熊果酸對慢性非細菌性前列腺炎模型大鼠的治療作用

劉雁飛，韓盼，賴永繼

(武漢市中心醫院1.兒科；2.藥學部，武漢 430014)

熊果酸對慢性非細菌性前列腺炎模型大鼠的治療作用

劉雁飛1，韓盼2，賴永繼2

(武漢市中心醫院1.兒科；2.藥學部，武漢 430014)

目的 探討熊果酸對角叉菜膠誘導的慢性非細菌性前列腺炎(CNP)大鼠的治療作用及其機制。方法 將42只斯潑累格·多雷(SD)大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、普適泰組、熊果酸大劑量組和小劑量組，除正常對照組外，其他組造CNP模型。普適泰組灌胃給予普適泰藥液148 mg·kg-1·d-1，熊果酸大劑量組和小劑量組分別灌胃給予熊果酸藥液100和50 mg·kg-1·d-1，正常對照組和模型對照組灌胃給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，連續給藥20 d。考察大鼠的前列腺指數，利用酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測大鼠血清中白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-10(IL-10)的水平，經蘇木精-伊紅(HE)染色觀察前列腺組織的病理學變化。結果 與模型對照組比較，熊果酸大劑量組、小劑量組可顯著降低大鼠前列腺指數(P<0.05)，以及血液中細胞因子IL-1β、TNF-α和IL-10的水平(P<0.05或P<0.01)。前列腺組織切片HE染色顯示熊果酸大劑量組對前列腺炎病理組織學改變有明顯的改善作用。結論 熊果酸對角叉菜膠誘導的慢性非細菌性前列腺炎大鼠具有一定的治療作用，其機制可能與熊果酸對IL-1β、TNF-α和IL-10水平的調節作用有關。

熊果酸；前列腺炎，非細菌性，慢性；酶聯免疫吸附測定

熊果酸(ursonic acid，UA)是廣泛存在于天然植物中的一種三萜類成分，山楂、枇杷和山茱萸等均含有大量UA[1-3]。前期研究中，筆者在地梗鼠尾草全草中發現大量UA[4]。近年研究發現，UA可通過多種途徑發揮抗腫瘤[5]、抗氧化[6]和鎮痛[7]作用，但UA作用于前列腺炎筆者未見報道。前列腺炎是泌尿外科最常見的疾病之一，流行病學研究表明其發病率約8.4%[8]。在前列腺炎患者中以慢性非細菌性前列腺炎(chronic nonbacterial prostatitis，CNP)患者最為多見[9]。筆者在本實驗中采用慢性非細菌性前列腺炎大鼠模型，利用酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immuno-sorbent assay，ELISA)檢測大鼠血清中白細胞介素(interleukin，IL)-1β、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和IL-10的水平，以探討UA對CNP模型大鼠的治療作用及其可能機制。報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性斯潑累格·多雷(Sprague Dawley，SD)大鼠42只，無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級，體質量180 ～ 220 g，由湖北省疾病預防控制中心動物實驗中心提供，動物合格證號：No.42000600000206，實驗動物生產許可證號：SCXK(鄂)2008-0005。動物飼養于SPF級動物房，保持室溫(24±2)℃，相對濕度(55±10)%，每日給予大鼠標準食物和飲水，12 h光照、12 h黑暗循環飼養。實驗前室內適應性飼養7 d。所有實驗均嚴格按照實驗動物有關條例進行。

1.2 試劑與藥物 普適泰片(商品名：舍尼通，規格：每片74 mg，批號：12082700，南京美瑞制藥有限公司)；IL-1β試劑盒(批號：R130507-007a)、TNF-α試劑盒(批號：R130507-102a)和IL-10試劑盒(批號：R130507-004a)均由武漢博士德生物工程有限公司提供；角叉菜膠(美國Sigma公司，批號：1408463v)。其他試劑均為分析純有機試劑。

1.3 藥材 地梗鼠尾草全草于2010年9月采于湖北省恩施市(北緯30.2°，東經109.3°，海拔700 m)，由華中科技大學同濟醫學院藥學院汪建平博士鑒定為唇形科鼠尾草屬植物地埂鼠尾草(Salviascapiformis)，植物標本存放于華中科技大學同濟醫學院天然藥物化學教研室(No.2010-0902)。

1.4 熊果酸的分離制備及實驗藥物準備 干燥的地埂鼠尾草27 kg經機械粉碎成小段約1 cm，用丙酮(150 L)在室溫下冷浸提取3次，每次3 d，每次提取液減壓蒸干得到的浸膏，合并后得到總浸膏1 300 g。經正、反相硅膠柱柱層析和重結晶得到純度>99.5% UA約40 g。將純化得到UA和陽性藥普適泰片分別混懸于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中，得到合適濃度實驗藥物溶液備用。

1.5 動物分組、造模與給藥 將42只雄性SD大鼠隨機分成正常對照組、模型對照組、普適泰組、熊果酸大劑量組和小劑量組，每組大鼠分別為8，10，8，8，8只。參照文獻[10]，在實驗室條件下，對模型對照組、普適泰組、熊果酸大劑量組和小劑量組分別建立CNP模型。待實驗大鼠適應環境后，每只大鼠給予10%水合氯醛溶液350 mg·kg-1進行麻醉，剪去毛發，擦拭碘酒，于無菌條件下沿腹部正中切開皮膚和肌層，用鑷子輕提膀胱和兩側精囊，暴露前列腺背葉；于前列腺左右兩側葉分別注入2%角叉菜膠注射液0.05 mL。注射完畢后，在縫合處涂抹少量青霉素，然后逐步縫合肌層和皮膚，放回鼠籠，自由飲食，用碘酒在手術傷口滅菌，每天2或3次直至傷口愈合。用同樣的實驗方法對正常對照組中大鼠的前列腺兩側葉分別注入0.9%氯化鈉溶液0.05 mL。造模第8天開始給藥。普適泰組灌胃給予普適泰藥液148 mg·kg-1·d-1[11]，熊果酸大劑量組和小劑量組分別灌胃給予UA藥液100和50 mg·kg-1·d-1[12]。正常對照組和模型對照組灌胃給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。連續給藥20 d。

1.6 樣本采集 最后一次給藥后12 h內，所有大鼠禁食不禁水。對所有大鼠稱定質量并記錄后，摘眼球取血，在高速低溫離心機中以850×g離心10 min，取其上清液立刻凍存于-70 ℃的冰箱中，用于測定IL-1β、TNF-α和IL-10的水平。大鼠處死后，迅速剖腹，剔除粘連的結締組織和脂肪組織等，摘取前列腺組織的左右兩側葉，浸沒于0.9%氯化鈉溶液中清洗干凈，然后用吸水紙吸去表面0.9%氯化鈉溶液，稱量總濕重，用于計算前列腺指數。稱定質量后的前列腺組織，一部分迅速浸潤在10%甲醛溶液中固定，用于病理學檢查。剩余部分的前列腺組織凍存于-70 ℃冰箱中以備用。

1.7 前列腺指數的測定 在一般動物實驗中，前列腺指數常常被用來檢測CNP的炎癥大小。通過記錄每只大鼠的自身體質量及其前列腺組織的總濕重，即可得到相應的前列腺指數。前列腺指數=前列腺組織總濕重/大鼠體質量(單位：mg·g-1)。

1.8 大鼠血清中IL-1β，TNF-α和IL-10的含量測定 被凍存在-70 ℃冰箱中的大鼠血清，取出后，溫水浴中解凍后，迅速按照ELISA試劑盒說明方法進行IL-1β，TNF-α和IL-10三種細胞因子的含量測定。

1.9 大鼠前列腺組織的病理學檢查 已通過10%甲醛溶液固定好的大鼠前列腺組織分別進行蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色，光鏡顯微鏡下觀察前列腺組織的病理切片并攝像，記錄前列腺組織的病理變化。

2 結果

2.1 前列腺指數測定 各組大鼠給藥期間體質量和行為狀態均未見明顯差異，且無動物死亡。由圖1可知，與正常對照組比較，模型對照組前列腺指數顯著增高，說明本實驗CNP大鼠實驗模型制備成功。與模型對照組比較，熊果酸大劑量組和小劑量組大鼠PI差異均有統計學意義，說明UA在劑量為50和100 mg·kg-1·d-1時對CNP均有一定治療作用。

2.2 大鼠血清中IL-1β，TNF-α和IL-10含量測定 結果見表1。表1顯示，與正常對照組比較，其他組大鼠血清IL-1β、TNF-α和IL-10水平均有不同程度升高。其中，模型對照組升高程度最顯著。與模型對照組比較，普適泰組和熊果酸大劑量組均呈下降趨勢(P<0.05)，但與正常對照組比較，差異無統計學意義。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.普適泰組；D.熊果酸大劑量組；E.熊果酸小劑量組；與正常對照組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.01，*3P<0.05

圖1 5組大鼠前列腺指數測定值

A.normal control group；B.model control group；C.Pushitaigroup；D.ursolic acid high-dose group；E.ursolic acid low-dose group；Compared with normal control group，*1P<0.01；Compared with model control group，*2P<0.01，*3P<0.05

Fig.1 Prostate index (PI) of five groups of rats

2.3 大鼠前列腺組織病理檢查結果 見圖2。病理檢

查顯示，正常對照組前列腺組織形態結構比較完整，前列腺腺腔排列緊密，較規則，腺腔血液充盈，腺腔與腺腔間少有炎癥細胞浸潤。模型對照組前列腺組織呈現嚴重病理變化，腺腔不規則，且呈現不同程度前列腺增生，間質內明顯可見大量淋巴細胞、中性粒細胞等炎癥細胞浸潤，間質水腫，充血嚴重。與模型對照組比較，普適泰組、熊果酸大劑量組、小劑量組前列腺組織均表現出不同程度改善。

3 討論

由本實驗結果可知，與模型對照組比較，50和100 mg·kg-1·d-1UA均可顯著降低模型大鼠前列腺指數，對CNP有一定治療作用。細胞因子在CNP的發病機體中常常表現為不同程度的升高和降低[13]，大量的研究發現：促炎癥細胞因子，如TNF-α和IL-1β在炎癥反應中通過加氧酶加速前列腺素 E2(prostaglandin E2，PGE2)合成，由于PGE2具有較強的致炎作用，從而導致炎癥的產生。在機體自我免疫調解中，抗炎癥細胞因子如IL-10通過抑制促炎癥細胞因子和趨化因子的產生，從而抑制炎癥細胞的黏附浸潤，促進組織的修復再生[14]。本實驗采用ELISA試劑盒測定大鼠血清中IL-1β、TNF-α和IL-10的水平，與模型對照組比較，熊果酸大劑量、小劑量組呈顯著性降低。該結果表明UA在發揮治療作用的過程中，可能通過調節多種細胞因子的表達進而起到改善前列腺炎的炎癥狀況。前列腺組織切片顯示UA對前列腺炎病理組織具有明顯的改善作用，也證明以上結論。

表1 5組大鼠血清中IL-1β、TNF-α和IL-10的水平

與正常對照組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.01，*3P<0.05Compared with normal control group，*1P<0.01；Compared with model control group，*2P<0.01，*3P<0.05

A.正常對照組；B.模型對照組；C.普適泰組；D.熊果酸大劑量組；E.熊果酸小劑量組

A.normal control group；B.model control group；C.Pushitaigroup；D.ursolic acid high-dose group；E.ursolic acid low-dose group

Fig.2 Histopathological images of prostates in five groups of rats (HE，×100)

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2016年全國醫藥學術交流會暨

臨床藥學與藥學服務研究進展培訓班征文通知

隨著醫藥衛生體制改革的不斷深入和發展，保障患者用藥安全、有效、經濟、適當，已經成為社會關注的熱點和焦點。為促進臨床醫師、藥師、護士間溝通與交流，提高合理用藥水平，經中國藥理學會和《醫藥導報》編輯部研究，決定于2016年5月下旬在成都市舉辦“2016年全國醫藥學術交流會暨臨床藥學與藥學服務研究進展培訓班”。會議主題：臨床藥學服務與藥物警戒實踐。會議由中國藥理學會主持，《醫藥導報》編輯部承辦。屆時將邀請國內著名專家、學者就會議主題作專題報告，并進行學術交流和研討，凡參加會議的代表均可獲得國家繼續醫學教育學分10分。現將征文內容及有關事項通知如下。

1 征文內容

①藥物警戒制度的建立與實踐；②藥物相關問題與臨床藥學服務；③藥物配伍相容性與合理用藥；④藥物安全信號的發現與評價；⑤靜脈輸液用藥的安全及其規范建設；⑥上市后藥品有效性和安全性再評價；⑦用藥差錯的表現與防范措施；⑧藥品不良反應監測與個案報道;⑨防止抗菌藥物濫用的對策與經驗介紹;⑩與會議主題相關的其他內容。

2 征文要求

未公開發表的論文均可作為本次征文稿件，來稿全文在4 000字以內(論文撰寫格式請參照《醫藥導報》2015年第1期投稿須知或登陸《醫藥導報》網站首頁查看)，綜述不超過5 000字。論文請通過《醫藥導報》網站(www.yydbzz.com或者www.yydb.cn)在線投稿，并請在論文首頁右上角注明“會議征文”。與會代表提交的論文均將作為大會交流材料，若經大會學術組研究同意，優秀論文可作大會發言，請論文發言者預先制作Powerpoint課件并按時與會。征文經有關專家審閱通過后，可在《醫藥導報》(中國藥理學會主辦，國家科技部中國科技論文統計源期刊正刊或增刊發表。征文截止時間：2016年3月30日。會議具體時間地點將另行通知。編輯部地址：武漢市解放大道1095號同濟醫院《醫藥導報》編輯部，郵編：430030，電話：027-83643083，027-83666619(fax)，E-mail：yydbzz@163.com。

中國藥理學會

Effect of Ursolic Acid on Chronic Nonbacterial Prostatitis in Rats

LIU Yanfei1, HAN Pan2, LAI Yongji2

(1.DepartmentofPediatrics, 2.DepartmentofPharmacy,theCentralHospitalofWuhanCity,Wuhan430014,China)

Objective To investigate the therapeutic effect and mechanism of ursolic acid on carrageenan-induced chronic nonbacterial prostatitis (CNP) of SD rats. Methods Forty-two SD rats were randomly divided into five groups: normal control group, model control group,Pushitaigroup, ursolic acid high-dose group, and low-dose group.Except for normal control group, chronic nonbacterial prostatitis model was established using carrageenan.The rats ofPushitaigroup were treated with the solution ofPushitaiat the dose of 148 mg·kg-1·d-1for twenty days.The rats of ursolic acid high-dose and low-dose groups were administered with ursolic acid at the doses of 100 and 50 mg·kg-1·d-1for twenty days, respectively.The rats of normal and model control groups were treated with isometric 5% CMC-Na for twenty days.The prostate index (PI) was calculated from the ratio of isolated rat prostate weight and body weight of rat.The expressions of IL-1β, TNF-α, and IL-10 were detected by ELISA.The histology and morphology of the prostate was observed with the aid of hematoxylin-eosin staining. Results Compared with the model control group, PI and the levels of IL-1β, TNF-α, and IL-10 in serum were significantly decreased in ursolic acid high-dose,and low dose groups (P<0.05).Moreover, the pathological changes of prostate were improved significantly. Conclusion Ursolic acid has certain therapy effects on chronic nonbacterial prostatitis, which may be related to its regulating the expressions of IL-1β, TNF-α, and IL-10.

Ursolic acid；Prostatitis, nonbacterial, chronic；Enzyme-linked immuno-sorbent assay

2014-08-07

2014-11-18

劉雁飛 (1981-)，女，吉林白城人，醫師，碩士，主要從事兒科工作。電話：027-82201767，E-mail：blania_aifei@126.com。

賴永繼 (1986-)，男，河南駐馬店人，藥師，博士，主要從事天然藥物生物活性研究。電話：027-82201722，E-mail：laiyongji1024@163.com。

R965；R697.33

A

1004-0781(2015)10-1292-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.10.007