17β-雌二醇誘導血管內皮細胞釋放一氧化氮的作用機制*

徐元萍，高凌，宋曉暉，周倩

(1.武漢市婦女兒童醫療保健中心婦產科，武漢 430016；2.武漢大學人民醫院內分泌科，武漢 430060)

17β-雌二醇誘導血管內皮細胞釋放一氧化氮的作用機制*

徐元萍1，高凌2，宋曉暉1，周倩1

(1.武漢市婦女兒童醫療保健中心婦產科，武漢 430016；2.武漢大學人民醫院內分泌科，武漢 430060)

目的 觀察17β-雌二醇(E2)誘導小牛胸主動脈內皮細胞(BAECs)快速激活并釋放一氧化氮(NO)的時間和濃度依賴性趨勢。方法 采用24孔平底細胞培養板培養BAECs分別進行實驗，觀察不同濃度E2誘導BAECs快速激活并釋放NO的濃度依賴性趨勢及非基因組機制通路。每次實驗均重復3次。使用電子自旋共振波譜法定量測定NO的釋放；蛋白免疫印跡法檢測BAECs一氧化氮合成酶(eNOS)磷酸化的水平。 結果 終濃度為100 nmol·L-1的E2分別處理BAECs 1，5，10和15 min后，NO的釋放量呈現時間依賴性，在10 min達到高峰；培養液中加入不同終濃度的E2分別處理BAECs10 min后，NO的釋放量和eNOS的磷酸化均顯示有劑量依賴性，并在終濃度為100 nmol·L-1時達到高峰；培養液中分別加入等體積0.9%氯化鈉溶液、100 nmol·L-1E2和25 μg·mL-1放線菌素D(Act-D)處理BAECs 10 min后，NO釋放量分別為(5.38±2.35)，(10.59±3.28)和(10.68±3.31) nmol·mg-1；eNOS的磷酸化水平分別為0.36±0.03，0.98±0.08和0.99±0.08；與經0.9%氯化鈉溶液處理比較，經100 nmol·L-1E2處理后，BAECs的NO釋放量和eNOS的磷酸化水平均顯著增加(均P<0.05)。結論 終濃度為100 nmol·L-1E2可以通過非基因組機制快速激活血管內皮細胞中eNOS的磷酸化水平，進而可以快速合成和釋放NO發揮其生物學作用，10 min即可使此效應達到峰值。

雌二醇；內皮細胞；一氧化氮；一氧化氮合成酶

研究表明，雌激素增加一氧化氮(nitric oxide，NO)的合成和釋放而舒張血管的作用存在基因組和非基因組兩方面機制：一方面，雌激素可以和細胞核內受體結合，通過基因組作用機制激活血管內皮細胞中的內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)磷酸化從而促進NO的合成和釋放，這個途徑涉及基因轉錄，因此作用發揮需時較長，CHAMBLISS等[1]報道17β-雌二醇(17β-estradiol，E2)上調血管eNOS mRNA的表達至少需要1 h以上；另一方面，雌激素也可以通過非基因組機制使血管內皮細胞中的eNOS快速磷酸化激活進而合成和釋放NO，這是通過信號傳導通路的激活而快速達到，通常只需要數分鐘[2]，然而其具體的傳導機制尚未明了。因此，筆者在本實驗中擬通過體外培養小牛胸主動脈內皮細胞(bovine aortic endothelial cells，BAECs)，給予不同濃度E2進行誘導，同時觀察其上調eNOS的表達進而釋放NO的時間和濃度依賴性趨勢，為后期進一步研究雌激素使血管內皮細胞中的eNOS快速磷酸化激活進而合成和釋放NO的可能分子機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 BAECs購自 Cell Systems(Kirkland，WA)公司；E2(批號：491187)和小牛血清購自Sigma公司。eNOS一抗和磷酸化的eNOS一抗均購自Cell Signalling公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的二抗購自Santa Cruz公司；Western雜交顯影(enhanced chemilumine-scence，ECL)試劑盒購自Pierce公司；放線菌素D購自Calbiochem-Novabiochem公司(批號：4486950)，其余化學試劑除另有說明外均購自Sigma公司。Immunoblot儀器及膠片購自BioRad公司。電子旋轉共振儀購自Noxygen-GmbH公司。每組實驗均使用了3批次BAECs培養重復3～5次。

1.2 BAECs的培養與觀察 將BAECs在培養條件為37 ℃、5%二氧化碳(CO2)和95%空氣的細胞培養箱中培養，培養液為無酚紅的DMEM(含10% 碳處理小牛血清、1%青霉素、1%鏈霉素和1%谷氨酰胺)；倒置顯微鏡下觀察BAECs的形態學改變和生長狀態，同時進行噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)比色實驗，顯微鏡下觀察細胞生長情況并繪制細胞生長曲線，所有實驗均采用傳代培養第3～5代的BAECs，以1.0×106個·mL-1的密度接種在24孔平底細胞培養板內，實驗前24 h換成不含血清的DMEM培養液培養后分別進行實驗。

1.2.1 E2誘導BAECs釋放NO的時間依賴性趨勢實驗 將BAECs隨機分為4組(n=6)：培養液中加入生理濃度(100 nmol·L-1)的E2分別處理1，5，10，15 min。

1.2.2 E2誘導BAECs釋放NO的濃度依賴性趨勢實驗 將BAECs隨機分為4組(n=6)：培養液中分別加入終濃度為1，10，100，1 000 nmol·L-1的E2，各處理10 min。

1.2.3 E2誘導BAECs釋放NO的非基因組機制通路驗證實驗 將BAECs隨機分為3組(n=8)，正常對照組：培養液中加入等體積0.9%氯化鈉溶液處理10 min；E2組：培養液中加入終濃度為100 nmol·L-1E2處理10 min；放線菌素D處理組(Act-D 組)：培養液中加入25 μg·mL-1放線菌素D處理2 h后再加入終濃度為100 nmol·L-1E2處理10 min。

1.3 NO釋放的測定 參照參考文獻[3]，采用電子自旋共振波譜法測定NO的釋放。實驗結束后立即用冷Kreb’s 緩沖液(4 ℃)漂洗BAECs，加入新鮮配制的經氮氣充分飽和的特異性耦合物乙二基二硫代氨基甲酸鐵鹽[diethyl dithicarbamic acid ferrum salt，Fe2(DETC)2]膠體(0.5 mmol·L-1)，然后在溫箱內孵育60 min，收集細胞懸液注入1 mL注射器內，用液氮速凍成冰柱后置入指狀杜瓦瓶，利用臺式質譜儀(Bruker)分析NO的釋放量。質譜儀具體參數為，橫掃寬度：100 G；頻率：9.74 GHz；微波力：13.26 mW；調節幅度：9.82 G；分辨率：512點；接受強度：356。NO釋放量用質譜儀圖像中3個峰的峰頂和谷底的垂直距離表示，單位為蛋白nmol·mg-1。

1.4 蛋白質雜交 采用免疫印跡法(Western blot)檢測eNOS的磷酸化水平。在各組BAECs中加入細胞裂解液Buffer A混勻后置于冰上15 min，隨后加入10% NP-40搖床震蕩15 s，離心(12 000×g)10 min，吸棄上清液后加入緩沖液50 μL，于4 ℃離心(12 000×g)10 min，吸取上清液作為組織蛋白提取物，用考馬斯亮藍法(Bradford)測定提取液中的蛋白濃度達到實驗標準后，從提取液中吸取粗核蛋白50 μg，經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離后，蛋白印跡轉膜和封阻1 h；用適量稀釋(1：1 000)的eNOS一抗或磷酸化的eNOS一抗，4 ℃孵育雜交過夜；雜交后按照上述步驟洗膜后再加入HRP標記的二抗，室溫下搖床雜交1 h；ECL化學發光法檢測陽性信號，采用圖像分析處理系統對蛋白條帶掃描分析，記錄積分吸光度值，各組eNOS的磷酸化水平以磷酸化的eNOS與eNOS的比值表示。

2 結果

2.1 E2誘導BAECs釋放NO的時間依賴性趨勢 生理濃度(100 nmol·L-1)E2分別處理BAECs 1，5 min后，兩者NO釋放量和eNOS磷酸化水平均差異無統計學意義；處理10和15 min后NO釋放量和eNOS的磷酸化水平均顯著增加(t=2.676，2.392，2.753，2.418，均P<0.05)。見表1和圖1。

表1 BAECs 經100 nmol·L-1E2處理不同時間后NO釋放量和eNOS磷酸化水平比較

與處理5 min時比較，*1P<0.05Compared with 5 min after treatment，*1P<0.05

圖1 BAECs 經100 nmol·L-1E2處理不同時間后eNOS磷酸化水平比較

Fig.1 Comparison of eNOS phosphorylation levels of BAECs at different time points after treatment by 100 nmol·L-1E2

2.2 E2誘導BAECs釋放NO的濃度依賴性趨勢 培養液中分別加入1，10 nmol·L-1E2處理BAECs 10 min后，NO釋放量和eNOS的磷酸化水平均沒有顯著增加(均P>0.05)；分別加入100，1 000 nmol·L-1E2處理BAECs 10 min后，NO釋放量和eNOS的磷酸化水平均顯著增加(t=2.706，2.614，5.458，2.576，均P<0.05)。見表2和圖2。

2.3 E2誘導BAECs釋放NO的非基因組機制通路 與對照組比較，E2組和Act-D組的NO釋放量和eNOS的磷酸化水平均顯著增加(t=2.552，2.409，2.469，2.604，均P<0.05)；但E2組和Act-D組差異無統計學意義(P>0.05)，見表3和圖3。

表2 BAECs經不同終濃度E2處理10 min后NO釋放量和eNOS磷酸化水平比較

與10 nmol·L-1E2處理后比較，*1P<0.05Compared with the group treated by 10 nmol·L-1 E2，*1P<0.05

圖2 BAECs經不同濃度E2處理后eNOS磷酸化水平比較

Fig.2 Comparison of eNOS phosphorylation levels of BAECs treated by different concentration of E2

表3 3組NO釋放量和eNOS磷酸化水平比較

與正常對照組比較，*1P<0.05Compared with normol control group，*1 P<0.05

圖3 3組eNOS磷酸化水平比較

Fig.3 Comparison of eNOS phosphorylation levels among three groups

3 討論

絕經是女性體內和生殖系統有關的內分泌激素變化的結果，這些激素主要有雌激素、孕激素和促黃體生成素等。雌激素是一種類固醇激素，主要由卵巢和胎盤產生，以促進陰道、子宮、輸卵管和卵巢本身的發育，同時還能促使皮下脂肪富集、促使體內鈉和水的潴留、骨中鈣的沉積等；卵巢功能衰竭后，雌激素水平急劇下降，引起婦女更年期綜合征，癥狀主要有心血管系統疾病(如冠心病)、內分泌系統疾病(如糖尿病)及運動系統退化等。絕經前的女性冠心病發病率僅7‰，而同齡男性的發病率高達48‰，兩者相差近7倍；但絕經后的女性冠心病發病率顯著增加，變為與同齡男性相當甚至更高[4]。研究發現，絕經是女性冠心病的一個獨特危險因素，雌激素的心血管保護作用可能與其激活血管內皮細胞中的eNOS磷酸化進而釋放NO有關，但具體的作用機制還不清楚；雌激素對心血管的保護作用主要與NO信號系統直接相關[5]。使血管內皮細胞中的eNOS快速磷酸化激活進而合成和釋放NO依賴于雌激素受體(estrogen receptor，ER)的作用。

ER包括兩大類：一是經典的核受體，包括ERa和ERb，均位于細胞核內，介導雌激素的基因組機制，即雌激素以自由擴散形式通過質膜進入細胞，并與核內ER緊密結合激活形成ER 同源或異源二聚體，通過結合靶基因上的雌激素應答元件(estrogen response element，ERE)調節基因表達或與其他核蛋白相互作用以改變基因的轉錄活性，從而使血管內皮細胞中的eNOS快速磷酸化激活并促進NO的合成和釋放，這個途徑涉及基因轉錄，因此作用發揮需時較長。二是膜性受體，包括經典核受體的膜性成分以及屬于G蛋白耦聯受體家族的GPER1(GPR30)、Gaq-ER和ER-X，雌激素可以通過它們介導的非基因組機制使血管內皮細胞中的eNOS快速磷酸化激活進而合成和釋放NO，這是通過信號傳導通路的激活而快速達到的，通常只需要數分鐘，由于不涉及基因的表達、轉錄及蛋白質合成，故此效應不受經典核受體拮抗藥、基因轉錄或蛋白質合成抑制劑的影響[2]。因此，筆者通過體外培養 BAECs，給予不同濃度E2進行誘導，同時觀察其上調eNOS的表達進而釋放NO的時間依賴性趨勢。由于NO是脂溶性的自由基氣體，攜帶一個未配對的電子，在體內極不穩定，生物半衰期為5 s。以前檢測NO的方法(如化學比色法等)很難得到準確的結果。鑒于NO為直線形雙原子自由基，其分子構型決定了NO是奇電子分子，具有順磁性[6]。因此本研究選擇了采用電子自旋共振波譜儀(electron spin resonance spectroscopy，ESR)檢測E2誘導BAECs釋放NO的含量。這是一種根據電子自旋共振波譜吸收程度，檢查組織、細胞或者其提取液中的自由基，并通過朗達(Lande)g因子的測定來推斷自由基離子的存在狀態的方法。在實驗結束后立即用冷Kreb’s 緩沖液(4 ℃)漂洗BAECs，加入新鮮配置的經氮氣充分飽和的特異性耦合物Fe2(DETC)2膠體(0.5 mmol·L-1)，然后在溫箱內孵育60 min，收集細胞懸液注入1 mL注射器內，用液氮速凍成冰柱后置入指狀杜瓦瓶，最后利用臺式質譜儀(Bruker)圖像中3個峰的峰頂和谷底的垂直距離來表示分析NO的釋放量是目前比較先進、準確的方法。本研究結果顯示，與正常對照組比較，E2和放線菌素D處理后BAECs的eNOS磷酸化水平及NO釋放量均顯著增加；但E2和放線菌素D之間差異無統計學意義，說明轉錄抑制劑放線菌素D沒有影響E2誘導BAECs快速磷酸化激活eNOS進而合成和釋放NO的過程，這與以往的研究結果相符合。

總之，本研究結果表明100 nmol·L-1E2可以通過非基因組機制快速激活血管內皮細胞中eNOS的磷酸化水平，進而可以快速合成和釋放NO發揮其生物學作用。

[1] CHAMBLISS K L，WU Q，OLTMANN S，et al.Non-nuclear estrogen receptor alpha signaling promotes cardiovascular protection but not uterine or breast cancer growth in mice[J].J Clin Invest，2010，20(7)：2319-2330.

[2]MENDELSOHN M E.Nongenomic，ER-mediated activation of endothelial nitric oxide synthase：how does it work? What does it mean?[J].Circul Res，2000，87(11)：956-960.

[3] GAO L，SIU K L，CHALUPSKY K，et al.Role of uncoupled endothelial nitric oxide synthase in abdominal aortic aneurysm formation：treatment with folic acid[J].Hypertension，2012，59(1)：158-166.

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Mechanism of 17β-estradiol Induced Nitric Oxide Release from Bovine Aortic Endothelial Cells

XU Yuanping1，GAO Ling2，SONG Xiaohui1，ZHOUQian1

(1.DepartmentofGynaecologyandObstetrics，WuhanWomenandChildren'sMedicalCareCenter，Wuhan430016，China；2.DepartmentofEndocrinology，RenminHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430060，China)

Objective To investigate the time and dose dependent effects of 17 β-estradiol(E2) on eNOS phosphorylation and nitric oxide (NO) production from bovine aortic endothelial cells (BAECs). Methods The BAECs were cultured in 24-well flat plate.The dose dependent rapid induction of NO release by E2in the BAECs was explored，and the non-genomic mechanism was studied.Each experiment was repeated for 3 times.The NO level was quantified by the electron spin resonance spectroscopy(ESR)method，and the phosphorylation of eNOS were determined by Western blot. Results NO release increased time dependently from BAECs after treatment with E2at 100 nmol·L-1at 1，5，10 and 15 min，and the effect peaked at 10 min.There were dose dependent effects of NO production as well as eNOS phosphorylation after treatment with E2at different concentrations for 10 min，and the effect was the most obvious at the concentration of 100 nmol·L-1.Upon treatment with equal volume of saline，E2and actinomycin D (25 μg·mL-1) for 10 min，the NO release was(5.38±2.35)，(10.59±3.28)and(10.68±3.31) nmol·mg-1，respectively，and the eNOS phosphorylation level was 0.36±0.03，0.98±0.08 and 0.99±0.08，respectively.Compared with 0.9% sodium chloride solution，the NO release and eNOS phosphorylation were significantly increased in E2treated cells(allP<0.05). Conclusion 17 β-estradiol at 100 nmol·L-1induced eNOS phosphorylation as well as NO production from bovine vascular endothelial cells through non-genomic mechanism.The effect peaked at 10 minutes.

Estradiol; Endothelial cells; Nitric oxide; Nitric oxide synthase

2014-05-29

2014-11-14

*國家自然科學基金資助項目(81170767)

徐元萍(1973-)，女，湖北京山人，主治醫師，碩士，研究方向：婦科內分泌、腫瘤、炎癥的臨床及基礎研究。電話：(0)13659800706，E-mail：462888137@qq.com。

高凌(1973-)，男，湖北武漢人，副主任醫師，副教授，博士，研究方向：內分泌疾病的臨床及基礎研究。電話：(0)18907102990，E-mail：ling.gao@medmail.com.cn。

R977.2；R965

A

1004-0781(2015)09-1142-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.09.005