豬肝乙醇脫氫酶的分離純化及部分性質(zhì)

傅 婷，王 丹，萬 驥，唐云明*

豬肝乙醇脫氫酶的分離純化及部分性質(zhì)

傅 婷，王 丹，萬 驥，唐云明*

（西南大學生命科學學院，重慶市甘薯工程研究中心，三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶 400715）

新鮮豬肝經(jīng)勻漿、緩沖液抽提、硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sepharose離子交換層析及Superdex-200凝膠過濾層析，獲得電泳純的乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）。純化結(jié)果顯示：該酶比活力為1 622.33 U/mg，回收率為29.05%，純化倍數(shù)為34.58；該酶分子質(zhì)量約為171.79 kD，亞基分子質(zhì)量約為43.68 kD。ADH酶學性質(zhì)研究顯示：最適反應溫度和pH值分別為45 ℃和10.0；在25～45 ℃及pH 7.5～9.0范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好；最適條件下測得該酶對乙醇的Km值為19 mmol/L；正丁醇、氯仿、異丙醇、十二烷基硫酸鈉、草酸、Zn2+、Cu2+、Ag+對該酶的抑制作用最強，Mg2+對該酶有激活作用，EDTA對該酶有雙重作用。

豬肝；乙醇脫氫酶；分離純化；酶學性質(zhì)

乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）廣泛存在于人和哺乳動物的肝臟、植物組織及微生物中，是生物體內(nèi)重要的氧化還原催化劑之一，作為生物體內(nèi)主要短鏈醇代謝的關(guān)鍵酶，其在很多生理過程中起著重要作用[1-6]。該酶廣泛應用于臨床、化工及食品等領(lǐng)域[7-9]。國內(nèi)市場上的ADH產(chǎn)品幾乎都來源于釀酒酵母，因其來源單一、且高純度ADH價格昂貴，所以尋求來源廣泛、純度高、成本低廉的ADH在理論和實踐方面均具有十分重要的意義。目前國內(nèi)外研究人員已對多種來源的ADH進行了相關(guān)研究[10-12]，但尚未見豬肝ADH的相關(guān)報道。本實驗以價廉易得的豬肝為原材料提取ADH并對其部分酶學性質(zhì)進行研究，旨在為ADH的獲得提供一條新途徑，更為以后對ADH的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮豬肝 重慶市北碚區(qū)永輝超市。

考馬斯亮藍R-250、三羥甲基氨基甲烷 美國Bio-Rad公司；DEAE-Sepharose、蛋白質(zhì)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）標準品及Superdex-200凝膠層析分子質(zhì)量標準品 美國GE Healthcare公司；甲叉-雙丙烯酰胺、丙烯酰胺 瑞士Fluka公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

UV-2550型分光光度計、蛋白核酸定量儀 日本島津公司；MC4L冷凍干燥機 德國Uni Equip公司；Mill-Q plus超純水儀 美國Millipore公司；pHS-32W微電路pH計 上海理達儀器廠；精密電子天平 瑞士Mettler-Toledo公司；GL-21M高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；AKTA prime plus蛋白質(zhì)純化系統(tǒng) 美國GE公司；垂直板電泳槽和電泳儀 美國Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1豬肝ADH粗酶液的制備

將新鮮豬肝去除結(jié)締組織和脂肪，稱取50 g，用剪刀剪碎后按1∶4的比例加入預冷的Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）中，勻漿后放于4℃冰箱中靜置抽提2 h，離心30 min（12 000 r/min，4℃）后所得上清液即為粗酶液。

1.3.2硫酸銨分級沉淀

向粗酶液中加入硫酸銨粉末至30%飽和度，4℃條件下鹽析2 h，4℃、12 000 r/min離心30 min，棄沉淀收集上清液；往上清液中加入硫酸銨粉末至70%飽和度，4℃鹽析1.5 h，4℃、12 000 r/min離心30 min，棄上清收集沉淀；將沉淀用0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）溶解，再用10 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）作透析液，于4℃冰箱中透析24 h后，即得初酶液。

1.3.3 DEAE-Sepharose離子交換層析

DEAE-Sepharose離子交換層析柱用50 mmol/L、pH 8.0的Tris-HCl緩沖液（含1 mmol/L二硫蘇糖醇）平衡好后，取8 mL初酶液上柱，用0～0.5 mol/L的NaCl溶液（用50 mmol/L、pH 8.0的Tris-HCl緩沖液配制）進行線性梯度洗脫，流速0.5 mL/min，每管收集5 mL；測定各管ADH活力和蛋白質(zhì)含量，收集活性較高的酶液，透析并冷凍干燥后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 Superdex-200凝膠過濾層析

Superdex-200層析柱用50 mmol/L、pH 8.0的Tris-HCl緩沖液（含1 mmol/L二硫蘇糖醇）平衡后，取在1.3.3節(jié)中收集的干燥后的樣品，用雙蒸水溶解后取3 mL上柱，用50 mmol/L、pH 8.0的Tris-HCl緩沖液（含1 mmol/L二硫蘇糖醇）緩沖液洗脫，流速0.3 mL/min，每管收集3 mL；測定各管ADH活力和蛋白含量；收集活性較高的幾管酶液，4℃超純水透析脫鹽24 h，冷凍干燥后得到ADH純品，并于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5酶活力的測定

參照文獻[13]方法（稍作改動）進行測定：ADH在催化乙醇轉(zhuǎn)化為乙醛的同時，將輔酶NAD+還原成NADH，而NAD+和NADH各在260、340 nm波長處有最大吸收峰，因此以NAD+為輔酶的脫氫酶都可以通過測定340 nm吸光度的變化，定量測定酶的活力。本實驗測酶體系包括：3 mL緩沖液（0.1 mol/L、pH 8.0的Tris-HCl）、0.4 mL 0.2 mol/L的乙醇、0.1 mL 4.5 mmol/LNAD+、80μL酶液。酶活力單位定義為：將A340nm在25℃、1 min內(nèi)每變化0.001定義為一個活力單位（U）。

1.3.6豬肝ADH純度鑒定及分子質(zhì)量測定

通過SDS-PAGE法對1.3.4節(jié)中獲得的酶活力較高管ADH進行純度鑒定及亞基分子質(zhì)量的測定，制備質(zhì)量分數(shù)分別為5%的濃縮膠和12%的分離膠，上樣量為10μL，經(jīng)SDS-PAGE法測定ADH亞基分子質(zhì)量。用凝膠層析法測定ADH全分子質(zhì)量[14]。

1.3.7蛋白質(zhì)含量的測定

采用紫外分光光度法與考馬斯亮藍（Bradford）法測定[14]。

1.3.8豬肝ADH部分酶學性質(zhì)

1.3.8.1 ADH的最適溫度和熱穩(wěn)定性

在pH 8.0條件下、不同溫度（25～80℃）下測定ADH的酶活力，將酶活力最高值記為100%，計算各溫度下的相對酶活力，以確定其最適反應溫度。將酶液分別置于不同溫度（25～75℃）下保溫不同的時間后，測定ADH的酶活力，將不保溫時測得的酶活力記為100%，計算溫育不同時間下的相對酶活力，以研究該酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.8.2 ADH的最適pH值和pH值穩(wěn)定性

在45℃，不同pH值（4.0～10.6）的緩沖體系中測定ADH的酶活力，將酶活力最高值記為100%，計算各pH值條件下的相對酶活力，以確定其最適反應pH值。將酶液分別置于不同pH值的緩沖液中孵育2 h后分別測定其酶活力，將酶活力最高值記為100%，計算各不同pH值緩沖液孵育后酶液的相對活力，以研究該酶的pH值穩(wěn)定性。

1.3.8.3 ADH米氏常數(shù)（Km）的測定

采用雙倒數(shù)作圖法[15]（Lineweaver-Burk法），以不同濃度（10～100 mmol/L）的乙醇作為底物，在45℃、pH 10.0最適反應條件下測定豬肝ADH的酶活力，求出豬肝ADH的Km值。

1.3.8.4不同有機溶劑對ADH活性的影響

將ADH酶液分別與等體積的不同體積分數(shù)的氯仿、甲醇、異丙醇、正丁醇混合并在常溫下孵育20 min后，分別在最適反應條件（45℃、pH 10.0）下測酶活力，將等體積雙蒸水稀釋后酶液的活力記為100%，計算ADH的相對酶活力。

1.3.8.5不同化合物對ADH活性的影響

將ADH酶液分別與等體積的不同濃度的抗壞血酸、草酸、尿素、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、SDS混合并在常溫下孵育20 min后，分別在最適反應條件（45℃、pH 10.0）下測酶活力，將等體積雙蒸水稀釋后酶液的活力記為100%，計算ADH的相對酶活力。

1.3.8.6部分金屬離子對ADH活性的影響

將ADH酶液分別與等體積不同濃度的金屬離子（Zn2+、K+、Co2+、Mg2+、Ag+、Ca2+、Cu2+、Fe3+、Mn2+）混合，在常溫下孵育20 min后，分別在最適反應條件（45℃、pH 10.0）下測酶活力，將等體積雙蒸水稀釋后酶液的活力記為100%，計算ADH的相對酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1豬肝ADH的分離純化

豬肝ADH初酶液經(jīng)DEAE-Sepharose離子交換層析后結(jié)果如圖1所示，該酶活力峰主要集中在10～18管，其中第14管酶活力最高，收集酶活性較高管的酶液，冷凍干燥后用于凝膠過濾層析，經(jīng)Superdex-200凝膠層析，洗脫圖譜如圖2所示，酶活性峰主要集中在27～35管，其中第31管為酶活力最高峰，收集第31管酶液，用雙蒸水透析24 h后冷凍干燥，通過SDS-PAGE電泳，顯示為單一條帶（圖3），說明該酶經(jīng)純化后達到了電泳純。該酶的整個分離純化結(jié)果如表1所示，最終得到豬肝ADH的回收率為29.05%，純化倍數(shù)為34.58，酶比活力為1 622.33 U/mg。

圖1 豬肝ADH的DEAE-Sepharose層析圖譜Fig.1 DEAE-Sepharose chromatography of ADH from pig liver

圖2 豬肝ADH的Superdex-200層析圖譜Fig.2 Superdex-200 chromatography of ADH from pig liver

表1 豬肝ADH的純化結(jié)果Table1 Purification of ADH from pig liver

2.2 豬肝ADH的純度鑒定及分子質(zhì)量

純化后的ADH經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示為單一條帶（圖3），測得ADH亞基分子質(zhì)量約為43.68 kD；用Superdex-200凝膠過濾層析測得全酶的分子質(zhì)量為171.79 kD（圖4），由此可以推斷該酶由4個相同的亞基組成。

圖3 豬肝ADH的SDS-PAGE圖譜Fig.3 SDS-PAGE of ADH from pig liv er

圖4 Superdex-200凝膠過濾層析測得的豬肝ADH分子質(zhì)量Fig.4 Molecular weight estimation of ADH from pig liver by Superdex-200 gel filtration chromatography

2.3豬肝ADH的酶學性質(zhì)

2.3.1 ADH的最適溫度和熱穩(wěn)定性

圖5 溫度對豬肝ADH活力的影響Fig.5 Effect of temperature on the activity of ADH from pig liver

最適溫度的實驗結(jié)果如圖5所示，25～45℃時，酶活力隨溫度升高而增加，當溫度高于45℃酶活力隨溫度升高而下降，因此該酶最適溫度為45℃，其溫度作用范圍廣，在80℃條件下其相對酶活力仍保持在55.4%。溫度穩(wěn)定性的實驗結(jié)果如圖6所示，ADH在25～45℃范圍內(nèi)熱穩(wěn)定性較好，保溫3 h后其相對酶活力也分別保持在99.2%、98.2%和86.2%；超過55℃保溫后酶活力迅速下降，在65℃保溫2 h酶活力完全消失，75℃保溫1 h酶活力完全消失。

圖6 豬肝ADH的熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermal stability of ADH from pig liver

2.3.2 ADH的最適pH值和pH值穩(wěn)定性

圖7 pH值對豬肝ADH活力的影響Fig.7 Effect of pH on the activity of ADH from pig liver

如圖7所示，該酶在pH 10.0時有最大活力，在pH 7.5時其相對酶活力達到95.5%。pH值穩(wěn)定性實驗結(jié)果如圖8所示，純化后的酶液在pH 7.5～9.0條件下孵育2 h后，酶活力均保持在較高水平（75%以上）；pH值小于7.0的酸性條件或pH值大于9.0的堿性條件下保存2 h其酶活力迅速下降。

圖8 豬肝ADH的pH值穩(wěn)定性Fig.8 pH Stability of ADH from pig liver

2.3.3 ADH的米氏常數(shù)（Km）

在45℃，pH 10.0條件下以不同濃度的乙醇作為底物，測定該酶活力，并采用雙倒數(shù)作圖法求得ADH的米氏常數(shù)，結(jié)果如圖9所示，其Km值為19 mmol/L。

圖9 雙倒數(shù)法測定豬肝ADH的米氏常數(shù)圖Fig.9 Kmdetermination of ADH from pig liver by Lineweaver-Burk plot

2.3.4不同有機溶劑對ADH活性的影響

圖10 氯仿、異丙醇、甲醇、正丁醇對豬肝ADH活力的影響Fig.10 Effects of chloroform, isopropyl alcohol, methanol andn-butanol on the activity of ADH from pig liver

如圖10所示，氯仿、異丙醇、甲醇、正丁醇4種有機溶劑對該酶均有較強的抑制作用，且隨著有機溶劑體積分數(shù)越大其抑制作用越強，其中正丁醇對該酶抑制作用最為強烈，當體積分數(shù)達到20%時該酶活性完全喪失。

2.3.5不同化合物對ADH活性的影響

由圖11a可知，SDS對該酶有很強的抑制作用，當濃度達到3 mmol/L時，酶幾乎完全失活；EDTA對該酶活性的影響具有雙重作用，低濃度時對該酶有一定的激活作用，當其濃度大于10 mmol/L時對該酶有一定的抑制作用；草酸和尿素對該酶具有抑制作用，且此作用會隨著化合物濃度增高而增強；抗壞血酸對該酶的影響最小（圖11b）。

圖11 不同化合物對豬肝ADH活力的影響Fig.11 Effect of various compounds on the activity of ADH from pig liver

2.3.6部分金屬離子對豬肝ADH活性的影響

通過實驗發(fā)現(xiàn)，Ca2+、Mn2+、K+（圖12a、12c）對該酶的活力影響不大；Mg2+對該酶有一定的激活作用（圖12a）；Zn2+、Ag+、Cu2+、Fe3+、Co2+對該酶均有不同程度的抑制作用，其中Zn2+抑制作用最強，當其濃度達到0.4 mmol/L時酶活力已完全喪失，Ag+和Cu2+濃度達到0.5 mmol/L時該酶也徹底失活。

圖12 不同金屬離子對豬肝ADH活力的影響Fig.12 Effect of metal ions on the activity of ADH from pig liver

3 討 論

本實驗以豬肝為原材料，經(jīng)分離純化得到了電泳純的ADH，利用此方法分離純化ADH相較于已有研究具有以下優(yōu)勢：豬肝廉價易得、一年四季均可取材、純化步驟簡單、實驗周期短、其回收率和純化倍數(shù)高。相較于兔肝ADH[16]，本實驗減少了DEAE-纖維素除雜蛋白及超濾步驟，但仍獲得了電泳純的ADH。

豬肝ADH最適溫度為45℃，與柿果實[17]和醋酸桿菌[18]一致，高于釀酒酵母（37℃）[19]低于硬質(zhì)小麥[20]（50℃）。該酶在80℃時相對酶活力為55.4%，相比于柿果實（60℃，完全失活）、蠶豆[21]（70℃，完全失活）、釀酒酵母[19]（45℃，活性急劇下降），其溫度作用范圍廣。該酶在25～45℃條件下最為穩(wěn)定，較醋酸桿菌（20～30℃）、釀酒酵母 （30～40℃），該酶熱穩(wěn)定性范圍較大，較耐熱。

pH 10.0時豬肝ADH活性最高，這與多數(shù)豆類[21]一致，與人血清ADH[22]（pH 9.0）接近，較蓮霧[24]（pH 11.0）低，比蠶豆[21]（pH 8.7）高。該酶在pH 7.5和10.0均出現(xiàn)酶活峰，這與兔肝（pH 10.8和7.5）、松鼠猴（pH 10.8和8.2）類似。ADH的最適pH值不同可能與材料來源不同相關(guān)，如植物ADH的最適pH值多偏堿性，很多微生物如草莓中提取的扭脫甲基桿菌、葡萄桿菌[26]和醋酸桿菌[27]ADH的最適pH值均出現(xiàn)在酸性區(qū)域。

豬肝ADH亞基分子質(zhì)量約為43.68 kD，與馬肝[28]（44 kD）類似，高于棲熱菌[29]（37.5 kD）、黃桿菌[30]（40 kD）、酒類酒球菌[31]（35 kD）。該酶對底物乙醇的Km值為19 mmol/L，與柿果實（8.33 mmol/L）、兔肝（3.0 mmol/L）、人血清[22]（3.03 mmol/L）、釀酒酵母（4.5 mmol/L）相比有較大差異，說明不同材料、不同組織來源的乙醇脫氫酶對底物的親和力不同，可能是因為生物體為了能更好地適應環(huán)境，滿足生長代謝的需求而表現(xiàn)出的生物特異性，這是生物體基因不斷進化并選擇性表達的結(jié)果[32]。

氯仿、異丙醇、甲醇、正丁醇均對該酶有抑制作用，可能原因如下：酶在有機溶劑環(huán)境中受到了擴散限制和立體障礙，使得酶與底物接觸受到限制；該酶在有機溶劑中的構(gòu)象發(fā)生了變化，酶只有當其分子本身具有一定構(gòu)象時才有一定的催化活性，有機溶劑缺乏提供多種氫鍵的能力，而且由于它們的低介電常數(shù)往往會導致蛋白質(zhì)帶電基團之間更強的靜電作用，使蛋白質(zhì)的“剛性”更強，使其活性降低[33]。

不同金屬離子對ADH活性影響有很大差異，Ca2+、Mn2+、K+對該酶活力影響不大；Zn2+、Ag+、Cu2+、Fe3+、Co2+對該酶均有不同程度的抑制作用，這與大多數(shù)文獻的相關(guān)報道結(jié)果類似[23-24]，其中Zn2+、Ag+和Cu2+在低濃度下即可使酶完全失活，據(jù)悉此3種離子可與硫醇發(fā)生反應生成硫醇鹽[34]，可能正是這一結(jié)構(gòu)的變化影響了酶活性中心構(gòu)象，導致酶失活；Mg2+對該酶有一定的激活作用，這與米根霉[35]和啤酒廢酵母中Mg2+對該酶的抑制作用不同，這說明同種金屬離子對不同來源的同一種酶的活性會產(chǎn)生不同的效應。

自1937年首次分離出乙醇脫氫酶以來，國內(nèi)外對該酶的研究從未間斷，對于多種來源的ADH的研究也已深入到分子水平，通過以上對于不同來源的ADH的各個性質(zhì)進行比較，了解到不同來源的酶具有不同的生化性質(zhì)，由此決定了其不同的實際用途。因此為了更好的開發(fā)和利用豬肝ADH，還有待在分子水平上對其進行深入研究。

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Isolation, Purification and Partial Characterization of Alcohol Dehydrogenase from Pig Liver

FU Ting, WANG Dan, WAN Ji, TANG Yunming*
(Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, Chongqing Sweetpotato Engineering Research Center, School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Electrophoresis-purity alcohol dehydrogenase (ADH) from pig liver was obtain ed through homogenization, buffer extraction, ammonium sulfate fractionation, DEAE-Sepharose ion-exchange chromatography and Superdex-200 gel fi ltration chromatography. Results showed that the specifi c activity of the purifi ed ADH was 1 622.33 U/mg with an activity recovery of 29.05% and a purifi cation fold of 34.58. The relative molecular weight of the ADH was approximately 171.79 kD, in which the subunit molecular mass was roughly 43.68 kD. The enzymatic properties showed that the optimum temperature and pH for the ADH were 45℃and 10.0, respectively. The enzyme was stable at 25–45℃and pH 7.5–9.0, and its apparentKmtowards ethanol was 19 mmol/L. The enzyme activity of ADH could be strongly inhibited byn-butanol, chloroform, isopropanol, sodium dodecyl sulfate, oxalic acid, Zn2+, Cu2+, and Ag+, and activated by Mg2+. EDTA had a dual effect on this enzyme.

pig liver; alcohol dehydrogenase; isolation and purification; enzymatic properties

Q946.5

1002-6630（2015）17-0179-06

10.7506/spkx1002-6630-201517034

2014-09-04

重慶市科委重點攻關(guān)項目（CSTC，2011AB1027）

傅婷（1990—），女，碩士研究生，主要從事蛋白質(zhì)與酶工程研究。E-mail：futing3526@126.com

*通信作者：唐云明（1960—），男，教授，博士，主要從事蛋白質(zhì)與酶工程研究。E-mail：tbright@swu.edu.cn