赤霉素GA3急性毒性和遺傳毒性

商 桑，王 健，丁曉雯*

赤霉素GA3急性毒性和遺傳毒性

商 桑，王 健，丁曉雯*

（西南大學食品科學學院，重慶市農產品加工重點實驗室，重慶 400715）

目的：研究赤霉素GA3的急性毒性和遺傳毒性，為合理使用赤霉素以及赤霉素殘留限量標準的制定提供參考。方法：采用最大劑量耐受法測定赤霉素GA3的急性毒性，采用蠶豆根尖細胞微核實驗、小鼠骨髓細胞微核實驗和小鼠精子畸形實驗測定赤霉素GA3的遺傳毒性。結果：給昆明種小鼠經口灌胃赤霉素GA3，LD50＞15 000 mg/kg；赤霉素GA3在質量濃度為0.1～2.0 mg/L范圍內時，蠶豆根尖細胞微核率呈上升趨勢，與陰性對照組相比均存在極顯著差異，且微核指數均＞1.5；7.5 g/kg赤霉素GA3對雌、雄小鼠的骨髓細胞微核率分別為7.47‰、7.07‰，小鼠精子畸形率為5.47%，與陰性對照組相比均存在極顯著差異（P＜0.01）。結論：赤霉素GA3的急性毒性雖然比較低，屬于無毒級，但是在較高劑量條件下對植物細胞、動物的體細胞與生殖細胞均具有遺傳毒性，應盡快制定赤霉素GA3使用限量標準。

赤霉素A3；急性毒性；遺傳毒性

赤霉素是一種生物活性高、應用廣泛的植物激素類農藥，具有促進種子萌發、莖伸長、葉片發育、花和果實發育等作用[1]，至今已發現100多種赤霉素，其中赤霉素GA3的生物活性最高、應用最廣泛[2]。赤霉素GA3又名赤霉酸、“九二0”、“奇寶”，美國、日本等國家規定水果和蔬菜中赤霉素GA3的最高殘留限量為0.2 mg/kg[3]，而我國目前還未出臺相應的農產品限量標準。

目前對赤霉素GA3的毒理學安全性評價的報道很少，也無赤霉素GA3導致人體中毒的報道，所以有必要對赤霉素GA3的安全性進行評價。本實驗通過急性毒性實驗和遺傳毒性實驗（包括蠶豆根尖細胞微核實驗、小鼠骨髓細胞微核實驗和小鼠精子畸形實驗）對赤霉素GA3的安全性進行初步評價，以期為科學、合理地使用赤霉素GA3以及赤霉素GA3殘留限量標準的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、動物與試劑

蠶豆為優質小青皮豆，重慶當地產，當年新種，購于重慶市北碚區天生農貿市場。

SPF級昆明種小鼠，體質量25～30 g，重慶市中藥研究院實驗動物研究所提供，許可證號：SCXK（渝）2007-0006。

赤霉素GA3（純度90%） 上海源葉生物公司；Giemsa染液 上海馨晟試化工科技有限公司；環磷酰胺山西普德藥業有限公司；小牛血清 廣州蕊特生物科技有限公司；甲醇、酚酞、堿性品紅、偏重亞硫酸鈉（Na2S2O5）、硫代硫酸鈉（Na2S2O3）、伊紅、甘油等試劑均為分析純 成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

XSN-3G型顯微鏡 重慶光電儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 急性毒性實驗[4]

采用最大耐受劑量法進行急性毒性實驗：稱取7.500 g赤霉素GA3于研缽中，將其研磨成粉末狀，用蒸餾水定容至10 mL。選用昆明種小鼠雌、雄各10 只，每日給予小鼠最大灌胃劑量20 mL/kg（以體質量計，下同）的赤霉素GA3，連續觀察14 d，記錄小鼠中毒表現及死亡情況。

1.3.2 蠶豆根尖細胞微核實驗[5]

將赤霉素GA3用蒸餾水配制成不同質量濃度的溶液，設陰性對照組（蒸餾水）、陽性對照組（環磷酰胺10 mg/L）、實驗組（赤霉素GA30.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mg/L）。蠶豆于24 ℃蒸餾水中浸泡36 h，濕紗布包裹催芽36 h，選已發芽的蠶豆放入墊有濕脫脂棉的培養皿中培養36 h，每12 h換水一次。選擇根芽整齊一致，根長約1.0～1.5 cm的蠶豆隨機分組。每組隨機挑選6～8 粒發芽種子，置于盛放待測液的培養皿中浸泡4～6 h。處理后的種子用蒸餾水浸洗，再放入墊有濕脫脂棉的培養皿中回復培養24 h。切下1 cm根尖，用卡諾氏固定液（甲醇-冰乙酸（3∶1，V/V））固定24 h，放入體積分數70%的乙醇中4 ℃保存。常規制片，改良苯酚品紅染液染色，壓片鏡檢，每組觀察5 個根尖，每個根尖計數1 000 個細胞，記錄含微核的細胞數，按公式（1）、（2）計算微核率及微核指數。

在陽性對照組的微核率顯著增加，表示實驗系統成立的情況下，若實驗組的微核率與陰性對照組比較有顯著差異，且微核指數≥1.5，則判斷赤霉素GA3可能具有致突變性[6]。

1.3.3 小鼠骨髓細胞微核實驗[7]

用蒸餾水配制3 個不同質量濃度的赤霉素GA3溶液，即高劑量組（1/2 LD50）、中劑量組（1/4 LD50）及低劑量組（1/8 LD50），并設陰性對照組（蒸餾水）及陽性對照組（2 mg/mL環磷酰胺）。選用7～12 周齡，體質量25～30 g的昆明種小鼠，每組10 只，雌雄各半。采用30 h給受試物法對小鼠經口灌胃，首次灌胃后間隔24 h第2次灌胃受試物，6 h后立即處死小鼠。取小鼠胸骨或股骨，按照GB 15193.5—2003《骨髓細胞微核試驗》[7]中的方法制片及觀察。每只小鼠計數1 000 個嗜多染紅細胞，記錄含微核的嗜多染紅細胞數，按公式（3）計算微核率。

1.3.4 小鼠精子畸形實驗[8]

用蒸餾水配制3 個不同質量濃度的赤霉素GA3，即高劑量組（1/2 LD50）、中劑量組（1/4 LD50）及低劑量組（1/8 LD50），并設陰性對照組（蒸餾水）及陽性對照組（2 mg/mL環磷酰胺）。選用6～8 周齡，體質量25～35 g的成年雄性小鼠，連續灌胃受試物5 d，每天1 次。首次給受試物35 d后處死小鼠，取出副睪，按照GB 15193.7—2003《小鼠精子畸形試驗》[8]中的方法制片及觀察。每只小鼠計數1 000 條完整精子，檢查精子頭部和尾部的形態是否異常，記錄精子畸形數，按公式（4）計算精子畸形率。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 急性毒性實驗結果

經過預實驗可知赤霉素GA3的急性毒性較小，因此采用最大耐受劑量法對其進行急性毒性評價。

將質量濃度為0.75 g/mL的赤霉素GA3按照0.4 mL/20 g的最大灌胃劑量給予小鼠，連續觀察14 d，小鼠未出現死亡情況，也沒有任何中毒表現。表明赤霉素GA3對昆明種小鼠經口急性毒性最大耐受劑量＞15 g/kg，即LD50＞15 000 mg/kg。

2.2 蠶豆根尖細胞微核實驗結果

表1 赤霉素GA3對蠶豆根尖細胞微核率的影響Table1 Frequencies of micronucleus in Vicia ffaabbaa root tips exposed to

表1 赤霉素GA3對蠶豆根尖細胞微核率的影響Table1 Frequencies of micronucleus in Vicia ffaabbaa root tips exposed to

注：**.與陰性對照組比較，差異極顯著（P＜0.01）。下同。

組別質量濃度/（mg/L）微核率/‰微核指數陰性對照組（蒸餾水）011.51±1.731.00陽性對照組（環磷酰胺）1031.45±2.34**2.73實驗組（赤霉素GA3）0.117.48±1.86**1.52 0.223.90±2.10**2.08 0.431.18±2.20**2.71 0.634.92±2.58**3.03 0.841.38±2.21**3.60 1.047.69±1.85**4.14 2.050.51±1.74**4.39

由表1可知，在赤霉素GA3質量濃度為0.1～2.0 mg/L范圍內，蠶豆根尖細胞微核率呈逐漸上升趨勢，與陰性對照組相比均存在極顯著差異（P＜0.01），且微核指數均＞1.5。

2.3 小鼠骨髓細胞微核實驗結果

圖1 正常及含微核的嗜多染紅細胞Fig.1 Normal polychromatic erythrocytes and polychromatic erythrocytes with micronucleus

由圖1可知，正常的嗜多染紅細胞較圓，呈淡紫色；而含微核的嗜多染紅細胞稍大，且在細胞內有一個深紫色的微核，微核直徑約為細胞直徑的1/10。

表2 赤霉素GA3對小鼠骨髓細胞微核率的影響Table2 Frequencies of micronucleus in polychromatic erythrocytesTable2 Frequen exposed to GA o GA3

表2 赤霉素GA3對小鼠骨髓細胞微核率的影響Table2 Frequencies of micronucleus in polychromatic erythrocytesTable2 Frequen exposed to GA o GA3

小鼠性別組別灌胃劑量/（g/kg）微核率/‰雄性陰性對照組3.07±0.55陽性對照組0.04022.93±1.52**赤霉素GA3低劑量組1.8753.13±0.45赤霉素GA3中劑量組3.7503.67±0.62赤霉素GA3高劑量組7.5007.07±0.92**雌性陰性對照組2.93±0.55陽性對照組0.04022.53±0.84**赤霉素GA3低劑量組1.8753.20±0.65赤霉素GA3中劑量組3.7503.80±0.77赤霉素GA3高劑量組7.5007.47±1.10**

由表2可知，陽性對照組與陰性對照組相比存在極顯著差異（P＜0.01），證明此條件下所獲得的實驗結果是可靠的。對于雄性小鼠，赤霉素GA3低、中、高劑量組的微核率分別為3.13‰、3.67‰、7.07‰，且赤霉素GA3高劑量組與陰性對照組相比存在極顯著差異（P＜0.01）。對于雌性小鼠，赤霉素GA3低、中、高劑量組的微核率分別為3.20‰、3.80‰、7.47‰，且赤霉素GA3高劑量組與陰性對照相比存在極顯著差異（P＜0.01）。

2.4 小鼠精子畸形實驗結果

表3 赤霉素GA3對小鼠精子畸形率的影響TTaabbllee 33 FFrequencies of mice sperm abnormality exposed to GA3

表3 赤霉素GA3對小鼠精子畸形率的影響TTaabbllee 33 FFrequencies of mice sperm abnormality exposed to GA3

組別灌胃劑量/（g/kg）精子畸形率/%陰性對照組4.26±0.24陽性對照組0.0409.32±0.49**赤霉素GA3低劑量組1.8754.39±0.38赤霉素GA3中劑量組3.7504.60±0.39赤霉素GA3高劑量組7.5005.47±0.42**

由表3可知，陰性對照組及陽性對照組的小鼠精子畸形率分別為4.26%、9.32%，兩者之間存在極顯著差異，故認為此條件下實驗結果是可靠的。赤霉素GA3低、中、高劑量組的小鼠精子畸形率分別為4.39%、4.60%、5.47%，且赤霉素GA3高劑量組與陰性對照組相比存在極顯著差異（P＜0.01）。

圖2 小鼠精子畸形類型及畸形數Fig.2 Types of sperm abnormality of mice exposed to GA3

由圖2可知，赤霉素GA3各劑量組對小鼠精子畸形類型的影響以無定形為主，其次為尾折疊、香蕉形、無鉤、胖頭、小頭，而雙頭、雙尾較少。

3 結論與討論

急性毒性是食品安全性毒理學評價程序的第一階段，是指經口一次性給予或24 h內多次給予受試物后，動物在短時間內產生的毒性反應，包括致死和非致死的指標參數，致死劑量常用半數致死量LD50表示[4]。本實驗結果表明，赤霉素GA3對昆明種小鼠經口最大耐受劑量＞15 g/kg，即LD50＞15 000 mg/kg，急性毒性較低。但有研究表明，赤霉素GA3對動物的肝臟功能會產生一定影響[9-13]，能促進鼠仔出生后的生長發育[14]，有神經毒害作用[15]，還會增加患皮膚炎癥和膀胱疾病的機率[16]。

蠶豆根尖細胞微核實驗是一種檢測化學物質遺傳毒性的方法。由于蠶豆根尖細胞在分裂時受到外界誘變因子的作用而產生不隨細胞分裂進入細胞核的染色體小片段，可根據微核指數初步判斷受試物是否具有致突變性及誘變嚴重程度[17]。因這種方法具有簡便、經濟、快速、重現性好、靈敏度高，且檢測結果與動物實驗結果較一致等優點，在致突變性的檢測方面得到越來越廣泛的應用，該技術應用范圍已從最初的水環境[18]迅速擴展到食品[19]、藥物[20]等復雜體系中致突變物的檢測。已有文獻表明赤霉素GA3有致癌性[21-25]和致畸性[26]。而本實驗表明經0.1～2.0 mg/L赤霉素GA3處理的蠶豆根尖細胞微核率與陰性對照組存在極顯著差異，且微核指數均＞1.5，初步判定赤霉素GA3可能具有致突變性。

小鼠骨髓細胞微核實驗是一種通過骨髓嗜多染紅細胞微核率以評價細胞遺傳損傷的體內微核實驗。紅細胞受到外界誘變因子的作用可形成微核[27]。本實驗中，與陰性對照組相比，高質量濃度的赤霉素GA3（7.5 g/kg）誘導的骨髓嗜多染紅細胞微核率具有極顯著差異（P＜0.01），表明赤霉素GA3對雌、雄小鼠體細胞均具有一定的遺傳毒性。

小鼠精子畸形實驗是一種通過觀察精子形態變化以檢測環境因子對生殖細胞致突變作用的體內實驗。已知精子的畸形是精子基因突變的結果，因此精子形態的改變表明有關基因及其蛋白質產物發生了變化[8]。本實驗結果表明，與陰性對照組相比，赤霉素GA3高劑量組（7.5 g/kg）的小鼠精子畸形率存在極顯著差異（P＜0.01），表明赤霉素GA3對小鼠生殖細胞具有一定的遺傳毒性。赤霉素GA3對小鼠精子畸形類型的影響以無定形為主，其次為尾折疊、香蕉形、無鉤、胖頭、小頭，而雙頭、雙尾則較少。

赤霉素GA3的急性毒性雖然較低，屬于無毒級，但是在較高劑量（7.5 g/kg）條件下對植物細胞、動物的體細胞與生殖細胞都具有遺傳毒性，應盡快制定赤霉素使用限量標準，以保證廣大消費者的健康。

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Acute Toxicity and Genetic Toxicity of Gibberellin A3

SHANG Sang, WANG Jian, DING Xiaowen*(Chongqing Key Laboratory of Agricultural Products Processing, College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Purpose∶ To examine the acute toxicity and genotoxicity of gibberellin A3(GA3), which can provide scientificsupport for the reasonable use of GA3and a reference for establishing maximum residue limit (MRL) for GA3. Methods∶Acute toxicity was examined by using the maximum tolerated dose method while genotoxicity was examined usingViciamicronucleus test, bone marrow cell micronucleus test and sperm abnormality test in mice. Results∶ The acute oral LD50ofGA3in Kunming mice was > 15 000 mg/kg. As GA3concentration increased from 0.1 to 2.0 mg/L, the micronucleus rate ofVicia fabaroot tip cells showed a rising trend, which indicated a highly significant difference compared to negative controlsand the micronucleus index remained higher than 1.5 at all investigated GA3concentrations. The bone marrow micronucleusrates of male and female mice treated with 7.5 g/kg GA3were 7.47‰and 7.07‰, respectively, and the sperm malformationrate of mice was 5.47%, which revealed highly significant differences compared to that of negative controls (P＜ 0.01).Conclusion∶ Although GA3with low acute toxicity can be considered as a non-toxic substance, it causes genotoxicity to plantcells and animal somatic and germ cells at high doses. The MRL for GA3should be set up as early as possible.

gibberellin A3; acute toxicity; genotoxicity

TS201.6

A

10.7506/spkx1002-6630-201517044

2014-09-18

重慶市科委重點課題（cstc2013yykfB0165）

商桑（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品安全與質量控制。E-mail：gksl612susan@yeah.net

*通信作者：丁曉雯（1963—），女，教授，博士，研究方向為食品安全與質量控制。E-mail：xiaowend@sina.com