熄風通腦膠囊對局灶性腦缺血-再灌注損傷大鼠腦組織TNF-α和IL-1β的影響*

曾聰彥，胡瑩，高玉橋，梅全喜，林慧，戴衛波，張文霞

(廣州中醫藥大學附屬中山中醫院藥學部，中山 528400)

·藥物研究·

熄風通腦膠囊對局灶性腦缺血-再灌注損傷大鼠腦組織TNF-α和IL-1β的影響*

曾聰彥，胡瑩，高玉橋，梅全喜，林慧，戴衛波，張文霞

(廣州中醫藥大學附屬中山中醫院藥學部，中山 528400)

目的 探討熄風通腦膠囊對局灶性腦缺血-再灌注損傷大鼠腦組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-1β(IL-1β)含量的影響。方法 健康斯潑累格·多雷(SD)大鼠120 只，隨機分為6組，假手術組、模型對照組，生長腦心通組，熄風通腦膠囊大劑量組，中劑量組和小劑量組。各組大鼠造模前進行預防性給藥，生長腦心通組給予步長腦心通0.864 g·kg-1，大劑量組、中劑量組和小劑量組藥物組分別給予熄風通腦膠囊內容物3.456，1.720，0.864 g·kg-1，假手術組、模型對照組給予等體積純化水，連續灌胃給藥7 d，每天1次。末次給藥后1 h，采用改良線栓法(MACO)制備大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷模型，假手術組只麻醉剝離不插入線栓；24 h后取腦，用酶聯免疫法檢測大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β的含量。結果 熄風通腦膠囊大劑量組、中劑量組和小劑量組組TNF-α分別為(35.34±8.95)，(33.75±6.92)，(40.95±5.39)ng·L-1，IL-1β分別為(1.44±0.47)，(1.45±0.23)，(1.61±0.33) ng·L-1，生長腦心通組TNF-α、IL-1β分別為(38.96±9.84)和(1.56±0.31) ng·L-1，模型對照組分別為(52.74±6.76)和(2.79±0.45) ng·L-1，假手術組分別為(32.54±4.00)和(1.32±0.22) ng·L-1。模型對照組大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量均明顯高于假手術組(P<0.05)。熄風通腦膠囊大劑量組、中劑量組和小劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量降低(均P<0.05)。結論 熄風通腦膠囊可通過抑制腦組織TNF-α、IL-1β的升高，減輕缺血時炎性損傷，對腦缺血大鼠腦組織產生一定程度的保護作用。

熄風通腦膠囊；損傷，腦缺血-再灌注；腫瘤壞死因子；白細胞介素

腦血管疾病發病率、致殘率、病死率均高，是當今世界人類死亡的三大主要疾病之一。其中，缺血性腦卒中發病率最高，且呈上升趨勢，約占腦血管疾病 70%，嚴重威脅人類的健康[1]。隨著近年來對缺血性腦損傷研究的不斷深入，有關炎癥因子對早期缺血性腦組織損傷的作用也成為研究熱點，其中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)等屬于促炎癥細胞因子，在顱腦損傷后表達明顯增加，起著重要作用[2]。 熄風通腦膠囊是廣州中醫藥大學附屬中山中醫院根據中醫理論及多年臨床實踐而研制的治療急性期缺血性腦中風的方藥。為進一步闡明其作用機制，筆者在本實驗中通過建立大鼠急性腦缺血-再灌注模型，觀察該制劑對大鼠腦組織TNF-α、IL-1β等炎癥因子表達水平的影響，以探討其治療急性期缺血性腦中風的作用機制，為熄風通腦膠囊的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級雄性斯潑累格·多雷(Sprague Dawley，SD)大鼠，體質量280～350 g，購于廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(粵)2013-0020。所有動物均飼養于中山市中醫院中藥藥理實驗室內，實驗動物使用許可證號：SYXK(粵)2010-0109，飼養期間大鼠自由飲水、攝食，室內溫度20～24 ℃，相對濕度40%～60%。

1.2 試劑與儀器 熄風通腦膠囊(中山市中醫院制劑室，批準文號：粵藥制字Z20110102，批號：20130911)；步長腦心通膠囊(咸陽步長制藥有限公司，批號：130149)；TNF-α試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20131203)；IL-1β試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20131203)；釣魚尼龍線，直徑0.26 mm，日本生產；Muitiskan MLB3酶標儀[熱電(上海)儀器有限公司]；GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)。

1.3 動物分組、給藥途徑及藥量 選取健康SPF級雄性SD大鼠120只，正常飼養7 d后，按體質量隨機分為假手術組、模型對照組、生長腦心通組、熄風通腦膠囊大劑量組、中劑量組和小劑量組。各組大鼠造模前進行預防性給藥，生長腦心通組給予步長腦心通0.864 g·kg-1，大劑量、中劑量和小劑量藥物組分別給予熄風通腦膠囊內容物3.456，1.720，0.864 g·kg-1，假手術組、模型對照組給予等體積純化水，連續灌胃給藥7 d，每天1次。末次給藥后1 h，除假手術組外，其余各組大鼠均采用改良線栓法制備大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷模型，假手術組只麻醉剝離不插入線栓。

1.4 動物模型制備 末次灌胃1 h后對大鼠手術造模，術前12 h禁食，不禁水。參照ZEA-LONGA等[3]的大腦中動脈線栓法，并加以改良。用魚線制備線栓，頭端燒圓口，并在線栓1.8～2.5 cm處做好標記。以10%水合氯醛(350 mg·kg-1)腹腔麻醉大鼠后，仰臥位固定，頸部備皮，消毒皮膚，在頸部正中切口，分離皮下筋膜及肌肉組織，充分暴露右側頸總動脈及頸內動脈、外動脈，結扎頸總動脈、頸外動脈，于頸總動脈分叉切口處向頸內動脈插入線栓至之前標記處，感覺有阻力即達到大腦中動脈起始部，完全阻斷其血流，結扎頸內動脈。術后縫合傷口，用0.9%氯化鈉溶液浸泡紗布覆蓋傷口，并于2 h后拔出魚線。手術期間及術后24 h應保持大鼠肛溫維持在37 ℃。假手術組僅分離右側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，而后縫合傷口[4-5]。

1.4.1 模型成功率檢測方法 由于該手術造模對大鼠的傷害比較大，所以該造模存在一定的死亡率，根據神經功能缺損評分判定造模是否成功。

1.4.2 神經功能缺損評分 參照ZEA-LONGA等[3]的局灶性腦缺血模型神經功能缺陷評分標準進行評分。0分：無神經功能缺損癥狀，活動正常者；1分：不能完全伸展左側前肢者；2分：左側肢體癱瘓，行走使向左側旋轉，出現追尾現象者；3分：行走時向左側傾倒，或不能站立者；4分：無自發活動者。

1.5 制備腦組織勻漿 造模后24 h將大鼠麻醉，處死后取手術側大腦及腦前極到視交叉部位的腦組織，稱定質量，冰浴條件下用0.9%氯化鈉溶液制備10%腦勻漿。勻漿液經2 850×g離心10 min，取上清液，分裝，用于TNF-α、IL-1β含量的測定。

1.6 檢測方法 酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immuno-sorbent assay，ELISA)法檢測TNF-α、IL-1β含量。具體操作嚴格按照TNF-α、IL-1β試劑盒步驟進行，最后用酶標儀測定結果。

2 結果

2.1 大鼠神經功能缺損評分 假手術組大鼠沒有神經功能缺損表現，評分均為0分。模型對照組、生長腦心通組和熄風通腦膠囊小劑量組、中劑量組、大劑量組均出現不同程度的神經功能缺損癥狀，在缺血再灌注24 h后，生長腦心通組、小劑量、中劑量、大劑量藥物組神經功能缺損評分均小于模型對照組，其中生長腦心通組、熄風通腦膠囊大劑量組與模型對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)；熄風通腦膠囊小劑量組、中劑量組雖然也有一定改變，但效果不明顯，差異無統計學意義(均P>0.05)。本實驗選取120只大鼠，其中假手術組10只，實際參與造模大鼠為110只，模型成功大鼠50只，造模成功率為45.5%。結果見表1。

表1 6組大鼠神經功能缺損評分

與模型對照組比較，F=2.639， *1P<0.05Compared with model control group，F=2.639， *1P<0.05

2.2 大鼠腦組織中TNF-α含量 結果表明，大鼠腦缺血再灌注24 h后，與假手術組比較，各組大鼠腦組織勻漿中TNF-α表達比較均有不同程度的升高，模型對照組增高較為明顯(P<0.05)。與模型對照組比較，生長腦心通組及熄風通腦膠囊小劑量組、中劑量組、大劑量組均差異有統計學意義(均P<0.05)，結果見表2。

2.2 大鼠腦組織中IL-1β含量 結果表明，大鼠腦缺血再灌注24 h后，各組大鼠腦組織勻漿中IL-1β表達比較均有不同程度的升高，且模型對照組增高較為明顯(P<0.05)，與模型對照組比較，生長腦心通組及熄風通腦膠囊小劑量組、中劑量組、大劑量組均差異有統計學意義(均P<0.05)，結果見表2。

3 討論

腦缺血-再灌注損傷主要與炎癥反應、興奮性氨基酸、細胞內鈣超載、氧自由基和細胞凋亡等幾個方面因素有關[6]。研究表明[7]，顱腦創傷后可產生顱內炎癥反應，炎癥反應在參與腦缺血再灌注損傷的諸多影響因素中是最重要的一環。盡管中樞神經系統有血-腦屏障，但是損傷后它有類似外周器官的免疫激活，釋放大量免疫調節物質，炎癥反應導致創傷后粘附分子表達、細胞滲透、炎性分子和生長因子分泌，導致細胞再生或死亡[8]。炎性細胞因子在腦組織超表達致使神經元賴以存在的環境發生變化，使神經元變性[9]。在

表2 6組大鼠腦組織中TNF-α和IL-1β含量的測定值

Tab.2 Content determination of TNF-α and IL-1β in brain of six groups of rats

與假手術組比較，TNF-α F=8.371，IL-1β F=23.883，*1P<0.05；與模型對照組比較，TNF-αF=7.489，IL-1β F= 22.70 *2P<0.05Compared with sham operation group,TNF-α F=8.371，IL-1β F=23.883，*1P<0.05；Compared with model control group，TNF-αF=7.489，IL-1β F= 22.70 *2P<0.05

這個過程中TNF-α與IL-1β是主要的促炎因子，它能激活并促進其他因素的發展，并和其他因素相互影響，造成缺血-再灌注損傷的加重[2]。TNF-α被認為全身炎性反應的始動遞質[10]，是腦損傷后最早出現的細胞因子，可直接導致循環阻力降低，血管通透性增加，血管內皮細胞功能減退。TNF-α在外傷、炎癥時分泌增加，同時可誘導超大量的細胞因子釋放，如IL-1、IL-6、IL-8等，構成炎癥損傷的放大效應[11]。TNF-α適當增加對機體起防御作用，但過度表達則有神經毒性作用，它能增強血-腦屏障的通透性，引起白細胞浸潤和炎癥因子聚集，誘導細胞間黏附分子表達，而引發一系列的炎癥反應[12]，導致神經細胞腫脹和壞死。研究表明[13]，TNF-α在腦損傷早期即可產生，且其含量升高越明顯神經功能缺失越嚴重。ARVIN等[14]研究發現腦創傷后可大量合成和釋放TNF-α，同時其可誘導其他細胞因子IL-1β及炎癥遞質的產生。IL-1β是血漿和組織液中的主要分泌形式，也是腦組織中主要形式[15]。IL-1β促炎作用的重要環節是激活腦內的小膠質細胞，激活的小膠質細胞可通過釋放細胞因子、自由基等參與腦內的炎癥反應；IL-1β還可以通過刺激內皮細胞表達白細胞粘附分子，使白細胞聚集在損傷的腦組織周圍，加重腦損傷[16]。IL-1β作為早期產生的促炎細胞因子參與腦水腫的形成，血-腦屏障的破壞，以及誘導其他炎癥遞質的大量表達。也就是說，在顱腦損傷早期，TNF-α，IL-1β之間存在著一個可放大且延續炎癥反應的正反饋環，造成TNF-α，IL-1β的超量生成。故在顱腦損傷早期，抑制炎癥因子的表達可減輕由細胞因子造成的繼發性顱腦損害[17]。

熄風通腦膠囊由三七、大黃、赤芍、石決明、珍珠母、蒲黃、鉤藤、牡丹皮、膽南星等10多味中藥組方而研制成。方中石決明、珍珠母平肝熄風，潛陽降逆，為主藥；鉤藤、牡丹皮、赤芍以鎮肝熄風，涼血化瘀，膽南星以清化痰濕，通經活絡，大黃通腑泄熱，解毒祛邪，共為輔藥，佐以蒲黃、三七活血化瘀通絡；諸藥合用，共湊熄風通腦、祛痰解毒、活血化瘀之功，故凡急性期缺血性腦中風皆可運用。經多年的臨床證實，發現本方對急性期缺血性腦中風具有療效確切、副作用小等特點。本實驗在制備局灶性腦缺血-再灌注損傷模型基礎上，針對腦缺血-再灌注損傷炎癥反應關鍵環節TNF-α和IL-1β的含量進行研究，結果顯示，模型對照組腦組織中TNF-α和IL-1β水平明顯高于假手術組，說明腦缺血-再灌注誘導細胞因子TNF-α和IL-1β的表達，而熄風通腦膠囊能明顯降低腦組織中TNF-α和IL-1β的水平，提示熄風通腦膠囊能抑制腦缺血-再灌注后TNF-α和IL-1β的表達，具有抑制炎癥反應，并最大程度地減少其對腦組織的破壞作用，從而起到減輕缺血腦組織再灌注損傷的作用，達到防治缺血性腦中風的目的。

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Effects of Xifeng Tongnao Capsules on Expression of TNF-α and IL-1β in Brain Tissue of Rats with Focal Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury

ZENG Congyan, HU Ying, GAO Yuqiao, MEI Quanxi, LIN Hui, DAI Weibo, ZHANG Wenxia

(DepartmentofPharmacy,ZhongshanHospitalofTraditionalChineseMedicine,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Zhongshan528400,China)

Objective To observe the effects ofXifengTongnaocapsules on the content of TNF-α and IL-1β in brain tissue of rats with focal cerebral ischemia-reperfusion injury. Methods A total of 120 adult SD rats were randomized into 6 groups:XifengTongnaolow-, middle- and high-dose groups, model control group,BuchangNaoxintonggroup and sham-operated group.BuchangNaoxintonggroup were treated withBuchangNaoxintongcapsules at 0.864 g·kg-1.XifengTongnaohigh-, middle- and low-dose groups were treated with 3.456, 1.720, and 0.864 g·kg-1XifengTongnaocapsules, respectively；sham-operated group and model control group were treated with equal volume of purified water.Medications were administered intragastrically once daily for 7 days.The acute transient focal cerebral ischemia-reperfusion model was established by middle cerebral artery occlusion (MCAO) 1 h after the final dose, and rats in the sham-operated group only received anesthesia and stripping without occlusion.All rats were sacrificed after reperfusion for 24 h, and expression levels of TNF-α and IL-1β in the brain tissue were detected by ELISA. Results TNF-α content inxifengTongnao capsutes low-, middle- and high-dose groups were (35.34±8.95), (33.75±6.92), and (40.95±5.39) ng·L-1, respectively.IL-1β content were (1.44±0.47), (1.45±0.23), and (1.61±0.33) ng·L-1in low-, middle- and high-dose groups, respectively.TNF-α and IL-1β were (38.96±9.84) and (1.56±0.31) ng·L-1, respectively inBuchangNaoxintonggroup, (52.74±6.76) and (2.79±0.45) ng·L-1in the model control group, and (32.54±4.00) and (1.32±0.22) ng·L-1in sham-operated group.TNF-α and IL-1β content were significantly higher inBuchangNaoxintonggroup than in sham-operated group (P<0.05).TNF-α and IL-1β content were significantly decreased inXifengTongnaohigh-, middle- and low-dose groups (allP<0.05). ConclusionXifengTongnaocapsules can protect brain tissue by supressing TNF-α and IL-1β and alleviating inflammatory injury from ischemia.

XifengTongnaocapsules；Injury, cerebral ischemia-reperfusion；Tumor necrosis factor；Interleukin

2014-08-14

2014-11-22

*廣東省中山市科技計劃資助項目(20122A010)

曾聰彥(1975-)，男，廣東和平人，教授，主任中藥師，碩士生導師，學士，主要從事醫院中藥新制劑開發研究。 電話：0760-89980213，E-mail：zszcy@126.com。

R965；R743

A

1004-0781(2015)10-1272-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.10.002