藍莓葉總黃酮的體外抗炎功效評價

趙 丹，蘇 寧，楊 麗，鄭洪艷，霍 彤，王昌濤,*

藍莓葉總黃酮的體外抗炎功效評價

趙 丹1，蘇 寧2，楊 麗2，鄭洪艷2，霍 彤1，王昌濤1,*

（1.北京工商大學理學院，北京 100048；2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176）

目的：通過體外實驗方法從分子水平對藍莓葉總黃酮的抗炎功效進行評價。方法：建立人永生化表皮細胞HaCaT與藍莓葉總黃酮的共培養體系，利用反轉錄實時熒光定量聚合酶鏈式反應檢測在不同培養時間點（0、15、30、60、120 min）白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-8、干擾素誘導蛋白-10（interferon-inducible prot ein-10，IP-10）等炎癥細胞因子相關基因表達情況，觀察藍莓葉總黃酮的添加對這些基因表達的影響，并探討藍莓葉總黃酮在分子水平上的抗炎機理。結果：藍莓葉總黃酮的添加能夠提高抗炎因子IL-6、CXCR-2基因的表達量（P＜0.05），降低促炎因子IL-8、IP-10基因的表達量（P＜0.05），對CXCR-1基因的表達呈復雜型調節。結論：藍莓葉總黃酮通過對炎癥相關因子表達量產生影響，從而減弱促炎癥反應，增強抗炎癥反應，最終發揮抗炎功效。

藍莓葉總黃酮；炎癥因子；反轉錄實時熒光定量聚合酶鏈式反應；抗炎

由于動物實驗所存在的倫理問題以及國際上對動物福利的日益關注，發展新的體外實驗方法用以減少、優化和替代（reduction, refinement, replacement，3R理論）動物實驗成為當前研究的熱點。反轉錄實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）技術因其具有特異性強、靈敏度高以及重復性好等優勢，在動物替代實驗領域發揮了日益重要的作用。此技術不僅避免了PCR產物污染產生的假陽性結果和非特異性擴增問題，同時還能夠對標本模板進行精確定量[1-2]。

皮膚在受到外界藥物刺激后會發生炎癥反應。 在這個過程中，白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-8、干擾素誘導蛋白-10（interferon-inducible protein-10，IP-10）等炎癥因子和趨化因子的相關基因表達會受到影響。IL-6能夠刺激參與免疫反應的細胞增殖、分化并提高其功能活性；IL-8是巨噬細胞和上皮細胞等分泌的細胞因子，與其受體CXCR-1和CXCR-2結合而對中性粒細胞產生細胞趨化作用，從而實現對炎癥反應的調節[3-5]。

本實驗利用反轉錄實時熒光定量PCR技術，檢測在人類永生化表皮細胞HaCaT培養體系中藍莓葉總黃酮的添加對這些細胞因子表達量的影響，從而進一步對這些細胞因子的表達與皮膚炎癥反應的關系進行研究。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

HaCaT細胞，購自上海斯信生物科技有限公司。

DMEM低糖培養基、二甲基亞砜 德國Sigma公司；胎牛血清 美國Gibco公司；青霉素-鏈霉素雙抗（100×） 美國Corning公司。

1.2儀器與設備

WJ-80A-ⅡCO2培養箱 上海圣科儀器設備有限公司；ABI 7300型實時熒光定量PCR儀、GeneAmp PCR System 9700美國ABI應用生物系統公司；Enduro水平電泳儀 美國Labnet公司；3-30K臺式高速冷凍離心機、1-14微型離心機 德國Sigma公司；SW-CJ-1D超凈工作臺 上海啟前電子科技有限公司；細胞培養瓶、細胞培養瓶板、細胞凍存管 美國Corning/Costar公司。1.3方法

1.3.1細胞培養及處理

從-80℃冰箱中取出待用凍存的HaCaT細胞，迅速置于37℃水浴中解凍，在1～2 min內輕微振動使其融化。1 000 r/min離心10 min，棄去上清液，在沉淀中加入1 mL DMEM完全培養液，轉移至25 cm2培養瓶中，37℃、5%CO2培養。當細胞生長至90%融合時，用2 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）輕柔清洗兩次，加入200μL0.25%胰酶后放入CO2培養箱中消化5 min，放到顯微鏡下觀察，當確認細胞從培養瓶壁上脫落后，加入2 mL DMEM完全培養液終止消化，800 r/min離心10 min，棄去上清液，加入4 mL培養液，進行細胞計數后，以5×105個/cm2的密度接種于25 cm2培養瓶中。

將消化后的HaCaT細胞以2×106個/孔的密度接種于6孔板內，以60μg/mL質量濃度藍莓葉總黃酮處理細胞0、15、30、60、120 min。

1.3.2細胞總RNA提取與檢測

待細胞密度長至80%時，冰浴條件下，依次加入1 mL Trizol、0.2 mL氯仿，手搖振蕩2 min；4℃、8 000 r/min離心15 min，取上層水相，加入等體積異丙醇（約700μL），振蕩，靜置15 min；12 000 r/min離心10 min，棄去上清液，向沉淀中加入1 mL 70%乙醇洗滌，8 000 r/min離心10 min；重復進行1次乙醇洗滌；室溫條件下干燥15 min，加入40μL經焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）處理的ddH2O，溶解10 min后于-80℃保存[6-7]。

瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA：將樣品和Marker加至凝膠上樣孔，180 V電壓電泳10 min。

1.3.3 cDNA第一鏈合成

使用TINAGEN FastQuantRTKit（含gDNase）FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒（去基因組）進行cDNA第一條鏈合成反應。

1.3.4反轉錄實時熒光定量PCR分析

1.3.4.1引物設計

根據NCBI中發布的IL-6、IL-8、IP-10等基因的序列，通過Primer Express軟件設計特異性引物，同時設計管家基因β-actin的特異性引物，各基因的引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table1 Primer sequences for qRT-PCR

1.3.4.2 反轉錄實時熒光定量PCR反應

以cDNA為模板，按照表2配制RT-qPCR反應體系（使用前，在1 mL PrimeScriptRTEnzyme MIX中加入40μL的ROX Reference Dye），用ddH2O將反應體系補足到20μL，分析IL-6、IL-8、IP-10等基因的表達量。

表2 反轉錄實時熒光定量PCR反應體系Table2 Real time fluorescence quantitative reverse transcription PCRTable2 Real time f reaction system stem

2 結果與分析

2.1 HaCaT細胞培養

圖1為HaCaT細胞培養貼壁前后形態比較，貼壁前HaCaT細胞為規則的圓球體狀，透明飽滿，且可隨培養液流動。當培養2～4 h以后，HaCaT細胞開始呈現出片層狀態貼壁生長，單個細胞形態不規則，其形態會因其所處培養空間大小的具體情況不同而變化；另一方面，隨著培養液中營養物質的消耗和HaCaT細胞自身生長過程中代謝物的產生，培養液的顏色（隨pH值變化）和細胞中內容物的顏色也與貼壁前的HaCaT細胞有了顯著的差別。這就決定了一定時間內需要根據培養瓶或者培養板中HaCaT細胞生長的具體情況，而定期換新鮮培養液或者進行傳代培養，才能保證HaCaT細胞良好的生長狀態。

圖1 HaCaT細胞培養貼壁前（a）后（b）的形態（20×）Fig.1 HaCaT cells before (a) and after (b) attached culture (20 ×)

HaCaT細胞對生長環境的要求相對其他動物細胞較為寬泛。HaCaT細胞增殖速率快，培養2～4 h即可貼壁，36 h左右需要進行傳代。細胞快速地增殖會引起培養液中營養物質在短時間內被大量消耗，限制了細胞進一步生長。因此，在考察藍莓葉總黃酮對HaCaT細胞的影響時，培養時間不宜過長。綜合考慮，本實驗中選取培養時間分別為0、15、30、60、90、120 min，在以上6個時間點對添加藍莓葉總黃酮的HaCaT細胞生長狀況進行考察。

2.2 HaCaT細胞總RNA的提取

圖2 HaCaT細胞總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結果Fig.2 Electrophoresis of total RNA from HaCaT cells

采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對提取的HaCaT細胞RNA進行完整性檢測。如圖2所示，28S rRNA與18S rRNA帶型清晰。另經紫外分光光度計測定，所提取HaCaT細胞RNA的A260nm/A280nm介于1.8～2.0之間，RNA質量高，完整性好，適于反轉錄實時熒光定量PCR研究[8]。

嚴格來說，以拉斐爾前派畫家之名而為人所熟知的羅塞蒂的拉斐爾前派創作期，至此已經結束了。人們應該看到，在拉斐爾前派那原本就模糊不清的理想幻滅之后，羅塞蒂繪畫中的逃亡意識開始明確：他在相當長一段時間里都使用古老的水彩作畫，并專注于但丁與比阿特麗絲等中世紀題材。

2.3 RT-qPCR炎癥因子特異性引物的檢測

利用設計的β-actin、IL-6和IL-8的引物對目標產物進行檢測，結果如圖3所示。以反轉錄得到的cDNA為模板，通過設計的引物進行擴增，得到的產物利用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢驗，得到條帶單一的、片段大小與預期目的條帶大小一致的特異性引物，可進行下一步RT-qPCR的實驗。

圖3 炎癥因子IL-6、IL-8特異性引物檢測結果Fig.3 Electrophoresis of PCR amplified products with specific primers for β-actin, IL-6 and IL-8

2.4 RT-qPCR實驗結果

以HaCaT細胞為研究對象，考慮到其炎癥因子相關基因表達量變化的時間大多在2 h以內[9]，并且綜合HaCaT細胞生長情況，本實驗選擇2 h以內作為藍莓葉總黃酮處理HaCaT細胞的考察時間。

2.4.1藍莓葉總黃酮對HaCaT細胞炎癥因子類基因表達的影響

2.4.1.1藍莓葉總黃酮對HaCaT細胞IL-6表達的影響

圖4 藍莓葉總黃酮處理不同時間對HaCaT細胞IL--66表達量的影響Fig.4 Influence of treatment time with blueberry leaf extracts on IL-6 expression

2.4.1.2藍莓葉總黃酮對HaCaT細胞IL-8表達的影響

圖5 藍莓葉總黃酮處理不同時間對HaCaT細胞IL--88表達量的影響Fig.5 Influence of treatment time with blueberry leaf extracts on IL-8 expression

藍莓葉總黃酮對HaCaT細胞IL-8表達量的影響如圖5所示，培養時間在15 min內，HaCaT細胞IL-8表達量迅速下降，并在30 min內保持緩慢下降的趨勢，在30～90 min內又緩慢上升，但遠小于空白組，而在90～120 min的培養時間內，IL-8表達量又有下降趨勢。整體來看，藍莓葉總黃酮對IL-8基因表達的影響主要體現在培養0～15 min內迅速抑制其表達，并在120 min的培養時間內總體保持抑制其表達的作用。對不同時間段IL-8表達量進行分析，發現與空白組相比，培養至15、30 min時，HaCaT細胞IL-8表達量極顯著降低（P＜0.01），而培養至60～120 min時，IL-8表達量稍有回升，但仍顯著低于空白組（P＜0.05），這表明藍莓葉總黃酮對HaCaT細胞IL-8的表達具有抑制作用。IL-8在許多炎癥中具有聚集和激活T淋巴細胞、白細胞和血管內皮細胞的功能，局部產生的IL-8可以直接作用于表皮細胞，促進慢性炎癥的發展[11]。IL-8表達量的升高會使大量中性粒細胞向炎癥區域聚集，釋放炎癥介質而加重炎癥反應[12-13]。藍莓葉總黃酮抑制了IL-8的表達，從而間接地抑制了炎癥的發生和發展。

2.4.2藍莓葉總黃酮對HaCaT細胞趨化因子相關基因表達的影響

2.4.2.1藍莓葉總黃酮對HaCaT細胞CXCR-1和CXCR-2表達的影響

CXCR-1和CXCR-2是CXCR家族中的兩個重要成員，屬G蛋白偶聯受體超家族成員。CXCR-1和CXCR-2會表達在正常的人內皮細胞表面，在急性炎癥反應過程中，趨化因子能夠促進內皮細胞釋放大量促炎細胞因子[14]。

圖6 藍莓葉總黃酮處理不同時間對HaCaT細胞CXCR--11表達量的影響Fig.6 Influence of treatment time with blueberry leaf extracts on CXCR-1 expression

如圖6所示，添加藍莓葉總黃酮后，HaCaT細胞CXCR-1的表達量在培養15 min內有明顯升高的趨勢，隨后的培養過程中，CXCR-1的表達量被間隔性地促進和抑制，但總體水平都是高于空白組。對不同培養時間段HaCaT細胞CXCR-1表達量進行統計學分析，發現與空白組相比，在培養的120 min內，HaCaT細胞CXCR-1表達量的變化均不顯著（P＞0.05）。以上結果表明，藍莓葉總黃酮對HaCaT細胞CXCR-1的表達有一定促進作用，但在促進和抑制間存在一定的動態平衡。

圖7 藍莓葉總黃酮處理不同時間對HaCaT細胞CXCR--22表達量的影響Fig.7 Influence of treatment time with blueberry leaf extracts on CXCR-2 expression

如圖7所示，添加藍莓葉總黃酮后，HaCaT細胞CXCR-2的表達量在培養15 min內有平緩的升高，在隨后培養的15～90 min內，保持在較高的水平，而在培養的90～120 min內，CXCR-2的表達量顯著升高（P＜0.05）。以上結果表明，藍莓葉總黃酮對HaCaT細胞CXCR-2的表達是起促進作用的。

2.4.2.2藍莓葉總黃酮對HaCaT細胞IP-10表達的影響

圖8 藍莓葉總黃酮處理不同時間對HaCaT細胞IP-10表達量的影響Fig.8 Influence of treatment time by blueberry leaf extracts on IP-10 expression

如圖8所示，添加藍莓葉總黃酮后，HaCaT細胞IP-10表達量在培養15 min內迅速下降，并且在90 min的培養時間內保持在一個相當低的水平。雖然在培養至90～120 min內，HaCaT細胞IP-10表達量有一定的升高，但是與空白組相比仍是受到抑制的。經統計學分析發現，與空白組相比，培養至15、30 min時，HaCaT細胞IP-10表達量顯著降低（P＜0.05），而培養至60、90 min時，IP-10表達量極顯著降低（P＜0.01），到培養120 min時，IP-10表達量稍有回升，但仍顯著低于空白組（P＜0.05）。以上結果表明，藍莓葉總黃酮對IP-10基因的表達具有抑制作用。

3 結 論

炎癥因子（IL-6、IL-8）和趨化因子（CXCR-1和CXCR-2、IP-10）是反映炎癥反應的重要指標，在機體抗感染、抑病毒過程中起重要作用[15-16]。本實驗將藍莓葉總黃酮與HaCaT細胞共培養特定時間后，利用RT-qPCR檢測相關炎癥因子和趨化因子的表達情況。結果表明，藍莓葉總黃酮對IL-6和CXCR-2基因的表達具有正向調節的作用，二者的表達量顯著增加。其中，IL-6通過影響細胞內花生四烯酸的代謝而起到抗炎作用，CXCR-2通過與配體IL-8結合，啟動中性粒細胞趨化反應，募集中性粒細胞，引起炎癥反應，對入侵的病原體發揮吞噬殺傷和清除作用。IL-8和IP-10基因的表達受到了明顯抑制，表達量大幅度降低，進而抑制了炎癥的發生和發展。IP-10及其受體CXCR-3具有強大的招募中性粒細胞能力，可促進多種細胞因子的分泌，作為趨化因子介導Thl型炎癥反應[17-18]，藍莓葉總黃酮的添加抑制了HaCaT細胞中IP-10的表達，從而降低了炎癥反應發生的概率。而藍莓葉總黃酮對趨化因子CXCR-1的表達則呈現出復雜型調節的作用，表現為間歇性地促進和抑制，因此，藍莓葉總黃酮具體的抗炎作用效果還有待研究。

綜合來看，在炎癥反應中有諸多的炎癥因子和趨化因子參與到其中，這些因子之間相互作用，聯系緊密，網絡系統復雜多樣，所以其表達量的變化必然會相互影響[19-21]。整體來看，藍莓葉總黃酮的添加會促進抗炎因子的表達，抑制促炎因子的表達，從而發揮其抗炎作用。但是藍莓葉總黃酮的具體抗炎機理到目前為止還不是很清楚，有待進一步研究。本實驗利用RT-qPCR法對藍莓葉總黃酮的抗炎功效進行了初步評價，為保健品或藥食同源物質的體外抗炎評價提供了新思路。

[1] GERMOLEC D R, YOSHIDA T, GAIDO K, et al. Arsenic induces overexpression of growth factors in human keratinocytes[J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 1996, 141(1)∶ 308-318.

[2] WEISFELNER M E, GOTTLIEB A B. The role of apoptosis in human epidermal keratinocytes[J]. Journal of Drugs in Dermatology, 2003, 2(4)∶ 385-391.

[3] 魏晶, 李偉, 邵萬平, 等. CXCR1/CXCR2拮抗劑G31P抗中性粒細胞介導的炎癥作用研究[J]. 中華微生物學和免疫學雜志, 2010(5)∶483-486.

[4] GRAS D, TIERS L, VACHIER I, et al. Regulation of CXCR/IL-8 in human airway epithelial cells[J]. International Archives of Allergy and Immunology, 2009, 152(2)∶ 140-150.

[5] HASHIZUME M, HIGUCHI Y, UCHIYAMA Y, et al. IL-6 plays an essential role in neutrophilia under inflammation[J]. Cytokine, 2011, 54(1)∶ 92-99.

[6] 蔣艷玲, 趙明, 梁功平, 等. 1,25-二羥維生素D3對HaCaT細胞增殖活性及基因組DNA和增殖相關基因啟動子甲基化水平的影響[J]. 中華皮膚科雜志, 2013, 46(12)∶ 885-888.

[7] 楊井, 陶娟, 李延, 等. 缺氧對HaCaT細胞HIF-1α, GLUT-1表達的影響及與細胞增殖的關系[J]. 中國皮膚性病學雜志, 2009, 23(10)∶621-623.

[8] 湯三妹, 楊娟, 周秋蓮, 等. 獼猴桃RNA提取與RT-PCR[J]. 生物技術通報, 2006(5)∶ 67-71.

[9] 吳德全. IL-15調控HaCaT細胞增殖及分化的研究[D]. 合肥∶ 安徽醫科大學, 2012∶ 14-36.

[10] TCHERAKIAN C, RIVAUD E, CATHERINOT E, et al. Pulmonary arterial hypertension related to HIV∶ is inflammation related to IL-6 the cornerstone?[J]. Revue de Pneumologie Clinique, 2011, 67(4)∶250-257.

[11] 許樹長, 陳瑩, 王鋒, 等. IL-8及CXCR-1在反流性食管炎患者食管黏膜中的表達及意義[J]. 同濟大學學報∶ 醫學版, 2007, 28(5)∶ 51-54.

[12] FITZGERALD R C, ONWUEGBUSI B A, BAJAJ-ELLIOTT M, et al. Diversity in the oesophageal phenotypic response to gastrooesophageal reflux∶ immunological determinants[J]. Gut, 2002, 50(4)∶451-459.

[13] ISOMOTO H, WANG A, MIZUTA Y, et al. Elevated levels of chemokines in esophageal mucosa of patients with reflux esophagitis[J]. The American Journal of Gastroenterology, 2003, 98(3)∶ 551-556.

[14] AKCAY A, NGUYEN Q, EDELSTEIN C L. Mediators of inflammation in acute kidney injury[J]. Mediators of Inflammation, 2009. doi∶ 10.1155/2009/137072.

[15] 張如峰, 楊桂文, 安利國. 趨化因子及其受體在炎癥中作用的研究進展[J]. 國際免疫學雜志, 2012, 35(3)∶ 191-196.

[16] 邢艷玲. IP-10對變應性接觸性皮炎小鼠細胞因子表達影響的研究[D].天津∶ 天津醫科大學, 2009∶ 15-31.

[17] FUENTE M, MIQUEL J. An update of the oxidation-inflammation theory of aging∶ the involvement of the immune system in oxiinflamm-aging [J]. Current Pharmaceutical Design, 2009, 15(26)∶3003-3026.

[18] 夏世金, 沈自尹, 董競成. 老年大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸炎性衰老相關基因表達特征[J]. 老年醫學與保健, 2009, 15(1)∶ 7-9.

[19] 鄭梅竹. 羅布麻葉總黃酮抗抑郁作用及其機制研究[D]. 長春∶ 吉林大學, 2011∶ 40-106.

[20] SASAKI M, IKEDA H, SATO Y, et al. Proinflammatory cytokineinduced cellular senescence of biliary epithelial cells is mediated via oxidative stress and activation of ATM pathway∶ a culture study[J]. Free Radical Research, 2008, 42(7)∶ 625-632.

[21] BARTEK J, HODNY Z, LUKAS J. Cytokine loops driving senescence[J]. Nature Cell Biology, 2008, 10(8)∶ 887-889.

In vitro Anti-inflammatory Effect of Total Flavonoids from Blueberry Leaves

ZHAO Dan1, SU Ning2, YANG Li2, ZHENG Hongyan2, HUO Tong1, WANG Changtao1,*
(1. School of Science, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; 2. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100176, China)

Purpose∶ To evaluate thein vitroanti-inflammatory potential of total flavonoids from blueberry leaves. Methods∶a co-culture system of HaCaT cell and flavonoids were constructed. To examine the effect of flavonoids on the expression of inflammatory cytokines including interleukin 6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8), and interferon induced protein 10 (IP-10), realtime reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) was used to detect the expression of the related genes after co-culture for different periods of time(0, 15, 30, 60, and 120 min). The anti-inflammatory mechanism of flavonoids from blueberry leaves was analyzed at the molecular level. Results∶ The total flavonoids from blueberry leaves significantly enhanced the expression of anti-inflammatory cytokines (IL-6andCXCR-2) (P＜ 0.05) and significantly inhibited the expression of pro-inflammatory cytokines (IL-8,IP-10) (P＜ 0.05) to achieve the anti-inflammatory activity. Chemotactic factor receptorCXCR-1was regulated complicatedly. Conclusions∶ The total flavonoids from blueberry leaves could decrease inflammation by regulating the function of several gene loci via several steps.

total flavonoids from blueberry leaves; inflammatory cytokines; real-time reverse transcription PCR; anti-inflammatory

R966

1002-6630（2015）17-0231-05

10.7506/spkx1002-6630-201517043

2014-11-05

國家質檢總局質檢公益性行業科研專項（201310132；201410019）

趙丹（1988—），女，助理實驗師，碩士，研究方向為生物技術。E-mail：zhaodanustb@126.com

*通信作者：王昌濤（1975—），男，教授，博士，研究方向為植物功效成分開發應用。E-mail：wangct@th.btbu.edu.cn