不同產地及不同藥用部位馬藍中靛藍和靛玉紅的含量測定

程佩佩，夏葉，方玉，答國政，黃靜，張秀橋

(湖北中醫藥大學藥學院，武漢 430065)

不同產地及不同藥用部位馬藍中靛藍和靛玉紅的含量測定

程佩佩，夏葉，方玉，答國政，黃靜，張秀橋

(湖北中醫藥大學藥學院，武漢 430065)

目的 建立反相高效液相色譜(RP-HPLC)法同時測定不同產地、不同藥用部位馬藍中靛藍、靛玉紅的含量。方法 選用Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇-水(75：25)，柱溫25 ℃，流速1.0 mL·min-1，檢測波長290 nm。結果 靛藍在0.051 3～0.820 8 μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系(r=0.999 3)，平均回收率為99.00%，RSD為1.30%(n=6)。靛玉紅在0.049 5～0.792 0 μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系(r=0.999 9)，平均回收率為98.88%，RSD為1.51%(n=6)。結論 馬藍中靛藍、靛玉紅因產地和藥用部位的不同，含量差異較大。該方法操作簡便、快速、可靠，可為馬藍藥材的質量控制提供實驗依據。

馬藍；靛藍；靛玉紅；含量測定；色譜法，高效液相

馬藍[Baphicacanthuscusia(Nees) Bremek]為爵床科植物，廣泛分布于我國西南、華南及華東地區，是我國常用藥用植物，其葉經加工成干葉后在我國華南地區常作大青葉使用[1]；莖、葉加工成一種深藍色的粉末入藥稱為青黛[2]，青黛性寒味咸，具有清熱解毒、涼血止血、清肝瀉火的功效；根及根莖入藥稱為南板藍根[3]，南板藍根性寒、味苦，歸心、胃經，具有清熱解毒、涼血、消斑的功效，主治溫病發熱，發斑，發疹，風熱感冒、咽喉腫痛、流行性感冒、腦脊髓膜炎、乙型腦炎、肝炎、肺炎、腮腺炎、丹毒、癰腫、火眼、神昏吐等癥[4]。馬藍葉的主要活性成分為靛藍、靛玉紅等吲哚類化合物[5]。靛玉紅具有抗腫瘤作用，是治療慢性粒細胞白血病的有效成分[6]，靛藍既是一種染料又具有保肝作用[7]。馬藍是一種應用較廣泛的藥用植物，由于生長周期較長，產量低，過量采挖等因素導致其野生資源急劇減少，市場上充斥著來源于其同科屬的偽品，如球花馬藍、廣西馬藍等[8]，由于這些偽品的原植物形態與正品馬藍較相似，易于混淆，嚴重影響臨床用藥安全。偽品因不含有效成分靛藍、靛玉紅，故不能與正品馬藍混用[8]。為了有效控制馬藍相關藥材的質量，筆者建立高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法測定不同地區馬藍根、莖、葉中主要活性成分靛玉紅、靛藍的含量[9-10]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 DIONEX P680高效液相色譜儀(美國DIONEX公司)；SHIMADZU UV-1800 分光光度計(日本島津公司)；十萬分之一分析天平(瑞士Metiler Toledo公司)；KQ-250B超聲波清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 靛藍對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：YM0306SA14，含量≥98%)；靛玉紅對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：20121023，含量≥98%)；甲醇(色譜純)；N，N-二甲基甲酰胺(分析純，天津市天力化學試劑有限公司)；水為重蒸餾水。樣品共15批，見表1，經湖北中醫藥大學生藥教研室張秀橋教授鑒定，為爵床科植物馬藍(Baphicacanthuscusia)的根、莖、葉。

2 方法與結果

2.1 色譜條件及系統適應性 采用Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為甲醇-水=(75：25)；流速1.0 mL·min-1；柱溫25 ℃；檢測波長290 nm；進樣量20 μL。靛玉紅、靛藍理論板數均>4 000，兩組份之間及與其他峰分離度>5。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取干燥至恒重的靛藍和靛玉紅對照品1.28，1.24 mg，置于25 mL量瓶，加N，N-二甲基甲酰胺溶解并定容，制成每毫升含靛藍和靛玉紅0.051 3，0.049 5 mg的溶液，作對照品儲備溶液。分別精密吸取上述各對照品儲備溶液1 mL，置5 mL量瓶，加N，N-二甲基甲酰胺至刻度，搖勻，即得各對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 馬藍樣品用粉碎機粉碎，過內徑0.425 mm(40目)篩。取干燥至恒重樣品約75 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中；加N，N-二甲基甲酰胺適量，超聲處理30 min，冷卻；加N，N-二甲基甲酰胺至刻度，搖勻，濾過；取續濾液，用內徑0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3 線性關系考察 分別精密量取對照品儲備溶液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 mL置于10 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻。分別按照“2.1”項色譜條件進行測定，以進樣量(μg)為橫坐標，色譜峰面積(A)為縱坐標，繪制標準曲線，建立回歸方程，靛藍：Y=16.954X+0.005 9，r=0.999 7，線性范圍是0.051 3～0.820 8 μg；靛玉紅：Y=52.978X-0.135 4，r=0.999 9，線性范圍是0.049 5～0.792 0 μg。

2.4 精密度實驗 分別精密吸取靛藍和靛玉紅對照品溶液20 μL，重復進樣6次，測定峰面積。靛藍、靛玉紅峰面積的RSD分別為2.26%和0.86%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性實驗 取S6號樣品1份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，室溫放置，分別于0，2，4，6，8，12，24 h進樣測定。結果靛藍和靛玉紅的峰面積RSD分別為1.78%和1.90%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好 。

2.6 重復性實驗 取S6號樣品6份，分別按“2.2.2”項下制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定靛藍、靛玉峰面積，以外標法計算含量。靛藍、靛玉峰含量的RSD分別為1.20%和1.57%，表明供試品溶液制備方法重復性良好。

2.7 加樣回收率實驗 取已知靛藍、靛玉紅含量的S6號樣品6份，每份約75 mg，精密稱定，分別準確加入靛藍、靛玉紅對照品適量，按“2.2.2”項下制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定靛藍、靛玉峰面積，計算含量和回收率，結果見表2。

表2 靛藍和靛玉紅加樣回收率實驗結果Tab.2 Recovery results of indigo and indirubin

2.8 樣品含量測定 取不同來源、不同藥用部位的樣品粉末各75 mg，精密稱定，按“2.2.2”項制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件測定靛藍、靛玉紅峰面積，每份樣品重復測定3次，計算含量。結果見表3。

表3 不同產地及不同藥用部位馬藍中靛藍與靛玉紅含量

Tab.3 Content of indigo and indirubin inBaphicacanthuscusiafrom different place and medicinal parts

mg·g-1

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 參照《中華人民共和國藥典》2010年版青黛、大青葉中靛藍、靛玉紅的含量測定方法[2]，靛藍的檢測波長為606 nm，靛玉紅的檢測波長292 nm，但靛藍在289 nm處有最大吸收[11]，為了便于操作，在同一檢測波長下同時測定兩種成分，故選擇檢測波長為290 nm。

3.2 流動相的選擇 筆者在本實驗中考察了甲醇-水系統和乙腈-水系統，結果兩系統均能得到較好的峰形，乙腈-水系統10 min內出峰完全，甲醇-水系統15 min內出峰完全，從經濟角度考慮，選擇甲醇-水系統更為合適。此外，比較兩種比例甲醇-水系統(75：25)及(70：30)，結果以甲醇：水為(75：25)時，峰形更好。

3.3 供試品溶液制備方法的選擇 由于靛藍、靛玉紅結構相似，可以采用適當方法同時提取。本文比較3種提取方法即N，N-二甲基甲酰胺超聲提取、三氯甲烷超聲提取及三氯甲烷索氏提取器提取，結果三氯甲烷超聲提取法提取不夠完全，提取時間較長，不適合作為本文含量測定提取方法；三氯甲烷索氏提取器提取可以有效提取靛藍和靛玉紅，但其耗時太久，操作繁瑣，亦不適合。經過考察溶劑量、提取時間等因素，并參考文獻[12]，確定前文供試品制備方法為最佳提取方法。

3.4 不同藥用部位中靛藍與靛玉紅的含量分析 馬藍不同藥用部位的靛藍與靛玉紅含量存在較大差異，本文實驗結果表明來自河南南陽、海南興隆、華南植物園及重慶的馬藍中靛藍與靛玉紅含量均為葉>莖，廣州的馬藍根中的靛藍與靛玉紅含量幾乎不能檢出。依據相關文獻[11，13-15]，發現馬藍根中的靛藍、靛玉紅含量均較低，且遠遠低于莖葉中含量；由于本實驗中供試品溶液制備的取樣量均為75 mg，對根而言相對偏低，故來源于廣州的S12和S13樣品中靛藍、靛玉紅可能由于含量低于檢測限度而未能被檢出。

3.5 不同產地樣品中靛藍與靛玉紅的含量分析 由于馬藍的分布范圍較廣，不同產地馬藍的靛藍與靛玉紅含量不同。筆者考察馬藍6個來源地樣品中，來自海南興隆(S4號樣)馬藍葉中靛藍含量最高，而來自廣西(S6號樣)馬藍葉則靛玉紅含量最高。不同產地馬藍葉中靛玉紅的含量均高于《中華人民共和國藥典》2010年版一部大青葉項下含量測定對靛玉紅含量(不少于0.020%)的要求，說明我國南方將馬藍葉作為大青葉使用有一定的科學性。此外，還對來自廣東和廣西的多批球花馬藍葉進行含量測定，結果均未檢出靛藍和靛玉紅，進一步驗證球花馬藍等偽品不可與馬藍混用。

[1] 《廣東中藥志》編輯委員會.廣東中藥志[M].廣州：廣東科技出版社，1994：153-154.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：20-21，185.

[3] 南京中醫藥大學.中藥大辭典(上冊)[M].上海：上海科學技術出版社，2006：1726.

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[8] 楊成梓，劉小芬，范世明.藥用植物馬藍的資源調查研究[J].中國現代中藥，2012，14(3)：33-36.

[9] 周悌強，馮素香，李曉玉，等.不同產地五味子的木脂素類成分的含量測定[J].醫藥導報，2013，32(12)：1624-1627.

[10] 仇濟韻，趙士治.高效液相色譜法測定小兒感冒顆粒中靛玉紅與靛藍含量[J].醫藥導報，2011，30(10)：1353-1355.

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Determination of Indigo and Indirubin in Baphicacanthus cusia from Different Producing Areas and Medicinal Parts by RP-HPLC

CHENG Peipei, XIA Ye, FANG Yu, DA Guozheng, HUANG Jing, ZHANG Xiuqiao

(SchoolofPharmacy,HubeiUniversityofChineseMedicine,Wuhan430065,China)

Objective To establish a RP-HPLC method for determining indigo and indirubin inBaphicacanthuscusiafrom different producing areas and medicinal parts. Methods The separation was achieved by an Agilent TC-C18Column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) at 25 ℃ using methanol-water (75：25) as mobile phase at a flow rate of 1 mL·min-1.The detection wavelength was 290 nm. Results Indigo had a good linear relationship with peak area at range of 0.051 3-0.820 8 μg (r=0.999 3).The recovery rate was 99.01% and RSD was 1.30% (n=6).Indirubin had a good linear relationship with peak area at range of 0.049 5-0.792 0 μg (r=0.999 9).The recovery rate was 98.88% and RSD was 1.51% (n=6). Conclusion The contents of the two components are obviously different inBaphicacanthuscusiabecause of different places or medicinal parts.The proposed method is simple, rapid and reliable.This method for determination of indigo and indirubin inBaphicacanthuscusiaby RP-HPLC provides a basis for quality control ofBaphicacanthuscusia.

Baphicacanthuscusia；Indigo；Indirubin；Content determination；Chromatography, high performance liquid

2014-06-30

2014-09-23

程佩佩(1988-)，女，湖北仙桃人，在讀碩士，主要從事中藥資源、品質及開發研究工作。電話：(0)13343581351，E-mail：1173814267@qq.com。

張秀橋(1965-)，女，河北新樂人，教授，博士，主要從事中藥品種、質量及資源開發研究工作。電話：(0)13871392318，E-mail：qiaoxzh2000@163.com。

R281.1；R927.2

B

1004-0781(2015)10-1363-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.10.027