多波長HPLC梯度洗脫法同時測定菠白散中4種成分含量

王堅，徐菁，李鵬，朱軍

(1.湖北醫藥學院附屬東風醫院藥學部，十堰 442008；2.湖北醫藥學院藥物分析與篩選研究所，十堰 442008)

多波長HPLC梯度洗脫法同時測定菠白散中4種成分含量

王堅1，2，徐菁1，2，李鵬1，2，朱軍1，2

(1.湖北醫藥學院附屬東風醫院藥學部，十堰 442008；2.湖北醫藥學院藥物分析與篩選研究所，十堰 442008)

目的 建立同時測定菠白散中肉桂酸、1，4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯(militarine)、二去氫對葉百部堿和氧化對葉百部堿含量的方法。方法 采用多波長高效液相(HPLC)梯度洗脫法，Hypersil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速：0.9 mL·min-1；流動相A為甲醇-乙腈(3：2)，流動相B為0.1%磷酸溶液；檢測波長λ1=285 nm(肉桂酸)，λ2=223 nm(militarine)，λ3=237 nm(二去氫對葉百部堿和氧化對葉百部堿)。結果 肉桂酸在0.014 2～0.284 0 μg(r=0.999 2)、militarine在0.235 6～4.712 0 μg(r=0.999 7)、二去氫對葉百部堿在0.018 8～0.376 0 μg(r=0.999 5)、氧化對葉百部堿在0.027 4～0.548 0 μg(r=0.999 8)范圍內，均呈良好的線性關系；肉桂酸、militarine、二去氫對葉百部堿和氧化對葉百部堿的平均加樣回收率分別為96.92%，98.57%，98.06%，97.66%，RSD(n=6)分別為0.84%，1.23%，1.24%，0.76%。結論 該方法簡便、準確、靈敏、重復性好，可作為菠白散的含量控制方法。

菠白散；肉桂酸；1，4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯；二去氫對葉百部堿；氧化對葉百部堿

菠白散處方源自國家藥品標準中藥成方制劑第十冊，內容物為灰白色的粉末；味甘、辛、微苦。由白及、百部和菠菜子3味藥物組成，具有潤肺、祛痰功效，是治療痰中帶血、午后發熱、咳嗽等癥狀的首選藥物之一。原質量標準中僅對藥物的性狀進行了規定，未對處方中的任何藥物進行定性或定量測定[1-2]，難以確保產品質量和療效。筆者采用多波長HPLC梯度洗脫法對白及中的肉桂酸、1，4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異丁基蘋果酸酯(militarine)和百部中的二去氫對葉百部堿、氧化對葉百部堿等4種成分進行含量測定方法研究，為完善該制劑質量標準提供依據。多波長高效液相(HPLC)梯度洗脫法具有適用范圍廣、快速、檢驗費用低等優點，已逐漸應用于多成分的同時測定。本方法穩定性好、精密度高，可作為菠白散的質量控制方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200 高效液相色譜儀(G1311A四元泵、G1330B自動進樣器恒溫器、G1322A脫氣機、Chemstation色譜工作站、G1315B可變波長檢測器)；梅特勒電子天平(型號：XP205，感量：0.01 mg)。

1.2 試藥 肉桂酸對照品購于中國食品藥品檢定研究院(批號：110786-200503，含量：100%，置五氧化二磷減壓干燥器中干燥12 h后使用)；二去氫對葉百部堿對照品購于上海遠慕生物科技有限公司(批號：106861-40-9，含量：98.0%)；氧化對葉百部堿購于上海順勃生物工程技術有限公司(批號：20675-62-1，含量：98.0%)；militarine對照品購于上海田源生物技術有限公司(批號：E-0847，含量：98.0%)；菠白散(市售；規格：每袋裝10 g；批號：140203，140204，140205)；陰性對照實驗所用藥材均購于武漢市神草中藥飲片有限責任公司，經檢驗均符合各自藥材國家標準要求；甲醇、乙腈(色譜純，湖北杜克化學科技有限公司)；磷酸(分析純，天津市凱通化學試劑有限公司)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：依利特 Hypersil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速為0.9 mL·min-1；流動相A為甲醇-乙腈(3：2)，流動相B為0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫(0～26 min，28.0%A；26～42 min，28.0%→42.0%A；42～52 min，42.0%→50.0%A；52～60 min，50.0%→28.0%A)[3-7]；檢測波長[0～26 min，λ1=285 nm(肉桂酸)[8]；26～42 min，λ2=223 nm(militarine)[9-10]；42～60 min，λ3=237 nm(二去氫對葉百部堿和氧化對葉百部堿)[11]]；柱溫為室溫。此系統條件下所測組分與其他組分分離效果良好，理論塔板數按各組分計均不得低于2 500，分離度均>2.0。

2.2 樣品制備

2.2.1 混合對照品溶液配制 分別精密稱取肉桂酸、二去氫對葉百部堿和氧化對葉百部堿各適量，分別置于3個20 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，再分別精密吸取上述溶液各2 mL置于50 mL量瓶中，加入精密稱定后的militarine對照品適量，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液(肉桂酸為0.014 2 mg·mL-1，militarine為0.235 6 mg·mL-1，二去氫對葉百部堿為0.018 8 mg·mL-1，氧化對葉百部堿為0.027 4 mg·mL-1)。

2.2.2 供試品溶液的制備 取菠白散適量，研細，取約3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質量，加熱回流2.0 h，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照實驗 按菠白散處方比例稱取除白及的其余藥味和除百部的其余藥味各一份，分別粉碎成細粉，過篩，混勻，分別制成白及空白樣品和百部空白樣品，按照上述供試品溶液的配制方法制成白及空白溶液和百部空白溶液。分別精密吸取10 μL的供試品溶液、混合對照品溶液、白及空白溶液和百部空白溶液，按上述方法測定，結果為：在與肉桂酸、militarine、二去氫對葉百部堿和氧化對葉百部堿對照品色譜圖相應的保留時間處，供試品溶液色譜圖中有吸收峰；而白及空白溶液色譜圖中未顯示肉桂酸和militarine吸收峰；百部空白溶液色譜圖中未顯示二去氫對葉百部堿和氧化對葉百部堿吸收峰，色譜圖見圖1。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 分別精密吸取混合對照品溶液1.0，5.0，10.0，15.0，20.0 μL，依次注入高效液相色譜儀中，按上述色譜條件進行分析測定，以峰面積(Y)與進樣量(X)進行線性回歸，得肉桂酸回歸方程為：Y=1.821 3×106X+216.8，r=0.999 2，線性范圍為0.014 2～0.284 0 μg；militarine回歸方程為：Y=2.195 2×106X-594.7，r=0.999 7，線性范圍為0.235 6～4.712 0 μg；二去氫對葉百部堿回歸方程為：Y=1.697 1×106X+316.4，r=0.999 5，線性范圍為0.018 8～0.376 0 μg；氧化對葉百部堿回歸方程為：Y=2.587 2×106X+361.2，r=0.999 8，線性范圍為0.027 4～0.548 0 μg。結果表明：肉桂酸、militarine、二去氫對葉百部堿和氧化對葉百部堿在各自的線性范圍內，進樣量與峰面積線性關系良好。

A.白及空白溶液；B.百部空白溶液；C.對照品；D.樣品；1.氧化對葉百部堿；2.二去氫對葉百部堿；3.肉桂酸；4.militarine

圖1 4種溶液的HPLC圖

2.3.2 精密度實驗 取“2.2.1”項混合對照品溶液按照“2.1”項色譜條件，精密吸取混合對照品溶液10 μL，連續重復進樣6次，分別測得4種成分的峰面積，計算各成分RSD分別為0.83%(肉桂酸)、0.46%(militarine)、0.51%(二去氫對葉百部堿)和0.39%(氧化對葉百部堿)。結果表明，儀器精密度良好。

2.3.3 重復性實驗 稱取同一批號供試品，按“2.2.2”項供試品溶液制備方法制備供試品溶液6份，按照“2.1”項色譜條件依法進樣測定，計算各成分含量的RSD分別為0.95%(肉桂酸)、0.64%(militarine)、0.35%(二去氫對葉百部堿)和0.52%(氧化對葉百部堿)。結果表明，本方法測定重復性良好。

2.3.4 穩定性實驗 精密吸取同一供試品溶液，在室溫下放置0，2，4，8，12，24 h后，每次進樣10 μL，測定其峰面積值，求得各組分RSD分別為0.79%(肉桂酸)、0.27%(militarine)、0.55%(二去氫對葉百部堿)和0.48%(氧化對葉百部堿)。表明供試品溶液24 h內穩定性良好。

2.3.5 加樣回收率實驗 取已知含量的同一批菠白散(肉桂酸為0.246 mg·g-1、militarine為3.94 mg·g-1，二去氫對葉百部堿為0.312 mg·g-1，氧化對葉百部堿為0.459 mg·g-1)適量，研細，混勻，取約1.5 g，精密稱定，精密加入混合對照品溶液25 mL和70%甲醇25 mL，按“2.2.2”項供試品溶液的配制方法制備加樣供試品試液。按“2.1”項色譜條件進樣測定，計算各組分回收率，結果見表1。

表1 肉桂酸、militarine、二去氫對葉百部堿和氧化對葉百部堿回收率實驗

2.4 樣品測定 取3個批號的樣品，按“2.2.2”項供試品制備方法，按“2.1”項的色譜條件測定本品中肉桂酸、militarine、二去氫對葉百部堿和氧化對葉百部堿含量，結果見表2。

批號肉桂酸militarine1402030.246±0.0023.94±0.041402040.267±0.0034.26±0.031402050.232±0.0023.81±0.03批號二去氫對葉百部堿氧化對葉百部堿1402030.312±0.0020.459±0.0021402040.307±0.0030.424±0.0041402050.331±0.0010.473±0.003

3 討論

3.1 供試品溶液提取方法的選擇 在供試品溶液制備過程中，曾考察了超聲提取20，40，60 min和加熱回流提取2.0 h對提取效果的影響，結果超聲提取20 min各組分含量極低，超聲提取40 min和超聲提取60 min所測結果相當，但均明顯小于加熱回流2.0 h的含量，故選用加熱回流2.0 h作為供試品溶液制備的提取方法。

3.2 色譜條件的選擇 比較不同流動相的分離效果，以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相時，militarine峰與后一個峰的分離不佳；以甲醇-水為流動相時，肉桂酸峰的對稱性差，拖尾現象嚴重。而以甲醇-乙腈(3：2)與0.1%磷酸溶液為流動相梯度洗脫時，所測4種組分均能達到基線分離，各組分峰型良好。

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《醫藥導報》編輯部

2014-04-21

2014-09-12

王堅(1975-)，女，湖北十堰人，主管藥師，學士，主要從事醫院藥學工作。電話：0719-8272355，E-mail：wanjianlunwen@163.com。

朱軍(1970-)，男，湖北十堰人，副主任藥師，碩士，主要從事醫院藥學及臨床藥學工作。電話：0719-8272348，E-mail：zhujunlunwen@163.com。

R286；R927.2

B

1004-0781(2015)09-1209-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.09.025