丙烯酰胺對睪丸間質細胞R2C活性及孕酮合成功能的影響

李名薇，孫建霞，許 偉，鄒飛雁,*，白 順，朱翠娟，胡云峰，焦 睿，吳 實，歐仕益，馮夢鴿，白衛濱,*

丙烯酰胺對睪丸間質細胞R2C活性及孕酮合成功能的影響

李名薇1，孫建霞2，許 偉1，鄒飛雁1,*，白 順1，朱翠娟1，胡云峰1，焦 睿1，吳 實1，歐仕益1，馮夢鴿1，白衛濱1,*

（1.暨南大學理工學院食品科學與工程系，生命科學技術學院，第一附屬醫院，廣東 廣州510632；2.廣東工業大學輕工化工學院，廣東 廣州510006）

目的：研究丙烯酰胺（acrylamide，AA）對體外培養的睪丸間質細胞R2C生長及孕酮合成功能的影響。方法：用濃度為0.25、0.5、0.75、1、2、4、6 mmol/L的AA作用于R2C細胞24 h，四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法獲得IC25、IC50及IC75的AA作用濃度。用以上3種濃度的AA處理R2C細胞24 h，觀察細胞形態。AA作用于R2C細胞4 h后，通過彗星實驗（Comet assay）檢測細胞DNA的損傷程度；放射免疫法（radioimmunoassay，RIA）測定AA處理R2C細胞4 h和24 h后的孕酮合成量。結果：AA能抑制R2C細胞活性，其IC25、IC50、IC75分別為1.140、1.925、3.250 mmol/L；3種濃度的AA能不同程度地影響R2C細胞生長形態；作用4 h對R2C細胞DNA有損傷作用；各濃度組作用24 h后均能降低R2C細胞的孕酮合成量。結論：AA能影響R2C細胞增殖及孕酮合成能力。

丙烯酰胺；R2C細胞；細胞活性；DNA損傷；孕酮

丙烯酰胺（acrylamide，AA）是一種廣泛存在于常見食品及工業生產中的化學物質[1-3]，它被認為是一種對人類有潛在致癌作用的物質[4]。2002年4月，瑞典國家食品管理局宣布在富含碳水化合物，如薯片、咖啡、烤面包等的熱處理過程中會產生大量的丙烯酰胺[5-6]，這一發現引起了廣泛關注。據報道，丙烯酰胺具有基因毒性、神經毒性及生殖毒性等，對人類具有致癌的危害性[7-8]。Yang等[9]通過大鼠實驗發現，較低劑量的AA即可抑制睪丸內精子的生成，影響大鼠的生殖功能，然而 其造成雄性生殖毒性的具體機制還不確定。本研究通過探索丙烯酰胺對體外大鼠睪丸間質細胞R2C的毒性損傷情況，探討其引起生殖毒性的機制，為丙烯酰胺的安全性評估提供一定依據。

1 材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

R2C細胞，由暨南大學生物醫藥中心實驗室提供。

AA（CAS登錄號：79-06-01，純度98%） 德州市富凱化工有限責任公司；F12培養液、馬血清 美國Life公司；胎牛血清、胰酶 美國Gibco公司；二甲基亞砜（dimethy l sulfoxide，DMSO）、四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT） 美國Amresco公司；低熔點瓊脂糖、正常熔點瓊脂糖 美國FMC公司；Tris、乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diamine tetraacetic acid disodium salt，EDTA-Na2）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100） 美國Genview公司；孕酮放射免疫試劑盒 北方生物技術研究所。

37℃細胞培養箱、酶標儀 美國Thermo公司；低溫離心機 金壇市富華儀器公司；GC-1200γ放射免疫計數儀科大創新股份中佳公司。

1.2方法

1.2.1 MTT法檢測AA對R2C細胞活性的影響

將生長對數期的R2C細胞接種于96孔板，每孔200μL懸液，4×103個細胞。24 h后，加入無血清F12培養液稀釋的濃度為0.25、0.5、0.75、1、2、4、6 mmol/L的AA，每組3個復孔，并設置無細胞的空白組（只加200μLF12培養液）和對照組（加200μL細胞懸液，不加AA），重復3次。作用24 h后，每孔加10μL5 mg/mL的MTT試劑，放于37 ℃培養箱。4 h后，去除液體，加200μLDMSO，置于脫色搖床搖動10 min，于酶標儀570 nm波長處檢測吸光度，按照下式計算AA對R2C細胞活性的抑制率。

式中：A0、A1、A2分別為空白組、AA給藥組、對照組的吸光度。

將得到的數據通過Graphpad軟件分析AA作用的IC25、IC50和IC75。

1.2.2倒置顯微鏡觀察AA對R2C形態的影響

將R2C細胞以1×106個/mL的濃度接種于6孔板，加入IC25、IC50和IC75濃度的AA作用24 h后，用倒置顯微鏡觀察細胞并拍照。

1.2.3彗星實驗（Comet assay）檢測AA對R2C細胞DNA的損傷

R2C細胞生長至對數期后，將細胞以1×105個/mL的濃度接種于6孔板。培養24 h，分別加入IC25、IC50和IC75濃度的AA作用于細胞。4 h后將對照組及經過3種濃度AA處理的R2C細胞消化、離心后，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗1遍。

將細胞重懸于0.8%的低熔點瓊脂糖（low melting agarose，LMP）中，取100μL到已預涂了一層正常熔點瓊脂糖的載玻片上，然后在最上層再加一層LMP。待瓊脂糖凝固后，將載玻片置于裂解液（0.1 mol/L EDTA-Na2、2.5 mol/L NaCl、10 mmol/L Tris、體積分數1%的Triton X-100、體積分數10%的DMSO，臨用前配制，pH 10.0）中，5℃處理1 h。將載玻片放在堿性電泳緩沖液（0.3 mol/L NaOH、1 mmol/L EDTA-Na2，pH 13.6）中處理20 min。堿性條件下（pH 13.6）進行電泳（25 V、20 min）。電泳結 束后，用pH 7.5的Tris-HCl溶液將載玻片洗3次，每次5 min。用20μL25μg/mL的溴化乙錠（ethidium bromide，EB）對DNA染色，蓋上蓋玻片。熒光顯微鏡拍照，CASP軟件分析電泳檢測結果。

1.2.4放射免疫法（radioimmunoassav，RIA）檢測AA對R2C細胞孕酮合成量的影響

將對數生長期的R2C細胞調整濃度為106個/mL，接種到6孔板，每孔1 mL。24 h后加入AA濃度為IC25、IC50和IC75的培養液。4 h或24 h后收集上清液，并保存于-20 ℃。按孕酮放射免疫試劑盒說明書方法進行孕酮合成量的測定。

1.3統計學分析

2 結果與分析

2.1 AA對R2C細胞生長的抑制作用

由圖1可知，AA對R2C細胞活性的抑制率隨其濃度的增加而升高。通過Graghpad軟件分析得到AA對R2C細胞的IC25、IC50、IC75分別為1.140、1.925、3.250 mmol/L。

圖1 不同濃度AA對R2C細胞的生長抑制率Fig.1 Inhibitory ratios of AA on the growth of R2C cells

圖2 不同濃度AA作用24 h后的R2C細胞形態（×400）Fig.2 Morphological changes of R2C cells after being exposed tovarious concentrations of AA for 24 h (× 400)

由圖2可知，濃度分別為1.140、1.925、3.250 mmol/L（IC25、IC50、IC75）的AA作用24 h后，R2C細胞變小，形狀由不規則多邊形變為橢圓形，細胞數目減少且貼壁能力降低，且AA對R2C細胞生長的抑制作用呈現劑量依賴性。

2.2 AA對R2C細胞DNA損傷的作用

圖3 不同濃度AA刺激4 h后R2C細胞的尾部DNA含量Fig.3 Tail DNA content in R2C cells after being exposed to AA for 4 h

由圖3～5可知，與對照組相比，不同濃度的AA作用于R2C細胞4 h后，細胞拖尾現象顯著增加。R2C細胞的尾部DNA含量、尾長及Olive尾距（Olive tail moment，OTM）均隨AA濃度增加而增大，尤其當AA濃度為1.925、3.250 mmol/L（IC50、IC75）時，其尾部DNA含量、尾長和OTM分別增加了1 166.6%、1 776.7%，106.4%、295.7%和329.3%、476.9%，結果較對照組具有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），表明AA可以誘導R2C細胞產生DNA損傷。

圖4 不同濃度AA刺激4 h后R2C細胞的尾長Fig.4 Tail length of R2C cells after being exposed to AA for 4 h

圖5 不同濃度AA刺激4 h后R2C細胞的Olive尾距Fig.5 Olive tail moment of R2C cells after being exposed to AA for 4 h

2.3 AA對R2C細胞孕酮合成量的影響

圖6 不同濃度AA作用4 h后對R2C細胞孕酮合成量的影響Fig.6 Effect of AA exposure for 4 h on progesterone biosynthesis of R2C cells

圖7 不同濃度AA作用24 h后對R2C細胞孕酮合成量的影響Fig.7 Effect of AA exposure for 24 h on progesterone biosynthesis of R2C cells

孕酮合成量檢測結果表明，AA作用R2C細胞4 h后，各AA濃度組細胞的孕酮合成量與對照組相比無明顯差異（圖6）。AA繼續作用R2C細胞24 h后，各AA濃度組細胞的孕酮合成量顯著降低，與對照組相比分別降低了19.5%、28.6%及34.2%（圖7），且均具有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），且隨著AA作用濃度增加，抑制效果更加明顯。

3 討 論

研究報道丙烯酰胺具有遺傳毒性、神經毒性和生殖毒性[10]。多項研究結果表明，AA能夠對動物生殖器官產生毒性作用[11-12]，并證明AA是通過干擾類固醇激素的合成來影響動物的生殖功能[13]。Chen等[14]研究表明，AA能夠損傷大鼠睪丸，引起生殖功能的下降，但未通過體外細胞實驗對其進行研究。從大鼠體內分離睪丸間質原代細胞程序復雜，并且不能傳代培養，限制了其作為評估模型的應用[15]，而R2C細胞是一個能在無激素刺激條件下持續大量分泌孕酮的睪丸間質細胞株，且具有無限傳代的能力，可作為一種快速評價雄性生殖毒性的細胞模型[16-17]。故本研究以睪丸間質細胞R2C為體外實驗對象，通過檢測細胞的生物活性及功能等來探討AA的毒性作用。

目前對AA體外生殖毒理的研究還比較少，因此本實驗AA刺激劑量的選擇主要是參考Mehri等[18]研究AA體外神經毒性的數據，進而確定AA刺激劑量范圍以探討其生殖毒性作用。實驗結果顯示，AA能夠抑制R2C細胞的活性、影響細胞的正常生長狀態，且上述抑制效果與AA的作用劑量成正相關。因此，AA可能通過抑制生殖細胞的活性來干擾生殖系統的功能。單細胞電泳結果表明，AA可以誘導R2C細胞發生明顯的DNA損傷。有研究表明，DNA損傷能夠引發細胞凋亡，降低細胞活力甚至導致細胞死亡[19-20]。由此推測，AA對R2C細胞生長的抑制作用可能與其誘導細胞DNA損傷有關。類固醇激素對于維持動物生殖功能起著重要的作用[21]，睪丸間質細胞最主要的功能是分泌睪酮[22]，而孕酮是睪酮合成的前體物，是其合成通路中最重要的中間產物，睪丸間質細胞模型R2C細胞株由于17β-羥化酶功能損壞、17β-羥類固醇脫氫酶缺失導致其僅能分泌孕酮，通過檢測孕酮水平可間接反映睪酮的分泌量[23-24]，所以將睪酮合成的前體物質——孕酮作為評價生殖功能的指標。有研究顯示[25]，體外培養睪丸間質細胞，在4 h時睪酮分泌量達到最大，考慮時間依賴的影響，本實驗選取4 h和24 h兩個時間點進行研究。結果發現，AA作用于R2C細胞4 h后對孕酮合成量無明顯影響，作用24 h后與對照組相比，3種濃度的AA均能引起R2C細胞孕酮合成量顯著降低，且AA濃度越大，降低程度越明顯。該結果說明，AA能造成R2C細胞孕酮合成功能下降，進而能夠影響睪酮的合成，且抑制呈時間-劑量依賴性。

根據上述結果可以推測，AA可能是通過損傷睪丸間質細胞DNA，造成相關蛋白合成受阻，從而影響細胞孕酮合成功能的下降或細胞活性下降，而細胞活性的下降可能也會影響細胞正常功能的發揮，最終導致生殖系統功能下降。下一步擬通過對孕酮合成途徑中某些關鍵蛋白及其mRNA表達水平的研究來探討AA毒性作用的具體機制，為闡明AA影響睪丸間質細胞功能的機理研究提供依據。

[1] 解瑞麗, 周啟星. 丙烯酰胺的環境暴露, 生態行為與毒理效應研究進展[J]. 生態學雜志, 2013, 32(5)∶ 1347-1354.

[2] FRIEDMAN M. Chemistry, biochemistry, and safety of acrylamide. A review[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51( 16)∶4504-4526.

[3] GARGAS M L, KIRMAN C R, SWEENEY L M, et al. Acrylamide∶consideration of species differences and nonlinear processes in estimating risk and safety for human ingestion[J]. Food and Chemical Toxicology, 2009, 47(4)∶ 760-768.

[4] KLAUNIG J E. Acrylamide carcinogenicity[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56(15)∶ 5984-5988.

[5] 鄭宗平, 秦川, 蘭山, 等. 食品體系中丙烯酰胺的研究進展∶ 抑制劑及其抑制機理[J]. 食品科學, 2014, 35(1)∶ 282-288. doi∶ 10.7506/ spkx1002-6630-201401056.

[6] CLAUS A, CARLE R, SCHIEBER A. Acrylamide in cereal products∶a review[J]. Journal of Cereal Science, 2008, 47(2)∶ 118-133.

[7] PARK J, KAMENDULIS L M, FRIEDMAN M A, et al. Acrylamideinduced cellular transformation[J]. Toxicological Sciences, 2002, 65(2)∶ 177-183.

[8] WANG Hao, HUANG Pan, LIE Tietao, et al. Reproductive toxicity of acrylamide-treated male rats[J]. Reproductive Toxicology, 2010, 29(2)∶ 225-230.

[9] YANG H J, LEE S H, JIN Y, et al. Toxicological effects of acrylamide on rat testicular gene expression profile[J]. Reproductive Toxicology, 2005, 19(4)∶ 527-534.

[10] 李棟, 金成, 湯谷平, 等. 丙烯酰胺代謝機理及其體內毒性防護的研究進展[J]. 中國食品學報, 2011, 11(4)∶ 139-146.

[11] LEE J G, WANG Y S, CHOU C C. Acrylamide-induced apoptosis in rat primary astrocytes and human astrocytoma cell lines[J]. Toxicology in Vitro, 2014, 28(4)∶ 562-570.

[12] CAMACHO L, LATENDRESSE J R, MUSKHELISHVILI L, et al. Effects of acrylamide exposure on serum hormones, gene expression, cell proliferation, and histopathology in male reproductive tissues of Fischer 344 rats[J]. Toxicology Letters, 2012, 211(2)∶ 135-143.

[13] CENGIZ M F, G?ND?Z C P B. Acrylamide exposure among Turkish toddlers from selected cereal-based baby food samples[J]. Food and Chemical Toxicology, 2013, 60∶ 514-519.

[14] CHEN J H, YANG C H, WANG Y S, et al. Acrylamide-induced mitochondria collapse and apoptosis in human astrocytoma cells[J]. Food and Chemical Toxicology, 2013, 51∶ 446-452.

[15] SUN Jianxia, BAI Shun, BAI Weibin, et al. Toxic mechanisms of 3-monochloropropane-1,2-diol on progesterone production in R2C rat leydig cells[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(41)∶ 9955-9960.

[16] ZHANG Qihao, ZOU Ping, ZHAN Haichao, et al. Dihydrolipoamide dehydrogenase and cAMP are associated with cadmium-mediated leydig cell damage[J]. Toxicology Letters, 2011, 205(2)∶ 183-189.

[17] 管永波, 郝鵬飛, 唐春宇, 等. 氟化鈉對小鼠睪丸間質瘤細胞StAR和P450scc mRNA表達的影響[J]. 衛生研究, 2012, 41(1)∶ 105-108.

[18] MEHRI S, ABNOUS K, MOUSAVI S H, et al. Neuroprotective effect of crocin on acrylamide-induced cytotoxicity in PC12 cells[J]. Cellular and Molecular Neurobiology, 2012, 32(2)∶ 227-235.

[19] ROOS W P, KAINA B. DNA damage-induced cell death by apoptosis[J]. Trends in Molecular Medicine, 2006, 12(9)∶440-450.

[20] NIXON B J, STANGER S J, NIXON B, et al. Chronic exposure to acrylamide induces DNA damage in male germ cells of mice[J]. Toxicological Sciences, 2012, 129(1)∶ 135-145.

[21] STOUT E P, la CLAIR J J, SNELL T W, et al. Conservation of progesterone hormone function in invertebrate reproduction[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2010, 107(26)∶11859-11864.

[22] 張楊楊. 以線粒體為靶點研究重金屬鉛對睪丸間質細胞損傷的毒理作用機制[D]. 廣州∶ 暨南大學, 2013∶ 2-4.

[23] 白順, 孫建霞, 白衛濱, 等. 1,3-二氯-2-丙醇對睪丸間質細胞R2C活性及孕酮合成的影響[J]. 食品科學, 2013, 34(9)∶ 292-295. doi∶10.7506/spkx1002-6630-201309059.

[24] SUN Jianxia, BAI Shun, BAI Weibin, et al. 1,3-Dichloro-2-propanol inhibits progesterone production through the expression of steroidogenic enzymes and cAMP concentration in leydig cells[J]. Food Chemistry, 2014, 154∶ 330-336.

[25] 王麗蕃. 藏黨參中主要活性成分的測定及其多糖對睪丸間質細胞影響的研究[D]. 北京∶ 中央民族大學, 2009∶ 33-34.

Effect of Acrylamide on the Viability and Progesterone Biosynthesis Function of Rat R2C Leydig Cells

LI Mingwei1, SUN Jianxia2, XU Wei1, ZOU Feiyan1,*, BAI Shun1, ZHU Cuijuan1, HU Yunfeng1, JIAO Rui1,
WU Shi1, OU Shiyi1, FENG Mengge1, BAI Weibin1,*
(1. The First Affiliated Hospital, College of Life Science and Technology, Department of Food Science and Engineering, College of Science and Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China; 2. Faculty of Chemical Engineering and Light Industry, Guangdong University of Technology, Guangzhou 510006, China)

Objective∶ To examine the effect of acrylamide (AA) on cell growth and progesterone synthesis in rat R2C cells. Methods∶ R2C cells were treated with AA at concentrations of 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 4 and 6 mmol/L, respectively. Three inhibitory concentrations (IC25, IC50and IC75) were determined by MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay. Cell morphology was observed after being sti mulated by the three inhibitory concentrations of AA for 24 h. DNA damage in R2C cells was measured by comet assay. The amounts of progesterone biosynthesis after being exposured to AA for 4 h and 24 h were detected by radioimmunoassay (RIA). Results∶ AA could inhibit the cell viability. The IC25, IC50and IC75were determined to be 1.140, 1.925 and 3.250 mmol/L, respectively. At these three concentrations, AA could affect cell morphology to different extends. DNA was significantly damaged at three concentrations of AA for 4 h, whereas the progesterone levels were significantly reduced after being exposed to AA for 24 h. Conclusion∶ AA can inhibit the cell growth and reduce the progesterone synthesis of R2C cells.

acrylamide; R2C cell; cell activity; DNA damage; progesterone

Q26

1002-6630（2015）17-0247-05

10.7506/spkx1002-6630-201517046

2015-04-16

廣東省高等學校優秀青年教師培養計劃項目（Yq2013024）；教育部“新世紀優秀人才支持計劃”項目；

國家自然科學基金青年科學基金項目（31201402；31201340）

李名薇（1989—），女，碩士研究生，研究方向為生殖毒性評價。E-mail：limingwei_2008@163.com

*通信作者：鄒飛雁（1963—），女，副教授，博士，研究方向為生殖與發育。E-mail：zoufeiyan6364@yahoo.com.cn

白衛濱（1978—），男，副研究員，博士，研究方向為食品營養與毒理安全性評價。E-mail：baiweibin@163.com