑的主要成分，具有活血化瘀而不傷血的功效，主要應(yīng)用于免疫和心血管系統(tǒng)，具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力、促進(jìn)造血、抗突變等作用[9]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)熟地黃水提物中、高劑量組可降低紅細(xì)胞聚集及紅細(xì)胞壓積，推測應(yīng)與其抑制血小板凝聚率、延長凝血酶時(shí)間、降低纖維蛋白原的含量以改善血漿黏度有關(guān)。下一步將從其改善血液流變性及凝血功能的分子機(jī)制方面進(jìn)行深入研究，為闡明脈復(fù)生的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及治療作用機(jī)制、提高用藥的安全性提供科學(xué)依據(jù)。

[1]李順寧.脈復(fù)生對動(dòng)脈硬化閉塞癥患者血脂及炎癥細(xì)胞因子的影響[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2011，32(11):19-21. [2]杜猛，尹紅.脈復(fù)生對脈管炎患者免疫功能的調(diào)節(jié)作用[J].湖北中醫(yī)雜志，2012，34(5):46-47.

[3]HAN Yunkyung，JUNG H W，LEE J Y，et al.2，5-Dihydroxyacetophenone isolated from Rehmanniae Radix Preparata inhibits inflammatory responses in lipopolysaccharidestimulated RAW264.7 macrophages[J].J Med Food，2012，15 (6):505-510.

[4]李偉霞，黃美艷，唐于平，等.大鼠急性血瘀模型造模方法的研究與評價(jià)[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(16):1761-1764.

[5]郭強(qiáng)中，李云英.血瘀證研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，14(8):45-50.

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[7]張可，馬旭，韓淑燕，等.人參總皂苷與丹參總酚酸配伍對急性血瘀大鼠血液流變性的改善作用[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2012，26(5):641-645.

[8]蔣品，肖春潔.凝血項(xiàng)中纖維蛋白原和凝血酶時(shí)間檢測結(jié)果相關(guān)性的分析[J].實(shí)用醫(yī)技雜志，2008，15(2):189-190.

[9]李鵬飛，苗明三.熟地黃的現(xiàn)代研究及應(yīng)用現(xiàn)狀分析[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，29(2):252-254.

(責(zé)任編輯:幸建華)

LIU Ruoxuan1，LI Changqing2，DENG Zhijun1，GUO Jiewen1，LI Liming1，QI Yaoqun1，LI Arong1
(1.Department of Pharmacy，Guangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510130，China；2.Institute of Tropical Medicine，Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China)

ObjectiveTo study the effect of the aqueous extract of prepared Radix Rehmanniae on hemorheology and coagulation in acute blood-stasis rats.MethodsModel rats with acute blood-stasis were established by epinephrine combined with ice water bath，and the parameters of hemorheology and coagulation were measured after given different doses of the aqueous extract of prepared Radix Rehmanniae.ResultsCompared with the model group，the hemorheology indexes were decreased significantly，the activated partial thromboplastin time(APTT)，prothrombin time(PT)and thrombin time(TT)were prolonged and plasma fibrinogen was reduced in the prepared Radix Rehmanniae groups with middle and high dosages.ConclusionThe aqueous extract of prepared Radix Rehmanniae improves hemorheology and coagulation in acute bloodstasis rats through reducing haematocrit(HCT)and erythrocyte sedimentation rate(ESR)，shortening the platelet aggregation time，prolonging thrombin time and reducing the content of fibrinogen.

Radix Rehmanniae Preparata；blood-stasis；hemorheology；blood coagulation function

R285.5

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.014

1006-8783(2015)05-0621-04

2015-05-11

廣東省中醫(yī)藥局基金(20151065，20141227)；廣州市中醫(yī)藥和中西醫(yī)結(jié)合科技項(xiàng)目(20152A011011，20142A011012)

劉若軒(1984—)，男，學(xué)士，主管藥師，主要從事抗代謝綜合征的天然藥物開發(fā)，Email:lrx1221＠163.com；通信作者:郭潔文(1968—)，女，主任藥師，博士生導(dǎo)師，主要從事天然藥物開發(fā)，Email:guo774＠sina.com。

時(shí)間:2015-09-29 15:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150929.1538.002.html

Effect of the prepared Radix Rehmanniae on hemorheology and coagulation in acute blood-stasis rats