頭孢地尼膠囊在健康人體的生物等效性研究

陳芬，朱超然，翟學(xué)佳，馮霞，鄧桂萍，郭卿，蔣立芬，呂永寧

(1.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院藥劑科，武漢 430022；2.石家莊市華新藥業(yè)有限責(zé)任公司，石家莊 050091；3.河北省人民醫(yī)院體檢中心，石家莊 050051)

頭孢地尼膠囊在健康人體的生物等效性研究

陳芬1，朱超然1，翟學(xué)佳1，馮霞1，鄧桂萍1，郭卿2，蔣立芬3，呂永寧1

(1.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院藥劑科，武漢 430022；2.石家莊市華新藥業(yè)有限責(zé)任公司，石家莊 050091；3.河北省人民醫(yī)院體檢中心，石家莊 050051)

目的 評價健康人餐后服用兩種頭孢地尼膠囊的生物等效性。方法 24例男性健康志愿者餐后隨機交叉單劑量口服頭孢地尼膠囊受試制劑或參比制劑，頭孢地尼體內(nèi)血藥濃度采用液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)(LC-MS/MS)法測定，藥動學(xué)參數(shù)及等效性采用藥動學(xué)軟件DAS計算和評價。結(jié)果 受試制劑和參比制劑的主要藥動學(xué)參數(shù)如下：AUCt分別為(4.35±1.09)和(4.12±1.22) μg·h·mL-1，AUC0-∞分別為(4.53±1.12)和(4.53±1.73)μg·h·mL-1，t1/2分別為(1.74±0.29)和(2.13±1.65) h，tmax分別為(4.44±0.86)和(4.54 土1.16) h，Cmax分別為(900±250)和(876±269) ng·mL-1。結(jié)論 頭孢地尼膠囊受試制劑與參比制劑具有生物等效性。

頭孢地尼膠囊；液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)聯(lián)用；藥動學(xué)；生物等效性

頭孢地尼是第3代頭孢菌素類抗菌藥物，1988年由日本藤澤藥品工業(yè)公司合成，1991年在日本上市，1997年被美國食品藥品管理局(FDA)批準臨床使用[1]。頭孢地尼對革蘭陰性菌和革蘭陽性菌均具有廣泛的抗菌譜，其抗菌機制主要是抑制細菌細胞壁合成，并且對各種細菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定，因而對可產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的細菌也具有優(yōu)異的抗菌活性[2]。頭孢地尼對革蘭陽性菌中的葡萄菌屬、鏈球菌屬等的抗菌活性比以往的口服頭孢菌素更強[3]。筆者在本試驗采用液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)聯(lián)用(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)法測定血漿頭孢地尼濃度，研究受試制劑和參比制劑頭孢地尼膠囊在健康志愿者體內(nèi)的餐后藥動學(xué)和生物等效性，以期為臨床用藥提供參考。

1 試藥與儀器

1.1 試藥 受試制劑：頭孢地尼膠囊，批號：310130107，規(guī)格：每粒0.1 g，石家莊市華新藥業(yè)有限責(zé)任公司；參比制劑：頭孢地尼膠囊(商品名：全澤復(fù)，批號：023730，規(guī)格：每粒0.1 g，日本藤澤藥品工業(yè)公司)；頭孢地尼對照品(批號：30502-201002，中國食品藥品檢定研究院，含量：95.6%)。頭孢克洛對照品(內(nèi)標)(批號：130481-200503，中國食品藥品檢驗研究院，含量：93.2%)。

1.2 儀器 高效液相色譜儀器：安捷倫1200液相色譜儀，含G1322A在線脫氣機、G1311A高壓四元泵、G1329A自動進樣器、G1316A柱溫箱。質(zhì)譜儀器：API 4000 LC-MS/MS System，配備電噴霧離子化源(ESI)，美國ABI公司。色譜工作站：Analyst 1.5。Shimadzu電子分析天平(AUW220D，日本島津公司，感量：0.1/0.01 mg)、LEGEND MICRO 21R臺式高速離心機(武漢赤誠生物技術(shù)有限公司)、 XW-80A微型旋渦混和儀(上海瀘西分析儀器廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 研究對象 24例受試者均為男性，年齡(22.13±1.48)歲，身高 (173.58±5.42) cm，體質(zhì)量(65.04±6.52)kg，體重指數(shù)為(21.56±1.51) kg·(m2)-1，試驗前血常規(guī)、尿常規(guī)、肝功能、腎功能、乙型肝炎、丙型肝炎、人類免疫缺陷病毒抗體檢測、心電圖檢查等均正常，無心、肝、腎、代謝異常等病史，無慢性胃腸道疾病，無藥物過敏史及藥物依賴史，無精神病史，不嗜煙酒，試驗前2周內(nèi)及試驗期間均未服用任何藥物。本試驗方案通過華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查。試驗前受試者在了解本項研究的目的、意義、步驟、利益和可能發(fā)生的損害后簽署知情同意書。

2.2 給藥方案與血樣采集 本試驗采用雙周期自身交叉對照試驗設(shè)計。24例受試者隨機分為兩組，每組每次試驗餐后單次口服受試制劑或參比制劑，兩次試驗間的清洗期為7 d。受試者于前1天入住，晚上統(tǒng)一清淡飲食，禁食10 h、不禁水過夜。次日早晨吃標準早餐。早餐包括饅頭約100 g、稀飯約150 mL及用菜籽油約20 mL烹飪的豬肉75 g(肥瘦比為2：1)，煎蛋1枚和蔬菜100 g。吃完早餐半小時后，飲水200 mL服受試制劑或參比制劑1粒。服藥后2 h方再飲水，4 h內(nèi)不得躺下，以免影響胃腸蠕動，4和10 h統(tǒng)一進餐，并按試驗方案在服藥前后不同時間采取血樣，密切觀察。受試者在試驗當(dāng)日不得離開監(jiān)護室內(nèi)，禁止劇烈運動、吸煙、飲酒等。

采血時間點為服藥前(0 h)和服藥后1，2，3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，7，8，10，12 h。每次經(jīng)肘靜脈取血4 mL置于含乙二胺四醋酸(EDTA)的抗凝管中，血樣30 min內(nèi)900×g離心10 min，分離血漿，置-80 ℃冰箱備用。

2.3 方法學(xué)考察與評價

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Waters Atlantis?d C18色譜柱 (2.1 mm×150 mm，5 μm)；預(yù)柱：C18保護柱(4 mm×3.0 mm，美國Phenomenex公司)；流動相：甲醇-0.3%甲酸水溶液=(38：62)；流速：0.3 mL·min-1；進樣量：10 μL；柱溫：40 ℃；進樣器溫度：4 ℃。

2.3.2 質(zhì)譜條件 離子檢測方式：選擇性離子檢測(MRM)；離子極性：正離子；離子化方式：氣動輔助電噴霧離子化(ESI)；檢測對象：頭孢地尼，[M+H]+離子對m/z396.1→227.1，頭孢克洛，[M+H]+離子對m/z368.0→174.2；DP電壓：頭孢地尼為60.00 V，頭孢克洛為69.00 V；CE電壓：頭孢地尼為19.00 V，頭孢克洛為18.00 V；EP電壓：頭孢地尼為10.00 V，頭孢克洛為10.00 V；CXP電壓：頭孢地尼為12.00 V，頭孢克洛為4.00 V；IS：5 500 V；CUR：172.375 kPa；CAD：41.370 kPa；溫度：550 ℃；GAS1：344.750 kPa；GAS2：344.750 kPa。

2.3.3 血漿樣品處理 精密吸取血漿200 μL至1.5 mLEP管中，加入10 mmol·L-1乙酸銨水溶液20 μL，加入內(nèi)標溶液(5 280 ng·mL-1)20 μL，渦旋20 s，再加入甲醇500 μL，渦旋1 min，14 800 r·min-1離心15 min(有效離心半徑8.5 cm)，取上清液200 μL于另一1.5 mL EP管中，用等量10 mmol·L-1乙酸銨水溶液稀釋，渦旋20 s后，14 800 r·min-1離心5 min，取上清液200 μL于進樣瓶中，進樣10 μL進行分析，并記錄色譜圖。

2.3.4 特異性 本試驗在上述色譜條件下，頭孢地尼及內(nèi)標的保留時間分別為2.6和2.8 min。頭孢地尼和內(nèi)標峰形良好，與空白血漿樣品的色譜圖進行比較，出峰位置無雜峰干擾測定(圖1～3)，說明本方法具有較高的特異性，能準確測定血漿頭孢地尼濃度。

2.3.5 標準曲線與定量下限 精密吸取空白血漿200 μL，加各系列的標準溶液20 μL，配制成濃度分別為10.14，50.7，126.75，253.5，430.95，887.25，1 267.5 ng·mL-1的頭孢地尼血漿樣品，按“血漿樣品處理”項下，自“加入內(nèi)標工作液20 μL”起同法操作，記錄色譜圖；以待測物濃度(C)為橫坐標，待測物與內(nèi)標物的峰面積比值(f)為縱坐標，用加權(quán)(W=1/x2)最小二乘法進行回歸運算，得到標準曲線方程為Y=0.004 84X+0.029 6(r=0.999 2)。根據(jù)標準曲線方程，本分析方法下頭孢地尼的線性范圍應(yīng)為10.14～1 267.5 ng·mL-1。

2.3.6 殘留效應(yīng) 在測定定量上限(ULOQ)樣本之后測定1個空白血漿樣本和1個定量下限(LLOQ)樣本。上述測定流程重復(fù)3次。殘留效應(yīng)因子為上述空白血漿樣本中分析物和內(nèi)標的峰面積除以定量下限樣本中分析物和內(nèi)標的峰面積(3個樣本平均峰面積)。頭孢地尼和內(nèi)標的殘留效應(yīng)因子分別為10.7%和0%。結(jié)果表明，內(nèi)標無殘留效應(yīng)，頭孢地尼殘留效應(yīng)在可接受范圍內(nèi)。

2.3.7 基質(zhì)效應(yīng) 精密吸取空白血漿樣品200 μL，共計12份，置于1.5 mL EP管中，加入10 mmol·L-1乙酸銨溶液20 μL，加甲醇500 μL，渦旋1 min，于14 800r·min-1離心15 min，分別吸取各管全部上清液作為基質(zhì)，加入內(nèi)標溶液20 μL，每6份分別加入低濃度(30 ng·mL-1)和高濃度(1 000 ng·mL-1)的2個濃度的QC溶液渦旋20 s，然后取200 μL于另一1.5 mL EP管中，加入等量的 10 mmol·L-1乙酸銨水溶液稀釋，渦旋20 s后，于14 800 r·min-1離心5 min，取上清液200 μL于進樣瓶中，進樣10 μL，獲得相應(yīng)峰面積。同時另取200 μL的10 mmol·L-1乙酸銨溶液代替空白血漿，按上述處理，獲得相應(yīng)的峰面積，每一濃度進行3樣本分析。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計算基質(zhì)效應(yīng)。計算得到血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對低、高2個濃度血漿樣本中頭孢地尼的基質(zhì)效應(yīng)因子分別為(67.20±5.82)%和(53.37±7.90)%，內(nèi)標頭孢克洛的基質(zhì)效應(yīng)因子為(69.95±11.25)%。經(jīng)內(nèi)標歸一化后低、高2個濃度基質(zhì)效應(yīng)因子CV為6.88%和5.27%，均在15%之內(nèi)。

A.頭孢地尼；B.頭孢克洛

圖2 受試者空白血漿加入頭孢地尼溶液(A)和內(nèi)標工作液(B)色譜圖

Fig.2 Chromatogram of blank plasma spiked with cefdinir (A ) and internal standard (B)

A.頭孢地尼；B.頭孢克洛

圖3 受試者第1周期口服頭孢地尼膠囊0.1 g后3.5 h血漿樣品色譜圖

Fig.3 Chromatogram of plasma sample of the volunteer 3.5 h after oral administration of 0.1 g cefdinir at the first cycle

2.3.8 準確度與精密度 按“血漿樣本處理”項操作，處理定量下限(10 ng·mL-1)、低(30 ng·mL-1)、中(300 ng·mL-1)、高(1 000 ng·mL-1)4個濃度的QC樣本，每濃度平行6個，測定分析批3個，QC樣本的濃度以同一分析批的標準曲線計算，根據(jù)測定結(jié)果計算方法的準確度與精密度。定量下限測定的濃度與理論濃度不超過±20%。低、中、高濃度QC樣本測定濃度與理論濃度的RE均不超過±15%，各濃度QC樣本的平均測定濃度與理論濃度的RE均不超過±15%，且批內(nèi)、批間RSD均不大于15%。

2.3.9 提取回收率 從血漿基質(zhì)中回收得到的分析物的色譜峰面積與分析物純標準品的峰面積之比為樣品的提取回收率。本實驗考察頭孢地尼低、中、高濃度的QC樣本和內(nèi)標的提取回收率。低、中、高濃度血漿樣本中頭孢地尼的提取回收率分別為(93.79±2.57)%，(77.38±4.91)%和(81.46±4.82)%；血漿樣本中內(nèi)標頭孢克洛的提取回收率為(78.10±1.00)%。

2.3.10 穩(wěn)定性試驗 分別考察血漿樣本室溫放置2 h穩(wěn)定性(RSD≤3.27%)，血漿樣本處理后進樣器放置22 h穩(wěn)定性(RSD≤4.35%)，血漿樣本反復(fù)凍融3次穩(wěn)定性(RSD≤1.9%)，血漿樣本凍存30 d穩(wěn)定性(RSD≤8.50%)。結(jié)果表明含頭孢地尼的血漿樣品穩(wěn)定性良好。

2.4 血藥濃度-時間曲線 24例健康男性受試者餐后單次口服受試制劑和參比制劑后，血漿頭孢地尼濃度-時間曲線見圖4。

2.5 藥動學(xué)參數(shù) 經(jīng)DAS3.2.1版軟件計算求得24例健康受試者餐后單次口服頭孢地尼受試制劑和參比制劑后，血漿頭孢地尼的藥動學(xué)參數(shù)見表1。受試制劑與參比制劑各藥動學(xué)參數(shù)采用t檢驗進行比較，結(jié)果差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖4 24例健康受試者口服參比制劑和受試制劑后血漿頭孢地尼平均濃度-時間曲線

Fig 4 Average plasma concentration-time curve after oral administration of reference and test preparation in 24 healthy volunteers

表1 24例健康受試者單次口服頭孢地尼受試制劑和參比制劑的藥動學(xué)參數(shù)

藥物AUC0-tAUC0-∞(μg·h·mL-1)參比制劑4.12±1.224.53±1.73受試制劑4.35±1.094.53±1.12藥物Cmax/(ng·mL-1)tmaxt1/2h參比制劑876±2694.54±1.162.13±1.65受試制劑900±2504.44±0.861.74±0.29

2.6 生物等效性分析 將對數(shù)轉(zhuǎn)化后的受試制劑和參比制劑的平均藥動學(xué)參數(shù)Cmax、AUC0-t、AUC0-∞進行方差分析，采用雙向單側(cè)t檢驗及[1-2ɑ]%置信區(qū)間法進行生物等效性評價，其中tmax采用非參數(shù)法(Wilcoxon秩和檢驗)檢驗。結(jié)果表明，Cmax、AUC0-t、AUC0-∞均拒絕生物不等效假設(shè)；受試制劑經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后的Cmax的90%置信區(qū)間為95.4%～111.5%，在參比

制劑的70%～145%內(nèi)，受試制劑經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后的AUC0-t和AUC0-∞的90%置信區(qū)間為100.6%～113.3%和94.6%～112.2%，均在參比制劑的80%～125%內(nèi)，且受試制劑與參比制劑的tmax經(jīng)非參數(shù)法檢驗差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。表明餐后口服受試制劑和參比制劑具有生物等效性。

3 討論

本試驗參考國內(nèi)外文獻[1，4-7]，建立LC-MS/MS的檢測方法，頭孢地尼和頭孢克洛(內(nèi)標)保留時間均<3 min，樣品分析時間短，靈敏度高，定量下限達到10 ng·mL-1，且專屬性強。本試驗采用甲醇沉淀蛋白法處理血漿樣品，方法簡單、快速、成本低。試驗過程中發(fā)現(xiàn)，如果用甲醇沉淀后上清液直接進樣靈敏度低，定量下限達不到10 ng·mL-1，而乙酸銨溶液能提高頭孢地尼的檢測靈敏度，甲醇沉淀蛋白后的上清液用10 mmol·L-1乙酸銨溶液稀釋1倍后進樣檢測，靈敏度大大提高。這可能是因為頭孢地尼極性較大，用乙酸銨溶液稀釋更加利于頭孢地尼的離子化，從而提高頭孢地尼的檢測靈敏度。

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Study on Bioequivalence of Cefdinir Capsules in Chinese Healthy Volunteers

CHEN Fen1, ZHU Chaoran1, ZHAI Xuejia1, FENG Xia1, DENG Guiping1, GUO Qing2, JIANG Lifen3, LYU Yongning1

(1.DepartmentofPharmacy,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China；2.ShijiazhuangHuaxinPharmaceuticalCo.,Ltd,Shijiazhuang050091,China；3.MedicalExaminationCenterofHebeiGeneralHospital,Shijiazhuang050051,China)

Objective To evaluate postprandial pharmacokinetics and bioequivalence of two preparations of cefdinir capsules in Chinese healthy volunteers. Methods In a two-way cross-over study, 24 healthy male volunteers were divided into two groups randomly and a single dose of cefdinir capsules of test and reference preparation were administered orally, respectively.The concentration in plasma was determined by LC-MS/MS.Pharmacokinetic parameters and bioequivalence were calculated and evaluated by DAS. Results The main pharmacokinetic parameters of test and reference were as follows: AUCt(4.35±1.09) μg·h·mL-1and (4.12±1.22) μg·h·mL-1, AUC0-∞(4.53±1.12) and (4.53±1.73) μg·h·mL-1,t1/2(1.74±0.29) h and (2.13±1.65) h,tmax(4.44±0.86) h and (4.54 土1.16) h,Cmax(900±250) ng·mL-1and (876±269) ng·mL-1. Conclusion The test and reference preparation of cefdinir capsules are bioequivalent.

Cefdinir capsules；Liquid chromatography-tandem mass spectrometry；Pharmacokinetics；Bioequivalence

2014-06-12

2014-08-31

陳芬(1990-)，女，湖北武漢人，碩士，研究方向：藥動學(xué)及藥物相互作用。電話：027-85726073，E-mail：1053228154@qq.com。

呂永寧(1967-)，男，副主任藥師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：藥動學(xué)及藥物相互作用。電話：027-85726073，E-mail：lvyongning67@hotmail.com。

R978.11；R969.1

A

1004-0781(2015)10-1288-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.10.006