熄風(fēng)通腦膠囊對局灶性腦缺血-再灌注損傷大鼠腦組織TNF-α和IL-1β的影響*

曾聰彥，胡瑩，高玉橋，梅全喜，林慧，戴衛(wèi)波，張文霞

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山中醫(yī)院藥學(xué)部，中山 528400)

·藥物研究·

熄風(fēng)通腦膠囊對局灶性腦缺血-再灌注損傷大鼠腦組織TNF-α和IL-1β的影響*

曾聰彥，胡瑩，高玉橋，梅全喜，林慧，戴衛(wèi)波，張文霞

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山中醫(yī)院藥學(xué)部，中山 528400)

目的 探討熄風(fēng)通腦膠囊對局灶性腦缺血-再灌注損傷大鼠腦組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-1β(IL-1β)含量的影響。方法 健康斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?SD)大鼠120 只，隨機分為6組，假手術(shù)組、模型對照組，生長腦心通組，熄風(fēng)通腦膠囊大劑量組，中劑量組和小劑量組。各組大鼠造模前進行預(yù)防性給藥，生長腦心通組給予步長腦心通0.864 g·kg-1，大劑量組、中劑量組和小劑量組藥物組分別給予熄風(fēng)通腦膠囊內(nèi)容物3.456，1.720，0.864 g·kg-1，假手術(shù)組、模型對照組給予等體積純化水，連續(xù)灌胃給藥7 d，每天1次。末次給藥后1 h，采用改良線栓法(MACO)制備大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷模型，假手術(shù)組只麻醉剝離不插入線栓；24 h后取腦，用酶聯(lián)免疫法檢測大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β的含量。結(jié)果 熄風(fēng)通腦膠囊大劑量組、中劑量組和小劑量組組TNF-α分別為(35.34±8.95)，(33.75±6.92)，(40.95±5.39)ng·L-1，IL-1β分別為(1.44±0.47)，(1.45±0.23)，(1.61±0.33) ng·L-1，生長腦心通組TNF-α、IL-1β分別為(38.96±9.84)和(1.56±0.31) ng·L-1，模型對照組分別為(52.74±6.76)和(2.79±0.45) ng·L-1，假手術(shù)組分別為(32.54±4.00)和(1.32±0.22) ng·L-1。模型對照組大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量均明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)。熄風(fēng)通腦膠囊大劑量組、中劑量組和小劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量降低(均P<0.05)。結(jié)論 熄風(fēng)通腦膠囊可通過抑制腦組織TNF-α、IL-1β的升高，減輕缺血時炎性損傷，對腦缺血大鼠腦組織產(chǎn)生一定程度的保護作用。

熄風(fēng)通腦膠囊；損傷，腦缺血-再灌注；腫瘤壞死因子；白細胞介素

腦血管疾病發(fā)病率、致殘率、病死率均高，是當(dāng)今世界人類死亡的三大主要疾病之一。其中，缺血性腦卒中發(fā)病率最高，且呈上升趨勢，約占腦血管疾病 70%，嚴重威脅人類的健康[1]。隨著近年來對缺血性腦損傷研究的不斷深入，有關(guān)炎癥因子對早期缺血性腦組織損傷的作用也成為研究熱點，其中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)等屬于促炎癥細胞因子，在顱腦損傷后表達明顯增加，起著重要作用[2]。 熄風(fēng)通腦膠囊是廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山中醫(yī)院根據(jù)中醫(yī)理論及多年臨床實踐而研制的治療急性期缺血性腦中風(fēng)的方藥。為進一步闡明其作用機制，筆者在本實驗中通過建立大鼠急性腦缺血-再灌注模型，觀察該制劑對大鼠腦組織TNF-α、IL-1β等炎癥因子表達水平的影響，以探討其治療急性期缺血性腦中風(fēng)的作用機制，為熄風(fēng)通腦膠囊的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級雄性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley，SD)大鼠，體質(zhì)量280～350 g，購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2013-0020。所有動物均飼養(yǎng)于中山市中醫(yī)院中藥藥理實驗室內(nèi)，實驗動物使用許可證號：SYXK(粵)2010-0109，飼養(yǎng)期間大鼠自由飲水、攝食，室內(nèi)溫度20～24 ℃，相對濕度40%～60%。

1.2 試劑與儀器 熄風(fēng)通腦膠囊(中山市中醫(yī)院制劑室，批準文號：粵藥制字Z20110102，批號：20130911)；步長腦心通膠囊(咸陽步長制藥有限公司，批號：130149)；TNF-α試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20131203)；IL-1β試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20131203)；釣魚尼龍線，直徑0.26 mm，日本生產(chǎn)；Muitiskan MLB3酶標儀[熱電(上海)儀器有限公司]；GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.3 動物分組、給藥途徑及藥量 選取健康SPF級雄性SD大鼠120只，正常飼養(yǎng)7 d后，按體質(zhì)量隨機分為假手術(shù)組、模型對照組、生長腦心通組、熄風(fēng)通腦膠囊大劑量組、中劑量組和小劑量組。各組大鼠造模前進行預(yù)防性給藥，生長腦心通組給予步長腦心通0.864 g·kg-1，大劑量、中劑量和小劑量藥物組分別給予熄風(fēng)通腦膠囊內(nèi)容物3.456，1.720，0.864 g·kg-1，假手術(shù)組、模型對照組給予等體積純化水，連續(xù)灌胃給藥7 d，每天1次。末次給藥后1 h，除假手術(shù)組外，其余各組大鼠均采用改良線栓法制備大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷模型，假手術(shù)組只麻醉剝離不插入線栓。

1.4 動物模型制備 末次灌胃1 h后對大鼠手術(shù)造模，術(shù)前12 h禁食，不禁水。參照ZEA-LONGA等[3]的大腦中動脈線栓法，并加以改良。用魚線制備線栓，頭端燒圓口，并在線栓1.8～2.5 cm處做好標記。以10%水合氯醛(350 mg·kg-1)腹腔麻醉大鼠后，仰臥位固定，頸部備皮，消毒皮膚，在頸部正中切口，分離皮下筋膜及肌肉組織，充分暴露右側(cè)頸總動脈及頸內(nèi)動脈、外動脈，結(jié)扎頸總動脈、頸外動脈，于頸總動脈分叉切口處向頸內(nèi)動脈插入線栓至之前標記處，感覺有阻力即達到大腦中動脈起始部，完全阻斷其血流，結(jié)扎頸內(nèi)動脈。術(shù)后縫合傷口，用0.9%氯化鈉溶液浸泡紗布覆蓋傷口，并于2 h后拔出魚線。手術(shù)期間及術(shù)后24 h應(yīng)保持大鼠肛溫維持在37 ℃。假手術(shù)組僅分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，而后縫合傷口[4-5]。

1.4.1 模型成功率檢測方法 由于該手術(shù)造模對大鼠的傷害比較大，所以該造模存在一定的死亡率，根據(jù)神經(jīng)功能缺損評分判定造模是否成功。

1.4.2 神經(jīng)功能缺損評分 參照ZEA-LONGA等[3]的局灶性腦缺血模型神經(jīng)功能缺陷評分標準進行評分。0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀，活動正常者；1分：不能完全伸展左側(cè)前肢者；2分：左側(cè)肢體癱瘓，行走使向左側(cè)旋轉(zhuǎn)，出現(xiàn)追尾現(xiàn)象者；3分：行走時向左側(cè)傾倒，或不能站立者；4分：無自發(fā)活動者。

1.5 制備腦組織勻漿 造模后24 h將大鼠麻醉，處死后取手術(shù)側(cè)大腦及腦前極到視交叉部位的腦組織，稱定質(zhì)量，冰浴條件下用0.9%氯化鈉溶液制備10%腦勻漿。勻漿液經(jīng)2 850×g離心10 min，取上清液，分裝，用于TNF-α、IL-1β含量的測定。

1.6 檢測方法 酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immuno-sorbent assay，ELISA)法檢測TNF-α、IL-1β含量。具體操作嚴格按照TNF-α、IL-1β試劑盒步驟進行，最后用酶標儀測定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)功能缺損評分 假手術(shù)組大鼠沒有神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，評分均為0分。模型對照組、生長腦心通組和熄風(fēng)通腦膠囊小劑量組、中劑量組、大劑量組均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀，在缺血再灌注24 h后，生長腦心通組、小劑量、中劑量、大劑量藥物組神經(jīng)功能缺損評分均小于模型對照組，其中生長腦心通組、熄風(fēng)通腦膠囊大劑量組與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；熄風(fēng)通腦膠囊小劑量組、中劑量組雖然也有一定改變，但效果不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。本實驗選取120只大鼠，其中假手術(shù)組10只，實際參與造模大鼠為110只，模型成功大鼠50只，造模成功率為45.5%。結(jié)果見表1。

表1 6組大鼠神經(jīng)功能缺損評分

與模型對照組比較，F(xiàn)=2.639， *1P<0.05Compared with model control group，F(xiàn)=2.639， *1P<0.05

2.2 大鼠腦組織中TNF-α含量 結(jié)果表明，大鼠腦缺血再灌注24 h后，與假手術(shù)組比較，各組大鼠腦組織勻漿中TNF-α表達比較均有不同程度的升高，模型對照組增高較為明顯(P<0.05)。與模型對照組比較，生長腦心通組及熄風(fēng)通腦膠囊小劑量組、中劑量組、大劑量組均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，結(jié)果見表2。

2.2 大鼠腦組織中IL-1β含量 結(jié)果表明，大鼠腦缺血再灌注24 h后，各組大鼠腦組織勻漿中IL-1β表達比較均有不同程度的升高，且模型對照組增高較為明顯(P<0.05)，與模型對照組比較，生長腦心通組及熄風(fēng)通腦膠囊小劑量組、中劑量組、大劑量組均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，結(jié)果見表2。

3 討論

腦缺血-再灌注損傷主要與炎癥反應(yīng)、興奮性氨基酸、細胞內(nèi)鈣超載、氧自由基和細胞凋亡等幾個方面因素有關(guān)[6]。研究表明[7]，顱腦創(chuàng)傷后可產(chǎn)生顱內(nèi)炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)在參與腦缺血再灌注損傷的諸多影響因素中是最重要的一環(huán)。盡管中樞神經(jīng)系統(tǒng)有血-腦屏障，但是損傷后它有類似外周器官的免疫激活，釋放大量免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)，炎癥反應(yīng)導(dǎo)致創(chuàng)傷后粘附分子表達、細胞滲透、炎性分子和生長因子分泌，導(dǎo)致細胞再生或死亡[8]。炎性細胞因子在腦組織超表達致使神經(jīng)元賴以存在的環(huán)境發(fā)生變化，使神經(jīng)元變性[9]。在

表2 6組大鼠腦組織中TNF-α和IL-1β含量的測定值

Tab.2 Content determination of TNF-α and IL-1β in brain of six groups of rats

與假手術(shù)組比較，TNF-α F=8.371，IL-1β F=23.883，*1P<0.05；與模型對照組比較，TNF-αF=7.489，IL-1β F= 22.70 *2P<0.05Compared with sham operation group,TNF-α F=8.371，IL-1β F=23.883，*1P<0.05；Compared with model control group，TNF-αF=7.489，IL-1β F= 22.70 *2P<0.05

這個過程中TNF-α與IL-1β是主要的促炎因子，它能激活并促進其他因素的發(fā)展，并和其他因素相互影響，造成缺血-再灌注損傷的加重[2]。TNF-α被認為全身炎性反應(yīng)的始動遞質(zhì)[10]，是腦損傷后最早出現(xiàn)的細胞因子，可直接導(dǎo)致循環(huán)阻力降低，血管通透性增加，血管內(nèi)皮細胞功能減退。TNF-α在外傷、炎癥時分泌增加，同時可誘導(dǎo)超大量的細胞因子釋放，如IL-1、IL-6、IL-8等，構(gòu)成炎癥損傷的放大效應(yīng)[11]。TNF-α適當(dāng)增加對機體起防御作用，但過度表達則有神經(jīng)毒性作用，它能增強血-腦屏障的通透性，引起白細胞浸潤和炎癥因子聚集，誘導(dǎo)細胞間黏附分子表達，而引發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)[12]，導(dǎo)致神經(jīng)細胞腫脹和壞死。研究表明[13]，TNF-α在腦損傷早期即可產(chǎn)生，且其含量升高越明顯神經(jīng)功能缺失越嚴重。ARVIN等[14]研究發(fā)現(xiàn)腦創(chuàng)傷后可大量合成和釋放TNF-α，同時其可誘導(dǎo)其他細胞因子IL-1β及炎癥遞質(zhì)的產(chǎn)生。IL-1β是血漿和組織液中的主要分泌形式，也是腦組織中主要形式[15]。IL-1β促炎作用的重要環(huán)節(jié)是激活腦內(nèi)的小膠質(zhì)細胞，激活的小膠質(zhì)細胞可通過釋放細胞因子、自由基等參與腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)；IL-1β還可以通過刺激內(nèi)皮細胞表達白細胞粘附分子，使白細胞聚集在損傷的腦組織周圍，加重腦損傷[16]。IL-1β作為早期產(chǎn)生的促炎細胞因子參與腦水腫的形成，血-腦屏障的破壞，以及誘導(dǎo)其他炎癥遞質(zhì)的大量表達。也就是說，在顱腦損傷早期，TNF-α，IL-1β之間存在著一個可放大且延續(xù)炎癥反應(yīng)的正反饋環(huán)，造成TNF-α，IL-1β的超量生成。故在顱腦損傷早期，抑制炎癥因子的表達可減輕由細胞因子造成的繼發(fā)性顱腦損害[17]。

熄風(fēng)通腦膠囊由三七、大黃、赤芍、石決明、珍珠母、蒲黃、鉤藤、牡丹皮、膽南星等10多味中藥組方而研制成。方中石決明、珍珠母平肝熄風(fēng)，潛陽降逆，為主藥；鉤藤、牡丹皮、赤芍以鎮(zhèn)肝熄風(fēng)，涼血化瘀，膽南星以清化痰濕，通經(jīng)活絡(luò)，大黃通腑泄熱，解毒祛邪，共為輔藥，佐以蒲黃、三七活血化瘀通絡(luò)；諸藥合用，共湊熄風(fēng)通腦、祛痰解毒、活血化瘀之功，故凡急性期缺血性腦中風(fēng)皆可運用。經(jīng)多年的臨床證實，發(fā)現(xiàn)本方對急性期缺血性腦中風(fēng)具有療效確切、副作用小等特點。本實驗在制備局灶性腦缺血-再灌注損傷模型基礎(chǔ)上，針對腦缺血-再灌注損傷炎癥反應(yīng)關(guān)鍵環(huán)節(jié)TNF-α和IL-1β的含量進行研究，結(jié)果顯示，模型對照組腦組織中TNF-α和IL-1β水平明顯高于假手術(shù)組，說明腦缺血-再灌注誘導(dǎo)細胞因子TNF-α和IL-1β的表達，而熄風(fēng)通腦膠囊能明顯降低腦組織中TNF-α和IL-1β的水平，提示熄風(fēng)通腦膠囊能抑制腦缺血-再灌注后TNF-α和IL-1β的表達，具有抑制炎癥反應(yīng)，并最大程度地減少其對腦組織的破壞作用，從而起到減輕缺血腦組織再灌注損傷的作用，達到防治缺血性腦中風(fēng)的目的。

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Effects of Xifeng Tongnao Capsules on Expression of TNF-α and IL-1β in Brain Tissue of Rats with Focal Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury

ZENG Congyan, HU Ying, GAO Yuqiao, MEI Quanxi, LIN Hui, DAI Weibo, ZHANG Wenxia

(DepartmentofPharmacy,ZhongshanHospitalofTraditionalChineseMedicine,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Zhongshan528400,China)

Objective To observe the effects ofXifengTongnaocapsules on the content of TNF-α and IL-1β in brain tissue of rats with focal cerebral ischemia-reperfusion injury. Methods A total of 120 adult SD rats were randomized into 6 groups:XifengTongnaolow-, middle- and high-dose groups, model control group,BuchangNaoxintonggroup and sham-operated group.BuchangNaoxintonggroup were treated withBuchangNaoxintongcapsules at 0.864 g·kg-1.XifengTongnaohigh-, middle- and low-dose groups were treated with 3.456, 1.720, and 0.864 g·kg-1XifengTongnaocapsules, respectively；sham-operated group and model control group were treated with equal volume of purified water.Medications were administered intragastrically once daily for 7 days.The acute transient focal cerebral ischemia-reperfusion model was established by middle cerebral artery occlusion (MCAO) 1 h after the final dose, and rats in the sham-operated group only received anesthesia and stripping without occlusion.All rats were sacrificed after reperfusion for 24 h, and expression levels of TNF-α and IL-1β in the brain tissue were detected by ELISA. Results TNF-α content inxifengTongnao capsutes low-, middle- and high-dose groups were (35.34±8.95), (33.75±6.92), and (40.95±5.39) ng·L-1, respectively.IL-1β content were (1.44±0.47), (1.45±0.23), and (1.61±0.33) ng·L-1in low-, middle- and high-dose groups, respectively.TNF-α and IL-1β were (38.96±9.84) and (1.56±0.31) ng·L-1, respectively inBuchangNaoxintonggroup, (52.74±6.76) and (2.79±0.45) ng·L-1in the model control group, and (32.54±4.00) and (1.32±0.22) ng·L-1in sham-operated group.TNF-α and IL-1β content were significantly higher inBuchangNaoxintonggroup than in sham-operated group (P<0.05).TNF-α and IL-1β content were significantly decreased inXifengTongnaohigh-, middle- and low-dose groups (allP<0.05). ConclusionXifengTongnaocapsules can protect brain tissue by supressing TNF-α and IL-1β and alleviating inflammatory injury from ischemia.

XifengTongnaocapsules；Injury, cerebral ischemia-reperfusion；Tumor necrosis factor；Interleukin

2014-08-14

2014-11-22

*廣東省中山市科技計劃資助項目(20122A010)

曾聰彥(1975-)，男，廣東和平人，教授，主任中藥師，碩士生導(dǎo)師，學(xué)士，主要從事醫(yī)院中藥新制劑開發(fā)研究。 電話：0760-89980213，E-mail：zszcy@126.com。

R965；R743

A

1004-0781(2015)10-1272-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.10.002