莧菜活性物提取工藝及抑菌活性研究

夏日照 謝 燕 尹 維 張 亞 廖曉蘭

（湖南農業大學植物保護學院，植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室，湖南長沙 410128）

莧菜活性物提取工藝及抑菌活性研究

夏日照 謝 燕 尹 維 張 亞 廖曉蘭*

（湖南農業大學植物保護學院，植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室，湖南長沙 410128）

以對柑橘潰瘍病菌抑制率為考察指標，采用乙酸乙酯浸提莧菜葉干粉，獲得莧菜活性物，通過正交試驗分別考察料液比、提取次數、提取時間對莧菜活性物提取效果的影響。結果表明：不同因素對莧菜活性物提取效果的影響程度不同，依次為料液比＞提取溫度＞提取時間；正交試驗優化得到莧菜活性物最佳提取工藝參數為：料液比1∶5、提取溫度30 ℃、提取時間24 h，在此條件下莧菜活性物的抑制率為73.81%。紫外線、C源（蔗糖）和無機鹽離子（NaCl）的脅迫作用均對莧菜活性物抑菌活性影響不大；莧菜活性物有一定的耐熱性，溫度為80 ℃時抑制率仍可達49.41%。

莧菜活性物；正交試驗；提取工藝；抑菌活性

莧為莧科莧屬（Amaranthus L.）作物總稱，生長快、耐瘠、耐旱，種植地區分布全球，我國大部分地區都有栽培，按其栽培目的不同可分為粒用莧、菜用莧、飼用莧、觀賞莧等，Teutonico與 Knorr等學者把莧鑒定為主要是菜用型，認為所有莧屬物種的葉子均能食用，因此習慣上把莧統稱為莧菜（肖深根 等，2000）。目前莧菜（Amaranthus tricolor）的開發利用涉及食用（Silva-Sanchez et al.，2008）、工業（王寧 等，2009）、觀賞（汪勁武，1996）、飼用（武之新和徐玉鵬，1997）以及醫用（Mendonca et al.，2009；Zeashan et al.，2009） 等方面，有關莧菜在農業植物病害防治方面的研究鮮見報道，僅有Lyapkova等（2001）研究發現莧菜種子含有抗真菌多肽，可抑制部分植物病原真菌；Abd Aziz等（2011）研究發現莧菜葉片中提取的蛋白質對黃瓜花葉病毒（CMV）具有顯著的抑制作用。筆者在研究過程中發現莧菜活性物對柑橘潰瘍病菌（X. axonopodis pv. citri）、水稻細菌性條斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola）、西瓜細菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp. citrulli）、煙草青枯病菌（Ralstonia solanacearum）以及歐式桿菌（Erwinia carotovora）等常見植物病原細菌有極好的室內平板抑制效果，其中對柑橘潰瘍病菌的離體試驗結果表明莧菜活性物在防治植物細菌性病害方面有巨大的潛力（尹維，2014）。

本研究在前期試驗的基礎上，為獲得大量穩定的莧菜活性物，采用正交試驗對莧菜活性物提取工藝進行優化和完善，并對其穩定性進行了初步探究，以期為莧菜活性物進一步開發為新型生防制劑提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2014年7～9月在植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室進行。供試莧菜由湖南農業大學瀏陽科研基地提供，選取株高為18～23 cm的圓葉紅莧菜，取葉片洗凈、曬干，高速粉碎機粉碎，過60目篩，陰涼處保存備用。試驗指示菌為柑橘潰瘍病菌，由湖南農業大學植物病理學實驗室提供，鉑尚生物技術（上海）有限公司測序比對（表1）。

表1 柑橘潰瘍病菌測序結果

供試培養基為蔗糖蛋白胨培養基：蔗糖20.0 g、蛋白胨5.0 g、磷酸氫二鉀0.5 g、結晶硫酸鎂0.25 g、瓊脂24.0 g、蒸餾水1 000 mL、pH值7.0～7.2。

1.2 菌懸液制備及抑菌活性測定

柑橘潰瘍病菌菌懸液制備：挑取活化培養24 h的標準菌落，加入無菌水，比對麥式比濁管，調整菌懸液濃度為3×108cfu·mL-1。

抑菌活性測定：采用抑菌圈法（孫長霞 等，2012），在蔗糖蛋白胨培養基表面接種200 μL菌懸液并涂布均勻，取已滅菌的打孔器（Φ=7 mm）在培養皿中心打取小孔，分別注入莧菜活性物150 μL，設相應空白對照，重復2次；26～28 ℃培養24 h，觀察抑菌圈的大小，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.3 莧菜活性物制備

稱取40.0 g莧菜葉干粉，按料液比1∶20加入乙酸乙酯（分析純，下同），常溫振蕩提取24 h，收集上清液；40 ℃旋蒸至膏狀物，80 mL無水乙醇（分析純，下同）溶解定容，冷藏備用。

1.4 莧菜活性物提取純化工藝優化

在單因素試驗基礎上，選取提取溫度（A）、料液比（B）、提取時間（C）3個因素對莧菜活性物提取工藝進一步優化，采用L9（34）正交表進行試驗（表2），以確定最佳提取條件。

稱取莧菜葉干粉20.0 g，放入1 000 mL錐形瓶中，按設計的料液比（加入乙酸乙酯）、溫度和時間進行提取。

將上述處理液在搖床上常溫振蕩提取24 h，重復1次，收集上清液；40 ℃減壓旋蒸至膏狀物，40 mL無水乙醇溶解定容，抑菌活性測定方法同1.2。

1.5 莧菜活性物的穩定性

1.5.1 溫度處理 取冷藏的莧菜活性物6份，分別在50、60、70、80、90、100 ℃條件下水浴處理20 min，以未處理莧菜活性物為對照，抑菌活性測定方法同1.2。

1.5.2 紫外線照射處理 取冷藏的莧菜活性物6份，分別用紫外燈照射處理5、15、30、60、120 min，以未處理莧菜活性物為對照，抑菌活性測定方法同1.2。

1.5.3 C源和無機鹽離子脅迫作用 取冷藏的莧菜活性物10份，分別按體積比2∶1與濃度為10%、20%、30%、40%、50%的蔗糖溶液和濃度為5%、10%、15%、20%、25%的NaCl溶液混合，配制成含不同濃度糖和NaCl的混合液，以未處理莧菜活性物為對照，抑菌活性測定方法同1.2。

1.6 數據處理

活性物濃度（g·mL-1）=膏狀物質量/定容有機溶劑

采用DPS、Excel軟件進行數據處理，運用Duncan’s新復極差法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 莧菜活性物提取工藝優化

由表2極差分析可知，RB＞RA＞RC，即各因素對莧菜活性物提取效果的影響程度依次為料液比＞提取溫度＞提取時間。在本試驗設計范圍內，莧菜活性物的最佳提取條件為B1A1C3，即當料液比為1∶5、提取溫度為30 ℃、提取時間為24 h時莧菜活性物抑菌效果最佳。按B1A1C3條件進行3次平行試驗，抑菌圈直徑達到46.53 mm，抑制率為73.81%，高于表3中任意一組試驗結果，故B1A1C3為莧菜活性物最優提取條件。

表2 莧菜活性物提取工藝優化的L9（34）正交試驗結果

2.2 溫度對莧菜活性物抑菌活性的影響

如圖1所示，當溫度為50～80 ℃時，莧菜活性物抑菌活性基本沒有變化，抑制率維持在50%左右；當溫度超過80 ℃時，抑菌活性明顯開始下降；當溫度達到100 ℃時，基本喪失了抑菌活性，抑制率僅為19.12%。這表明莧菜活性物在一定溫度范圍內具有較好的熱穩定性，但過高的溫度會破壞活性物結構，從而使其失活，降低抑菌活性。

圖1 不同溫度對莧菜活性物抑菌活性的影響

2.3 紫外線對莧菜活性物抑菌活性的影響

如圖2所示，紫外燈照射處理時間對莧菜活性物抑菌活性影響不大，抑制率基本維持在55%左右。由此可見，莧菜活性物分子結構穩定，活性基團不易被破壞，對紫外光具有極高的穩定性。

圖2 不同紫外線照射時間對莧菜活性物抑菌活性的影響

2.4 C源和無機鹽離子對莧菜活性物抑菌活性的影響

如圖3、4所示，隨著蔗糖和NaCl濃度的增加，莧菜活性物的抑制率變化不明顯，維持在48%左右。表明莧菜活性物本身具有較好的抑菌作用，無機鹽離子（NaCl）、C源（蔗糖）對莧菜活性物的脅迫作用不明顯。

圖3 不同蔗糖濃度對莧菜活性物抑菌活性的影響

圖4 不同NaCl濃度對莧菜活性物抑菌活性的影響

3 結論與討論

L9（34）正交試驗結果表明，莧菜活性物最佳提取工藝為料液比1∶5、提取溫度30 ℃、提取時間24 h，對柑橘潰瘍病菌的抑制率為73.81%。但是在試驗過程中發現，隨著提取莧菜干粉質量的增加，該工藝組合往往不能達到預期的提取效果。這可能是因為1∶5的料液比太小，無法充分溶解莧菜干粉和振蕩，在造成試驗材料消耗的同時，影響了結果的精確性、穩定性，不利于莧菜活性物的大量提取。當料液比1∶20、溫度30 ℃、提取時間24 h（B3A1C3）時，與理論最優條件B1A1C3的抑制率差別不大（B3A1C3為71.13%，B1A1C3為73.81%），而且二者所用乙酸乙酯的回收率也都達到了90%以上。這解決了試驗過程中因溶劑較少而降低提取效率的問題，同時也邁出了莧菜活性物由試驗提取走向生產應用的關鍵一步，為莧菜活性物的工業化大規模提取，實現活性成分的分離合成提供了技術可能。

植物源活性成分種類繁多，穩定性不一，其活性會因光照、紫外線、溫度以及金屬鹽離子等因素而受到破壞（吳傳萬 等，2004）。莧菜是一種功能性蔬菜，富含紅色素、花色苷色素、酚類、蛋白質、黃酮類、角烯鯊等活性成分。紅色素主要以溶劑浸提和超聲波萃取為主（呂玉珍 等，2010；陳曉光 等，2012；曾慶祝 等，2012；張瑞 等，2013）；植物甾醇和三萜類皂苷合成先導物角鯊烯的提取方法也有研究（岳才軍 等，2010）；至于黃酮類、蛋白質等常見植物源活性成分更是有完整的提取工藝（李啟照，2013；林燕茹和張曉芝，2013）。本試驗提取的莧菜活性物穩定性好，在紫外線、C源和無機鹽離子的脅迫下抑菌活性基本保持不變；耐熱性好，80 ℃時對柑橘潰瘍病菌的抑制率仍有49.41%。這說明莧菜中可能含有與目前已發現提取的活性物不同的活性成分，且性質穩定，能滿足田間復雜環境的要求，有利于推動莧菜活性物從實驗室向大田應用的轉變。因此，純化和了解其活性成分，不僅對了解莧菜活性物的抑菌機制有重要意義，而且對莧菜活性物的開發利用等都有重要的理論參考和實用價值。

莧科植物種類繁多，總計60屬約850種，多以草本或灌木為主，其中莧屬是莧科植物重要的一科，該屬有反枝莧（Amaranthus retroflexus）、籽粒莧（Amaranthus hypochondriacus L.）、刺莧（Amaranthus spinosus）、 尾 穗 莧（Amaranthus caudatus L. ）、綠穗莧（Amaranthus hybridus L. ）等40余種。隨著科技進步，莧科植物在農用和藥用方面的價值逐漸受到人們關注。Lina和Manuel（2007）從籽粒莧中分離出一種抗真菌肽，對白色念珠菌（Candida albicans）、褐黃曲霉（Aspergillus ochraceus）等真菌表現出極佳的抑制作用；綠穗莧和尾穗莧對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等細菌也表現出顯著的抑菌活性（Maiyo et al.，2010）；作為重要外來入侵生物的反枝莧也在植物化感作用和改善植物根際土壤方面表現出促進作用（Zhang & Mu，2008；龔振平 等，2010）。上述報道均表明了莧菜中是含有抑菌活性物的，且可以利用一定提取方法進行有效提取。這與本試驗結果是一致的，為進一步挖掘莧菜及其他莧科植物作為植物源農藥新材料和探究莧菜活性物具體結構提供了科學依據。

參考文獻

陳曉光，朱斌，何展榮，曾琪．2012．用新鮮紅莧菜提取天然莧菜紅色素的工藝研究．中國調味品，37（6）：111-114．

龔振平，馬春梅，金喜軍，姚玉波．2010．種植大豆對土壤氮素盈虧影響的估算．核農學報，24（1）：125-129．

李啟照．2013．莧菜中總黃酮的提取工藝研究．天然產物研究與開發，（B12）：110-113．

呂玉珍，董大朋，韋林洪．2010．紅莧菜中花色苷色素的提取工藝研究．北方園藝，（22）：42-44．

孫長霞，童應，黃亮．2012．蒲公英不同溶劑提取物體外抑菌效果的研究．食品科學，37（1）：204-205．

王寧，薛源，孫體健．2009．莧菜紅色素對羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除作用．山西醫科大學學報，40（5）：458-460．

汪勁武．1996．莧科植物內容多．植物雜志，（1）：32-34．

吳傳萬，杜小鳳，徐建明，王偉中．2004．植物源抑菌活性成分研究新進展．西北農業學報，13（3）：81-88．

武之新，徐玉鵬．1997．莧菜屬作物在滄州區域的生態適應性．生態學雜志，（1）：63-64．

肖深根，劉志敏，宋勇．2000．莧菜品種資源的分類研究．湖南農業大學學報，26（4）：274-277．

尹維．2014．莧菜活性物對柑橘潰瘍病菌抑制機理研究〔碩士論文〕．長沙：湖南農業大學．

“什么是今天該有的男性氣質”,《人民日報》評論員如是發問。是傳統意義上的“金戈鐵馬”的豪情壯志,亦或是大行其道的“桃面柔膝”？而依我之見，正氣凜然，剛健勇毅的精神風貌，方才是今日中國男兒所應該追求的。

岳才軍，何彥平，阮洪生，孟婧．2010．莧菜培養細胞中角鯊烯的提取與含量測定．安徽農業科學，38（10）：5104-5105．

曾慶祝，陳陸欣，方細娟，許慶陵．2012．莧菜紅色素提取工藝及穩定性研究．廣州大學學報：自然科學版，11（4）：25-30．

張瑞，邢軍，毛居代·亞爾買買提，朱思屹，古力依帕爾·于蘇普，布阿提開木·麥麥提沙吾提．2013．紅莧菜天然紅色素的提取及其穩定性．食品與發酵工業，39（1）：208-214．

Abd Aziz S M，Low C N，Chai L C，Abd Razak S S N．2011．Screening of selected Malaysian plants against several food borne pathogen-bacteria．International Food Research Journal，18（3）：1195-1201．

Lina R A，Manuel S G．2007．Antifungal activity of a protean extract from Amaranthus hypochondriacus seeds．Mexico Journal of Chemistry Society，51（3）：136-140．

Lyapkova N S，Loskutova N A，Maisuryan A N，Mazin N P，Korableva T A，Platonoova E P，Ladyzhenskaya A S．2001．Transformed potato plants carrying the gene of the antifungal peptide of Amaranthus caudatus．Applied Biochemistry and Microbiology，37：301-305．Maiyo Z C，Ngure R M，Matasyoh J C，Chepkorir R．2010．Phytochemical constituents and antimicrobial activity of leaf extracts of three Amaranthus plant species．African Journal of Biotechnology，9（21）：3178-3182．

Mendonca S，Saldiva P H，Cruz R J，Areas J G．2009．Amaranth protein presents cholesterol-lowering effect．Food Chem，116（3）：738-742．

Silva-Sanchez C，de la Rora A P B，Leon-Galvan M F．2008．Bioactive peptides in amaranth（Amaranthus hypochondriacus）seed．J Agric Food Chem，56（4）：1233-1240．

Zeashan H，Amresh G，Singh S．2009．Hepatoprotective and antioxidant activity of Amaranthus spinosus against CCl4induced toxicity．J Ethnopharmacol，125（2）：364-366．

Zhang Y，Mu X Q．2008．Allelopathic effects of Amaranthus retroflexus L. and its risk assessment．Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，28（4）：771-776．

Extraction and Antibacterial Activity of Actives Sub

XIA Ri-zhao，XIE Yan，YIN Wei，ZHANG Ya，LIAO Xiao-lan*
（Hunan Key Lab. Biol & Ctrl of Plant Dis & Pests，College of Plant Protection，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China）

Took inhibition ratio of citrus cankor pathogen as investigation target，lixivite dry powder of Amaranthus leaf blades with ethyl acetate and gained Amaranthus tricolor actives．Examined the effect of solidliquid ratio，extraction temperature，and extraction time of Amaranthus tricolor actives by orthogonal experiment．The results indicated that different factors had different degree effects on extraction efficiency．Three extraction parameters were ranked in descending order of their effect on extraction of Amaranthus tricolor actives as follows solid-liquid ratio＞extraction temperature＞extraction time．Their optimal levels were 1∶5，30 ℃，24 h，respectively．Under these conditions，the inhibition rate was 73.81%．Ultraviolet radiation，C source（sucrose）and inorganic ion（NaCl） stress had little effects on Amaranthus tricolor actives stability．It posses certain heat tolerance，its inhibition rate was still up to 49.41%，when the temperature was 80 ℃．

Amaranthus tricolor active；Extraction technology；Antibacterial activity

夏日照，男，碩士研究生，專業方向：植物病害生物防治，E-mail：908302479@qq.com

*通訊作者（Corresponding author）：廖曉蘭，女，教授，博士生導師，專業方向：生防資源的挖掘與利用，E-mail：liaoxl88@126.com

2015-01-07；接受日期：2015-04-05