大鼠血漿PA-824的HPLC-MS/MS測定及藥動學研究*

刁春妍，馬江微，彌樂，趙乃千，王力彬，劉雪英

(第四軍醫大學藥物化學教研室，西安 710032)

大鼠血漿PA-824的HPLC-MS/MS測定及藥動學研究*

刁春妍，馬江微，彌樂，趙乃千，王力彬，劉雪英

(第四軍醫大學藥物化學教研室，西安 710032)

目的 建立高效液相色譜-質譜聯用(HPLC-MS/MS)法測定PA-824在大鼠血漿中濃度，并進行藥動學研究。方法 以甲硝唑為內標，血漿樣品經甲醇沉淀蛋白，富集生物樣品中的PA-824，然后進行HPLC-MS/MS檢測。色譜柱為Inertsil?ODS3 C18column(150 mm×4.6 mm，5 μm)；C18保護柱(50 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-0.03%三乙胺溶液(90：10)，流速0.5 mL·min-1，采用電噴霧電離源，正離子多反應監測掃描分析，PA-824和內標的離子選擇通道分別為荷質比(m/z)360.1→m/z175.0(CE=30，DP=66)，m/z172.1→m/z128.0(CE=21，DP=53)，柱溫30 ℃；大鼠灌服給藥后，于不同時間點取血測定血漿中藥物的含量，利用DAS2.0版軟件計算其藥動學參數。結果 PA-824在0.1～10.0 μg·mL-1范圍內呈線性關系，平均回收率均>92.13%，RSD均<6.6%。大鼠灌服PA-824后濃度-時間曲線下面積[AUC(0-t) ]為(3 297.503±320.958) mg·L-1·min-1，AUC(0-∞)為(3 558.315± 338.860) mg·L-1·min-1，達峰時間(tmax)為(360.000±64.143) min，峰濃度(Cmax)為(3.5±0.3) mg·L-1。結論 該方法快速、精確、簡便，可用于大鼠血漿中PA-824的測定及藥動學研究。

PA-824；液相色譜-質譜聯用；藥動學；大鼠

硝基咪唑吡喃類化合物最初作為治療癌癥的放射增敏劑，后來發現其具有抗結核活性，目前對這類化合物的研究主要集中在PA-824和OPC-67683這兩個化合物[1-2]。PA-824對敏感和耐藥結核桿菌有效，可以殺死處在潛伏期的結核桿菌，并且與一線抗結核藥物無交叉耐藥現象[3-6]。2002年，全球抗結核聯盟和美國國立過敏和傳染病研究所達成協議，將PA-824作為新型抗結核藥物研究，現已經進入Ⅱ期臨床試驗[2，7-8]，同時其作為活性組分與莫西沙星、吡嗪酰胺組成新的復方制劑——PaMZ[2]，目前也處于Ⅱ期臨床試驗。

PA-824是一種前體藥，通過菌體內Rv3547、FGD1、F420等因子的共同作用被還原激活，被激活后的4c端硝基咪唑基團能夠形成一個活化的中間體，從而抑制細菌的蛋白質和細胞壁脂質的合成，殺滅結核桿菌[2，9]。PA-824的體外活性不是最高，但是在動物感染模型實驗中，口服療效最好，并且具備最佳藥動學特性[9]，因此PA-824被認為是最有開發前景的候選化合物[9-11]。

1 動物、試藥與儀器

1.1 動物 斯潑累格·多雷(Sprague Dawley，SD)大鼠，雄性，體質量(200±20)g，由第四軍醫大學實驗動物中心提供，動物合格證號：醫動字第08-005號，動物生產許可證號：ACXK(軍)2007-007。大鼠分籠喂養，室溫(23±2) ℃，濕度40%～60%，光照、黑暗12 h交替，自由獲取標準飼料和飲水，實驗前禁食12 h，不禁水。

1.2 試藥 PA-824(第四軍醫大學藥物化學教研室制備)；甲硝唑[阿拉丁試劑(上海)有限公司，批號： F1308034]；肝素鈉(上海第一生化公司，批號：H31022152)。

1.3 儀器 LC-30AD型高效液相色譜儀(日本島津公司)；API4000質譜儀；AL204電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司，十萬分之一天平)；分析天平(德國Sartorius公司，萬分之一天平)；USorvall ST 40R臺式高速離心機(Thermo Fisher公司)；渦旋振蕩器(德國IKA公司)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil?ODS3 C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；預柱：C18保護柱(50 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.03%三乙胺水溶液(90：10)；流速：0.5 mL·min-1；進樣量：5 μL；柱溫：30 ℃。

2.2 質譜條件 離子源：電噴霧離子化源；電離模式：正離子模式；高效液相色譜-質譜聯用(high performance liquid chromatograph-tandem mass spectrometer，HPLC-MS/MS)：多反應監測用于定量分析的離子反應；PA-824和內標的離子選擇通道分別為荷質比(m/z)360.1→m/z175.0(碰撞能量=30 eV，去簇電壓=66 V)，m/z172.1→m/z128.0(碰撞能量=21 eV，去簇電壓=53 V)。

2.3 血漿樣品預處理 量取大鼠血漿200 μL，置于1.5 mL離心管中，加內標甲硝唑(1 μg·mL-1)10 μL渦旋振蕩30 s，加入甲醇900 μL，渦旋混勻后12 000 r·min-1(r=6.5 cm)離心15 min，移取上清液800 μL至1.5 mL離心管，氮氣吹干，殘渣用甲醇80 μL復溶，12 000 r·min-1(r=6.5 cm)離心15 min，取上清液5 μL進行HPLC-MS/MS分析。

2.4 專屬性 量取大鼠空白血漿200 μL，除用100 μL甲醇代替內標溶液外其余按“血漿樣品預處理”項下操作，獲得空白樣品的色譜圖；將一定濃度的PA-824對照品溶液和內標溶液加入空白血漿中，依法操作，獲得相應的色譜圖；取SD大鼠灌服給予PA-824后的血漿樣品200 μL，同法操作，獲得色譜圖(圖1)。實驗結果表明空白血漿中的內源性物質不干擾PA-824和內標化合物甲硝唑的測定。

2.5 標準曲線的繪制 精密量取PA-824對照品儲備液適量，甲醇稀釋成濃度為1.0，5.5，10.0，32.5，55.0，100.0 μg·mL-1對照品溶液。分別吸取上述對照品系列溶液20 μL加入到200 μL血漿中，并加入內標溶液10 μL，按“2.2”項處理，取上清液5 μL進行HPLC-MS/MS測定。以PA-824色譜峰面積與內標甲硝唑色譜峰面積之比為縱坐標，PA-824對照品濃度(C，μg·mL-1)為橫坐標繪制工作曲線?；貧w方程為：Y=0.799X+0.035，r=0.998 6，線性范圍：0.10～10.00 μg·mL-1。定量下限為0.1 μg·mL-1，其準確度與精密度均符合要求。

A.空白血漿；B 空白血漿加PA-824；C.空白血漿加甲硝唑；D.大鼠給予PA-824后血漿樣品；1.PA-824；2.甲硝唑

A.blank plasma；B.blank plasma plus PA-824；C.blank plasma spiked with metronidazole；D.plasma sample from a rat after an oral administration of PA-824；1.PA-824；2.metronidazole

Fig.1 HPLC - MS/MS chromatogram of three kinds of solution

2.6 回收率與精密度 取SD大鼠空白血漿200 μL，配制低、中、高濃度質量控制(quality control，QC)樣品(0.1，1.0，10.0 μg·mL-1PA-824)。每一種濃度進行6樣本分析，連續測定3 d，根據當日標準曲線計算QC樣品的濃度，結果進行方差分析，求得本法的精密度和準確度。平均回收率分別為92.13%，94.29%，98.21%。本分析方法的日內RSD≤3.1%，日間RSD≤6.6%，RE為-5.7%～3.6%，該法可用于測定大鼠血漿中PA-824的濃度。

2.7 穩定性實驗 取大鼠空白血漿200 μL，配制PA-824低、中、高3個血漿濃度(0.1，1.0，10.0 μg·mL-1)的QC樣品，分別考察-20 ℃冰箱凍藏45 d，3次凍融循環，血漿樣品室溫(約20 ℃)放置12 h和樣品處理后放置冰箱中(4 ℃)24 h的穩定性，每一濃度3個樣本，結果見表1。

2.8 基質效應 取大鼠空白血漿200 μL，不加對照品和內標溶液，按”2.2”項處理，然后向獲得的殘渣中加入相應濃度的對照品和內標溶液，渦旋振蕩，氮氣吹干，以甲醇80 μL溶解后得到低、中、高3種濃度的含有基質的樣品進行分析，每一種濃度取5個樣本分析，以獲得的峰面積比值計算基質效應。結果見表2。結果表明，可以忽略基質效應對本實驗樣品測定的影響。

2.9 給藥方案與樣品采集 健康SD大鼠8只，雄性，體質量(220±20) g，禁食12 h，自由飲水。分別灌胃給予PA-824(20 mg·kg-1)，給藥后5，15，30，60，120，180，240，360，480，720，1 080，1 440，2 160 min 眼眶取血。每次取血0.7 mL，肝素抗凝，3 000 r·min-1(r=6.5 cm)離心10 min，移取血漿，-20 ℃冰箱凍存備用。

2.10 大鼠灌服PA-824后的藥動學 大鼠灌服PA-824后各時間點所測得的血藥濃度-時間曲線見圖2。血藥濃度-時間數據采用安徽省藥物臨床評價中心開發的DAS(Drug And Statistics)2.0版統計軟件進行自動運算，首先對每只大鼠的血藥濃度-時間數據進行智能化處理擬合房室模型，然后對8只SD大鼠的血藥濃度-時間數據進行成批處理，最后得到藥動學參數。

主要藥動學參數：血藥濃度-時間曲線下面積[AUC(0-t) ](3 297.503±320.958)mg·L-1·min-1，AUC(0-∞)(3 558.315± 338.860)mg·L-1·min-1，達峰時間(tmax)(360.000±64.143)min，半衰期(t1/2)(500.213±154.932)min，清除率(CLz/F)(0.006±0.001)L·min-1·kg-1，血藥峰濃度(Cmax)(3.5± 0.3) mg·L-1。

3 討論

HPLC-MS/MS方法測定PA-824在大鼠血漿中的濃度，快速，精確，簡便。血漿中內源性物質不干擾樣品測定。本方法可以滿足生物樣品測定的需要。

選擇一個合適的內標物，最好是選擇待測物質的同系物，內標物要求性質穩定，不易分解、反應，能夠很好檢測，不干擾待測組分的檢測。本實驗最初選取了3個化合物作為待選內標物：甲硝唑、環丙沙星、異煙堿。結果發現甲硝唑的提取條件、色譜保留行為與待測化合物接近，而且保留時間與待測物接近，回收率較高，質譜響應強，所以本實驗最后選擇了甲硝唑作為內標物進行定量分析。

大鼠灌服PA-824后的主要藥動學參數提示PA-

表1 PA-824的穩定性實驗

Tab.1 Stability test of PA-824 %

表2 PA-824和內標的基質效應

Tab.2 Matrix effect for PA-824 and internal standard %

圖2 PA-824平均血藥濃度-時間曲線(n=8)

Fig.2 Mean plasma concentration-time curve of PA-824(n=8)

824口服吸收良好，在大鼠體內吸收分布迅速，但是消除較緩慢，36 h后仍能在大鼠內體測到原藥。PA-824的小分子結構是導致其在體內迅速吸收分布的重要因素。

[1] MANJUNATHA U H，BOSHOFF H，DOWD C S，et al.Identification of a nitroimidazo-oxazine-specific protein involved in PA-824 resistance in mycobacterium tuberculosis[J].Proc Natl Acad Sci USA，2006，103(2)：431-436.

[2] STOVER C K，WARRENER P，VANDEVANTER D R，et al.A small-molecule nitroimidazopyran drug candidate for the treatment of tuberculosis[J].Nature，2000，405(6789)：962-966.

[3] CONNOLLY L E，EDELSTEIN P H，RAMAKRISHNAN L.Why is long-term therapy required to cure tuberculosis?[J].PLoS Med，2007，4(3)：e120.

[4] 汪靜，張惠斌，周金培，等.抗結核新靶點及相關藥物的研究進展[J].中國藥科大學學報，2012，43(1)：1-8.

[5] ONYEBUJOH P，ZUMLA A，RIBEIRO I，et al.Treatment of tuberculosis：present status and future prospects[J].Bull World Health Organ，2005，83(11)：857-865.

[6] DUNCAN K.Progress in TB drug development and what is still needed[J].Tuberculosis(Edinb)，2003，83(1-3)：201-207.

[7] LENAERTS A J，GRUPPO V，MARIETTA K S，et al.Prec-linical testing of the nitroimidazopyran PA-824 for activity against mycobacterium tuberculosis in a series ofinvitroandinvivomodels[J].Antimicrob Agents Chemother，2005，49(6)：2294-2301.

[8] TYAGI S，NUERMBERGER E，YOSHIMATSU T，et al.Ba-ctericidal activity of the nitroimidazopyran PA-824 in a murine model of tuberculosis[J].Antimicrob Agents Chemother，2005，49(6)：2289-2293.

[9] DAWSON R，DIACON A.PA-824，moxifloxacin and pyraz-inamide combination therapy for tuberculosis[J].Exp Opin Investig Drugs，2013，22(7)：927-932.

[10] DIACON A H，DAWSON R，VON GROOTE-BIDLINGM-AIER F，et al.14-day bactericidal activity of PA-824，bedaquiline，pyrazinamide，and moxifloxacin combinations：a randomised trial[J].Lancet，2012，380(9846)：986-993.

[11] BARRY C R，BOSHOFF H I，DOWD C S.Prospects for clinical introduction of nitroimidazole antibiotics for the treatment of tuberculosis[J].Curr Pharm Des，2004，10(26)：3239-3262.

湖北省食品藥品監督管理局開展生化藥品專項檢查

2015年7月，按照國家食品藥品監督管理總局統一部署，在企業自查自糾的基礎上，湖北省食品藥品監督管理局對湖北省小牛血類注射劑生產企業及其他生化藥品生產企業進行了全覆蓋專項檢查。重點檢查原料供貨渠道、生產工藝及質量控制等環節，看是否存在外購提取物情況，是否存在非法添加，是否按批準的工藝和標準生產等。

經查，湖北省生化藥品生產企業均能夠按照批準的工藝處方和生產工藝進行生產，生產過程符合藥品GMP要求，未發現重大違法違規行為。在對武漢人福藥業有限責任公司的檢查中，檢查組核對了該企業小牛血制劑的《藥品再注冊品種工藝表》、工藝規程，抽查了批生產記錄，未發現存在違反批準工藝和標準生產的行為。

(信息來源：湖北省食品藥品監督管理局藥品化妝品生產監管處)

Determination of PA-824 in Rat Plasma by HPLC-MS/MS and Application in Pharmaco-kinetic Study

DIAO Chunyan，MA Jiangwei，MI Le，ZHAO Naiqian，WANG Libin，LIU Xueying

(SchoolofPharmacy，theFourthMilitaryMedicalUniversity，Xi’an710032，China)

Objective To develop an HPLC-MS/MS method for quantitative determination of PA-824 in rat plasma and to study the pharmacokinetics of PA-824 in rat after oral administration. Methods An HPLC-MS/MS method was developed and validated for determination of PA-824 in rat plasma using metronidazole as internal standard.The proteins in plasma samples were precipitated with methanol，and PA-824 was enriched for analysis by HPLC-MS/MS.An Inertsil?ODS3 C18column (150 mm×4.6 mm，5 μm) was applied with mobile phase composed of methanol- 0.03% triethylamine (TEA) in water (90：10) ，at a flow rate of 0.5 mL·min-1and column temperature of 30 ℃.Quantitation was performed on a triple quadrupole mass spectrometer applying electrospray ionization technique and operating in multiple reaction monitoring (MRM) and positive ion mode with transitions at 360.1/175.0 for PA-824 and 172.0/128.0 for metronidazole.The concentration of PA-824 in plasma was tested after oral administration at various time points and the data were processed with software DAS.2.0. Results The standard calibration curve for spiked rat plasma containing PA-824 was linear over the range of 0.1-10.0 μg·mL-1.The recoveries obtained for PA-824 were greater than 92.13%.Intra-day and inter-day coefficient of variation were less than 6.6%.After oral administration，the main pharmacokinetic parameters were AUC(0-t)：(3 297.503±320.958)mg·L-1·min-1，AUC(0-∞)：(3 558.315±338.860) mg·L-1·min-1，tmax：(360.000±64.143) min，Cmax：(3.5±0.3)mg·L-1. Conclusion The method is rapid，accurate，simple，and successfully applied in a pharmacokinetic study of fixed dose oral administration of PA-824 in rats.

PA-824；High performance liquid chromatograph-tandem mass spectrometer；Pharmacokinetics ；Rats

2014-05-26

2014-08-28

*陜西省協同創新項目(2014XT-26)

刁春妍(1993-)，女，遼寧營口人，在讀本科。電話：(0)15191577381，E-mail：wtpierce@163.com。

劉雪英(1972-)，女，山東濰坊人，副教授，博士，研究方向：新藥設計合成及藥理學。電話：029-84774473-809，E-mail：wqwlxy@163.com。

R978.3；R969.1

A

1004-0781(2015)09-1146-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.09.006