銀杏葉軟膠囊中銀杏黃酮醇苷和內酯含量測定

馬敬儀，董金香

(長春中醫藥大學藥學院，長春 130117)

銀杏葉軟膠囊中銀杏黃酮醇苷和內酯含量測定

馬敬儀，董金香

(長春中醫藥大學藥學院，長春 130117)

目的 建立高效液相色譜法檢測銀杏葉軟膠囊中銀杏黃酮醇苷和總萜類內酯含量。方法 采用Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×200 mm， 5 μm)，甲醇-0.4%磷酸溶液(55：45)作為流動相，檢測波長為360 nm；柱溫40 ℃；流速1 mL·min-1。結果 槲皮素、山柰素和異鼠李素分別在5.212～52.124，4.729～47.291，2.217～22.166 μg·mL-1范圍內有較好的線性關系；其中白果內酯、銀杏內酯A、B、C分別在1.307～6.535，1.008～5.040，0.935～4.675，0.629～3.145 μg范圍內有較好的線性關系；總黃酮醇苷和總萜類內酯的平均回收率分別為99.87%和99.60%，RSD分別為2.94%和4.24%。結論 高效液相色譜法檢測銀杏葉軟膠囊中總黃酮醇苷和萜類內酯操作簡單，且靈敏度和穩定性高，可作為銀杏葉軟膠囊質量控制的方法之一。

銀杏葉軟膠囊；黃酮醇苷；萜類內酯；色譜法；高效液相

銀杏葉軟膠囊是由銀杏葉提取物制備的膠囊制劑，具有軟化和擴張血管、抑制血小板活化因子、抗氧化、調節血脂和降血壓等功效[1-2]，對急性腦梗死、高脂血癥、高血壓冠心病以及腦供血不足等心腦血管疾病具有很好的療效[3-4]。其主要有效成分是銀杏黃酮醇苷和萜類內酯。但是銀杏葉軟膠囊中成分較為復雜，分析方法較為繁瑣、復雜或不穩定[5]。本研究建立高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法檢測銀杏葉軟膠囊中銀杏黃酮醇苷和萜類內酯，旨在為銀杏葉軟膠囊質量控制提供一定的科學依據。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 高效液相色譜儀為美國Agilent 1100型系列，包括四元梯度泵、手動進樣器、二極管陣列檢測器和Agilent 100工作站。

1.2 試藥 槲皮素對照品(批號：100081-200907)、山柰素對照品(批號：110861-200808)、異鼠李素對照品(批號：110860-200608)、白果內酯對照品(批號：110865-200605)、銀杏內酯A對照品(批號：110862-200608)、銀杏內酯B對照品(批號：110863-200508)、銀杏內酯C對照品(批號：110864-200505)均購自中國食品藥品檢定研究院；銀杏葉軟膠囊(石家莊市華新藥業有限責任公司，批號：210437，210409，210587)；甲醇等色譜試劑購自國藥集團化學試劑有限公司；水為二次純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×200 mm， 5 μm)；流動相：甲醇-0.4%磷酸溶液(55：45)用醋酸調整pH=3.0；檢測波長360 nm；柱溫40 ℃；流速1 mL·min-1；進樣量：20 μL(定量環)。

2.2 對照品溶液配制 分別取槲皮素、山柰素、異鼠李素各4.51，5.24和2.82 mg，精密稱定，置于100 mL量瓶，甲醇溶液溶解并定容，配制成0.045 1，0.052 4，0.028 2 mg·mL-1的總黃酮醇苷混合對照品貯備液，備用。分別取白果內酯、銀杏內酯A、B、C對照品各為10.70，8.05，8.16，4.32 mg，精密稱定，置于100 mL量瓶，甲醇溶液溶解并定容，配制成濃度0.107 0，0.080 5，0.081 6，0.043 2 mg·mL-1的混合對照品貯備液，備用。

2.3 供試品溶液配制 取銀杏葉軟膠囊內容物1 g，精密稱定，置于10 mL量瓶，采用甲醇-0.4%磷酸溶液(55：45)溶解并定容，然后將樣品采用旋轉蒸發儀回流處理30 min，迅速冷卻，過濾后將濾液轉移至50 mL量瓶中，并用甲醇-0.4%磷酸溶液(55：45)定容，樣品作為供試品溶液。

2.4 陰性對照溶液配制 根據銀杏葉軟膠囊制作工藝制作缺少銀杏葉提取物的膠囊樣品，根據“2.3”項供試品溶液制作方法制備陰性對照溶液。

2.5 專屬性分析 分別吸取總黃酮醇苷混合對照品溶液、總萜類內酯混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，按照“2.1”項色譜條件測定。結果見圖1和圖2。陰性對照溶液未見槲皮素、山柰素、異鼠李素等總黃酮醇苷和白果內酯、銀杏內酯A、B、C等總萜類內酯。而在供試品溶液中，在各組分保留時間處可見色譜峰，且專屬性良好。

2.6 總黃酮醇苷標準曲線的繪制 精密吸取總黃酮醇苷混合對照品貯備液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，按照上述條件進行檢測，以對照品濃度為橫坐標，峰面積作為縱坐標做線性回歸。測得總黃酮醇苷各組分的回歸方程及相關系數，見表1。

A.陰性對照溶液；B.總黃酮醇苷混合對照品；C.供試品溶液；1.槲皮素； 2.山柰素； 3.異鼠李素

圖1 3種溶液中黃酮醇苷各組分HPLC色譜圖

A.陰性對照溶液；B.總萜類內酯混合對照品；C.供試品溶液；1.白果內酯； 2.銀杏內酯A； 3.銀杏內酯B； 4.銀杏內酯C

圖2 3種溶液總萜類內酯各組分HPLC色譜圖

表1 3種總黃酮醇苷和4種總萜類內酯的回歸方程、相關系數及線性范圍

組分回歸方程相關系數(r)線性范圍/(μg·mL-1)槲皮素Y=42.73X-32.580.9995.212^52.124山奈素Y=41.13X-27.440.9994.729^47.291異鼠李素Y=32.84X-18.430.9992.217^22.166白果內酯Y=0.712X-4.0110.9991.307^6.535銀杏內酯AY=0.652X-3.4260.9991.008^5.040銀杏內酯BY=0.831X-4.6850.9990.935^4.675銀杏內酯CY=0.617X-3.8340.9750.629^3.145

2.7 總萜類內酯標準曲線的制備 精密吸取總萜類內酯混合對照品溶液各3，6，9，12，15 μL，按照上述條件進行檢測，以進樣量的對數值為橫坐標，峰面積積分值的對數值作為縱坐標做線性回歸。測得萜類酯各組分的回歸方程及相關系數，見表1。

2.8 精密度分析 取標準品溶液 20 μL，采用上述色譜條件，重復進樣6次，結果測得槲皮素、山柰素、異鼠李素峰面積的RSD分別為0.37%，0.25%和0.15%，而白果內酯、銀杏內酯A、B、C的峰面積RSD分別為0.98%，0.71%，1.21%和0.83%。

2.9 穩定性分析 分別在0， 2， 4， 8， 16，24 h不同時間點取同一批制備的供試溶液20 μL，按照“2.1”項色譜條件測定銀杏葉軟膠囊中總黃酮醇苷和總萜類內酯各組分的峰面積。結果供試品溶液在24 h內穩定性良好，槲皮素，山柰素，異鼠李素峰面積RSD分別為0.37%，0.25%和0.15%，而白果內酯、銀杏內酯A、B、C的峰面積RSD分別為0.98%，0.71%，1.21%和0.83%。

2.10 重復性分析 取同一批號的銀杏葉軟膠囊，稱取6份，按照“2.3”的樣品處理方法，制備銀杏葉軟膠囊供試品溶液，然后按照“2.1”色譜條件測定總黃酮醇苷和總萜類內酯峰面積的一致性，結果表明槲皮素，山柰素，異鼠李素的峰面積RSD分別為0.43%，0.60%和0.91%。而白果內酯、銀杏內酯A、B、C的峰面積RSD分別為1.04 %，0.92%，1.58%和0.99%。

2.11 加樣回收率分析 分別精密稱取已知總黃酮醇苷和總萜類內酯準確含量的銀杏葉軟膠囊(批號：210437)6份，每份約0.2 g，同時精準加入總黃酮醇苷和總萜類內酯質量濃度分別為2.591，0.211 mg·mL-1的混合對照品溶液1 mL，按“2.3”項下方法處理樣品，并按照“2.1”色譜條件進行總黃酮醇苷和總萜類內酯測定，并計算回收率。結果見表2。

表2 銀杏葉軟膠囊中黃酮醇苷和總萜類內酯加樣回收率實驗結果 n=6

2.12 樣品測定 分別將不同批次的銀杏葉軟膠囊按照“2.3”的操作方法配制成測試樣品溶液，采用“2.1”色譜條件檢測總黃酮醇苷和總萜類內酯的峰面積，計算每批次中總黃酮醇苷和總萜類內酯的含量以及RSD。結果見表3。

3 討論

總黃酮醇苷和總萜類內酯是銀杏葉軟膠囊中2種

主要有效成分，可以用總黃酮醇苷和總萜類內酯的含量來分析不同批次藥物的質量。本研究建立HPLC法測定銀杏葉軟膠囊中總黃酮醇苷和總萜類內酯HPLC。

表3 不同批次銀杏葉軟膠囊中總黃酮醇苷和總萜類內酯的含量分析 n=3

在色譜柱的選擇方面， Diamonsil C18色譜柱對總黃酮醇苷和總萜類內酯具有較好分離效果。《中華人民共和國藥典》2005年版規定對總黃酮苷元的檢測分析，流動相選擇甲醇-0.4%的磷酸溶液，但是對于兩種溶液的比例沒有固定的數值。流動相對色譜峰的分離度影響很大，在實驗前對流動相組成的比例進行預實驗，結果發現當甲醇和0.4%磷酸溶液比例達到55：45時，各色譜峰分離度好，峰形尖銳且保留時間適中。

采用對總黃酮醇苷和總萜類內酯對照品溶液在波長200～400 nm掃描，發現槲皮素、山柰素、異鼠李素白果內酯、銀杏內酯A、B、C等有效成分在360 nm有較高的吸收峰。因此本研究將色譜檢測波長選擇為360 nm。

本研究建立的HPLC法檢測銀杏葉軟膠囊中總黃酮醇苷和總萜類內酯，標準曲線相關性良好，方法簡單，且檢測準確，穩定性良好，數據可靠。

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2014-02-12

2014-05-05

馬敬儀(1989-)，女，吉林長春人，碩士，研究方向：中藥藥劑。電話：(0)13578725716，E-mail：qqqkkk10@163.com。

董金香(1963-)，女，吉林長春人，教授，博士，研究方向：中藥藥劑。電話：(0)13578882375，E-mail：838329276@qq.com。

R286；R927.2

B

1004-0781(2015)10-1370-03

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.10.029