粗壯脈紋孢菌原生質體的制備、再生及轉化的條件

楊建遠，李 靜，范亞葦，張炳火，鄧澤元,*

（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.九江學院藥學與生命科學學院，江西 九江 332000）

粗壯脈紋孢菌原生質體的制備、再生及轉化的條件

楊建遠1,2，李 靜1，范亞葦1，張炳火2，鄧澤元1,*

（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.九江學院藥學與生命科學學院，江西 九江 332000）

為建立原生質體介導的粗壯 脈紋孢菌遺傳轉化系統，本研究 主要考察了復合酶解液、菌齡及酶解時間對粗壯脈紋胞菌原生質體生成及再生的影響。結果表明，粗壯脈紋胞菌孢子懸液接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose ag ar，PDA）液體培養基中，30℃條件下搖床培養10 h的菌絲，采用0.5 g/100 mL蝸牛酶+0.5 g/100 mL溶壁酶+1 g/100 mL纖維素酶的復合酶解液、30℃條件下酶解10 h，粗壯脈紋胞菌原生質體生成及再生最為適合。在此條件下，原生質體生成數可達4.53×106個，38#再生培養基中的再生數可達1.41×106個，再生率達31.71%，聚乙二醇介導PAKHB載體轉化NC原生質體，每微克質粒可獲得8個以上的轉化子。

粗壯脈紋孢菌；原生質體；制備；再生；轉化

粗壯脈紋孢菌（Neurospora crassa，NC）是子囊菌門（Ascomycoya），子囊菌綱（Ascomycetes），糞殼目（Sordariales），糞殼科（Sordariaceae），脈胞菌屬（Neurospora）的真菌，是纖維素復合酶系產量較高的菌種之一[1]。本實驗室從江西省的傳統小吃豆扎清中分離到的粗壯脈紋胞菌（編號NC-l-6），具有較高的產纖維素酶及類胡蘿卜素活性[2-4]。近年來，以絲狀真菌為轉化系統的遺傳改造工程是研究熱點之一。粗壯脈紋胞菌作為一種模式菌種，全基因組序列已經測完，因其自身的諸多特點在分子遺傳機制研究、生理生化途徑研究、工業產品發酵研究等領域均發揮著重要的作用[5]，因此，粗壯脈孢菌功能基因的遺傳改造相關研究將具有廣闊的前景。

原生質體是真菌生理及遺傳研究的重要工具，在真菌的遺傳重組及微生物菌株的進化方面具有重要的貢獻[6-7]。原生質體的融合和轉化系統一定程度上依賴于原生質體制備數量和質量[8]。真菌原生質體的制備和再生條件受較多因素的影響[9]，不同菌種之間差別較大，同一菌種也受菌齡、酶的種類及各種實驗條件變化而變化。然而，國內外鮮見有較詳細的粗壯脈紋胞菌原生質體制備條件研究的報道。本研究以粗壯脈紋胞菌菌株（NC-1-6）為對象，考察了其原生質體制備、再生及轉化條件，為進一步對其進行功能基因的遺傳改造奠定基礎。

1 材料與方法

1.1菌株、質粒、試劑和溶液的配制

粗壯脈紋胞菌（NC-l-6），由南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室分離保存；同源重組質粒pUC18-APpki-php-B（含潮霉素B基因，簡稱為PAKHB），由南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室構建。

溶壁酶、纖維素酶 美國Sigma公司；蝸牛酶、潮霉素B、山梨醇和PEG 4000生工生物工程（上海）股份有限公司。

孢子洗液：9 g/L NaCl、0.5 g/L吐溫-80。

酶解液：采用pH 6.0的10 mmol/L磷酸鹽緩沖液配制成含0.6 mol/L MgSO4的不同復合酶，蝸牛酶質量濃度為0.5 g/100 mL（A）、溶壁酶質量濃度為0.5 g/100 mL（B）、纖維素酶質量濃度為1.0 g/100 mL（C）。

STC溶液：50 mmol/L CaCl2、1.0 mol/L山梨醇、50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）。

PTC溶液：50 mmol/L CaCl2、40 g/100 mL聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）4000、50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）。

TB3溶液：酵母粉3 g、胰蛋白胨3 g、蔗糖200 g，加蒸餾水至1 L，滅菌備用。

1.2方法

1.2.1粗壯脈紋孢菌孢子懸液的制備

將馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA）斜面保存的粗壯脈紋孢菌孢子，接種到沙氏固體斜面培養基中，30℃靜置培養1 d，將NC菌落轉接到沙氏固體培養基中，30℃條件下靜置培養5～10 d。用孢子洗液輕輕將孢子洗下，400目濾器過濾，收集孢子懸液。經血球計數板計數，其濃度約為8×106個/mL，分裝為10 mL每管，-20℃凍存。

1.2.2粗壯脈紋孢菌菌絲體的培養

將10 mL粗壯脈紋孢菌孢子懸液50℃熱激90 s，接種到50 mL PDA液體培養基中，30℃、180 r/min，搖床培養6～14 h，用滅菌的400目濾器過濾，收集菌絲體，并用0.6 mol/L MgSO4沖洗2～3次，用無菌濾紙吸干表面的水分，備用。

1.2.3粗壯脈紋孢菌原生質體的制備

[10-11]方法略作修改，稱取0.25 g上述濕菌絲體，放入裝有5 mL的復合酶解液的50 mL離心管中，于30℃、80 r/min，搖床酶解6～14 h后，用5 mL酶解緩沖液稀釋吹散，經滅菌的4層擦鏡紙過濾，濾液于10 mL離心管中，4℃、3 000 r/min離心10 min，棄上清，用2 mL預冷的1.0 mol/L山梨醇溶液重懸洗滌2次，4℃、2 000 r/min離心10 min；用1 mL預冷的1.0 mol/L山梨醇溶液重懸，經血球計數板計數，冰浴備用。原生質體制備數（X）的計算見下式。

式中：A為重懸液原生質體含量/（個/mL）；V為重懸原生質總體積/mL。

1.2.4粗壯脈紋孢菌原生質體的觀察

當考察時間對原生質體生成的影響因素時，取酶解6、8、10、12、14 h的酶解產物各20 μL于載玻片上，浮游生物 計數儀下觀察原生質體的生成狀況。

1.2.5粗壯脈紋孢菌原生質體的再生

取上述50 μL原生質體懸液以預冷的1.0 mol/L山梨醇溶液稀釋成約102個/mL，同時取50 μL原生質體懸液以滅菌蒸餾水稀釋相同倍數作對照，以消除菌絲片段產生的誤差。分別取200 μL涂布于38#固體再生平板上，30℃條件培養至剛長出菌絲時，即開始觀察標記。原生質體再生數（Y）計算公式如下。

式中：C為平板菌落平均數/個；D為對照平板菌落平均數/個；K為稀釋倍數；V1為重懸原生質總體積/mL；V2為原生質涂布用的體積/mL。

原生質體再生率（Z）計算公式為：

1.2.6 PEG介導的粗壯脈紋孢菌原生質體轉化

轉化方法參考文獻[12-13]略作修改，4℃、2 000 r/min離心備用的原生質體，用預冷的STC溶液調整原生質體數大于1×107個/mL，取粗壯脈紋孢菌原生質體100μL加入到含20μL（約3μg）PAKHB載體（含潮霉素B抗性基因）和50μLPTC溶液的10 mL離心管中，輕輕混勻后冰浴30 min，再加入900μLPTC溶液，室溫靜置20～30 min，再加入4 mL TB3溶液，30℃條件下靜置30～60 min，1 500 r/min離心5 min，吸去4 mL上清后，取200μL涂布在含有200μg/mL潮霉素B的PDA再生培養基上，30℃靜置培養1～2 d，觀察轉化子生長情況。

2 結果與分析

2.1復合酶解液對粗壯脈紋孢菌原生質體制備及再生的影響

分別以5 mL含A+B、A+C、B+C及A+B+C 4種復合酶解液酶解0.25 g培養10 h的濕菌絲體。由圖1可知，A+B、A+C、B+C、A+B+C復合酶解液對粗壯脈紋孢菌的酶解能力依次增強。其中，以A+B復合酶解液酶解的原生質體生成數及再生數最少；以A+B+C復合酶解液酶解后原生質體生成數及再生數最多。因此，A+B+C復合酶解液的酶解能力最強。

圖1 復合酶解液對原生質體制備及再生的影響Fig.1 Effects of enzyme preparations on protoplast production and regeneration

2.2菌齡對粗壯脈紋孢菌原生質體制備及再生的影響

分別取0.25 g培養6、8、10、12、14 h的濕菌絲體，用5 mL的A+B+C復合酶解液，30℃條件下酶解10 h。由圖2可知，粗壯脈紋孢菌菌絲體培養時間對原生質體生成及再生影響較大，培養10 h的菌絲體對原生質體的生成及再生最為有利，再生數可達1.41×106個，而培養12 h以上的菌絲體酶解較困難，原生質體生成及再生數均較低。因此，以培養10 h菌齡的菌絲體為最適條件。

圖2 菌齡對原生質體制備和再生的影響Fig.2 Effects of mycelium age on protoplast production and regeneration

2.3酶解時間對粗壯脈紋孢菌原生質體制備及再生的影響

圖3 酶解時間對原生質體制備和再生率的影響Fig.3 Effects of enzymatic digestion time on protoplast production and regeneration rate

取0.25 g培養10 h的菌絲體，以5 mL的A+B+C復合酶解液，30℃條件下分別酶解6、8、10、12、14 h。由圖3可知，A+B+C復合酶對培養10 h的粗壯脈紋孢菌菌絲體酶解6～14 h，原生質體生成數量呈升高趨勢，但酶解10 h生成的原生質體再生率最高，達到31.71%，此時，原生質體生成數可達4.53×106個。同時，考慮到酶解時間短對原生質體的轉化或融合有利，因此，選擇A+B+C復合酶酶解10 h為最佳酶解條件。

2.4粗壯脈紋孢菌原生質體的觀察

培養10 h的菌絲體，30℃條件下，以A+B+C復合酶解液酶解，顯微鏡下觀察可見，隨著酶解時間的增加，原生質體不斷從粗壯脈紋孢菌菌絲體中游離出來，而菌絲體逐漸變軟成團，過長時間酶解后菌絲體可斷裂成碎片。酶解10 h制備的原生質體較均勻干凈（圖4），而酶解12～14 h后制備的原生質體容易發生聚集黏連（圖5），這可能是因為細胞壁消化過于徹底導致的。

圖4 酶解10 h生成的原生質體（400×）Fig.4 Protoplast after enzymatic incubation for 10 h (400×)

圖5 酶解14 h生成的原生質體（400×）Fig.5 Protoplast after enzymatic incubation for 14 h (400×)

2.5 PEG介導的粗壯脈紋孢菌原生質體轉化

圖6 含潮霉素B的PDA再生培養基上轉化子生長情況Fig.6 Phenotype of transformants on plate medium containing hygromycin B

經PAKHB質粒載體轉化原生質體涂布抗性再生平板，培養1 d后，可見在含有潮霉素B的PDA再生培養基上能長出粗壯脈紋孢菌菌落，可獲得大于8個轉化子/μg質粒，而對照平板上未有生長（圖6）。表明制備的粗壯脈紋胞菌原生質體質量較好，能滿足基因重組轉化或原生質體融合的需要。

3 討 論

真菌細胞壁成分較復雜，粗壯脈紋胞菌細胞壁成分由外到里為無定形葡聚糖層、葡聚糖蛋白網、蛋白質及幾丁質微纖絲層[14]，真菌通常采用纖維素酶、溶壁酶及蝸牛酶復合酶進行酶解脫壁[15-16]。根據李姝江等[17]報道，當復合酶中纖維素酶-蝸牛酶-溶菌酶質量比為2∶1∶1時對球孢白僵菌菌絲原生質體制備效果好。考慮到酶的濃度太高會對原生質體產生毒害作用而影響再生率，而溶壁酶本身也是一種復合酶，因此確定復合酶為含0.5 g/100 mL蝸牛酶，0.5 g/100 mL溶壁酶和1.0 g/100 mL纖維素酶的酶解液。同時參考相關文獻[18-20]確定30℃為酶解溫度。本研究重點考察了酶的種類、菌齡及酶解時間對粗壯脈紋胞菌原生質體制備及再生的影響。

本研究考察的幾種組合的復合酶中，以A+B+C組成的復合酶解液效果最好，B+C組合效果較好，而A+B、A+C組合效果差，這與周禮紅等[21]實驗結果相近。可見，在粗壯脈紋胞菌原生質體制備過程中，溶壁酶及纖維素酶先前的協同酶解外層的無定形葡聚糖層、葡聚糖蛋白網、蛋白質層，對蝸牛酶酶解細胞壁內層的幾丁質起著十分重要作用。

粗壯脈紋胞菌菌絲的生長較快，菌齡對原生質體生成影響較大。菌齡過短，則菌絲收獲量小；菌齡太長，菌絲細胞壁會沉積不易被酶解的物質[22]，即無定形葡聚糖層增加，而難以酶解。本研究表明，菌齡為4 h時孢子剛剛萌發還很難收集到菌絲體，菌齡為10 h時收集的菌絲體量較合適，酶解生成的原生質體及再生數也最高，而菌齡為12 h以上的菌絲體酶解較困難。然而，有些生長較慢的真菌最適菌齡較長，如猴頭菌和黑曲霉分別需5 d和3 d[20,23]。

酶解時間過短酶解不充分，原生質生成數少，時間過長會毒害細胞膜，甚至皺縮，再生率下降[24]。本研究結果表明，隨著酶解時間延長生成的原生質體數量呈現增加的趨勢，但原生質體的再生率在酶解時間為6、8、10 h時明顯高于12、14 h，在實驗中也觀察到酶解時間大于12 h時原生質體發生了部分聚集、黏連，這充分說明酶解10 h以后一定程度上對原生質體細胞膜產生了損害。同時，酶解時間的長短在一定程度上受菌齡、酶的種類及濃度等因素的影響。粗壯脈紋胞菌原生質體的再生和轉化結果表明，在此優化條件下制備的原生質體質量較好。

參考文獻：

[1] EBERHART B M, BECK R S, GOOLSBY K M. Cellulase of Neurospora crassa[J]. Journal of Bacteriology, 1977, 130(1)∶ 181-186.

[2] 劉沛毅, 鄧澤元, 楊建遠, 等. 粗壯脈紋胞菌復合多菌種發酵茶粕產纖維素酶的研究[J]. 食品科學, 2014, 35(1)∶ 174-179. doi∶ 10.7506/ spkx1002-6630-201401034.

[3] 楊風玲, 鄧澤元, 葉俊, 等. 粗壯脈紋胞菌降解稻草粗纖維培養基的優化[J]. 南昌大學學報, 2013, 37(4)∶ 386-390.

[4] 李紅艷, 鄧澤元, 范亞葦, 等. 粗壯脈紋孢菌發酵豆渣所產類胡蘿卜素的研究[J]. 食品工業科技, 2009, 30(4)∶ 160-163.

[5] 張妍妍, 劉佩卉, 劉新利. 粗糙脈孢菌及其在發酵工業中的應用研究[J]. 山東科學, 2011, 24(3)∶ 37-42.

[6] PRABAVATHY V R, MATHIVANAN N, SAGADEVAN E, et al. Intra-strain protoplast fusion enhances carboxymethyl cellulase activity in Trichoderma reesei[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 38(5)∶ 719-723.

[7] HAMLYN P F, BRADSHAW R E, MILLAN F M, et al. Efficient protoplast isolation from fungi using commercial enzymes[J]. Enzyme and Microbial Technology, 1981, 3(4)∶ 321-325.

[8] KIM B K, KANG J H, JIN M, et al. Mycelial protoplast isolation and regeneration of Lentinus lepideus[J]. Life Sciences, 2000, 66(14)∶1359-1367.

[9] LIU Wen, ZHU Wenmiao. Production and regeneration of Trichosporon cutaneum protoplasts[J]. Process Biochemistry, 2000, 35∶ 659-664.

[10] 張粲, 高樂, 赫榮琳, 等. 檜狀青霉原生質體制備和再生的研究[J].基因組學與應用生物學, 2014, 33(1)∶ 57-62.

[11] SU Shanshan, LUO Yijing, CAO Siyuan, et al. Construction and evaluation of an exopolysaccharide-producing engineered bacterial strain by protoplast fusion for microbial enhanced oil recovery[J]. Bioresource Technology, 2013, 144∶ 44-49.

[12] 姚婷婷, 王正祥. 黑曲霉原生質體的制備、再生及轉化條件[J]. 食品與生物技術學報, 2006, 25(4)∶ 116-120.

[13] 李燕萍, 譚文輝, 許楊. 橙色紅曲菌AS3.4384轉化方法的建立[J]. 食品科學, 2007, 28(10)∶ 317-322.

[14] 周德慶. 微生物學教程[M]. 2版. 北京∶ 高等教育出版社, 2002∶ 54.

[15] THOMAS E, PAKALA S, FEDOROVA N D, et al. Triallelic SNP-mediated genotyping of regenerated protoplasts of the heterokaryotic fungus Rhizoctonia solani[J]. Journal of Biotechnology, 2012, 158(3)∶144-150.

[16] LI Lina, YU Changqing, HAN Yuxi. Enhancement of arachidonic acid production by mortierella isabellina through protoplast regeneration mutagenesis[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2011, 18(2)∶ 65-72.

[17] 李姝江, 朱天輝, 韓珊, 等. 球孢白僵菌原生質體制備和再生條件[J].四川農業大學學報, 2011, 29(1)∶ 45-51.

[18] 周鳳艷, 張勇, 周振榮, 等. 空心蓮子草致病菌假隔鏈格孢菌原生質體的制備與再生[J]. 植物保護學報, 2014, 41(2)∶ 151-156.

[19] 徐金濤. 瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶在纖維素酶誘導表達過程中作用機制的研究[D]. 濟南∶ 山東大學, 2014.

[20] 劉莉, 肖招燕, 郭麗瓊, 等. PEG 介導的猴頭菌遺傳轉化體系的建立[J].菌物學報, 2014, 33(1)∶ 121-128.

[21] 周禮紅, 李國琴, 王正祥, 等. 紅曲霉原生質體的制備、再生及其遺傳轉化系統[J]. 遺傳, 2005, 27(3)∶ 423-428.

[22] 王賡, 杜連祥. 新月彎孢霉原生質體制備及再生條件的研究[J]. 微生物學通報, 1999, 26(1)∶ 21-23.

[23] 王發祥, 俞健, 王建輝, 等. 1株產酸性α-淀粉酶黑曲霉原生質體制備和再生條件優化[J]. 食品科學, 2014, 35(1)∶ 155-158. doi∶ 10.7506/ spkx1002-6630-201401030.

[24] 邱靜, 羅水忠, 姜紹通, 等. 高產L-乳酸米根霉的原生質體制備與再生條件研究[J]. 食品科學, 2011, 32(9)∶ 174-178.

Protoplast Production, Regeneration and Transformation of Neurospora crassa

YANG Jianyuan1,2, LI Jing1, FAN Yawei1, ZHANG Binghuo2, DENG Zeyuan1,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Techno logy, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2. College of Pharmaceutical and Life Sciences, Jiujiang University, Jiujiang 332000, China)

This study aimed to establ ish protoplast-mediated genetic transformation system ofNeurospora crassa. Several major fac tors influencing the production and regeneration ofN. crassaprotoplast, such as mycelium incubation time, macerozyme and digestion time, were investigated. The results showed that mycelium incubation in liquid PDA medium at 30℃for 10 h, and enzymatic hydrolysis at 30℃for 10 h with a macerozyme solution containing 0.5 g/100 mL snailase, 0.5 g/100 mL lyticase and 1.0 g/100 mL cellulase were optimal for the production and regeneration ofN. crassaprotoplast. Under these conditions, the number of production and regeneration in 38# regeneration medium ofNeurospora crassaprotoplast were 4.53 × 106and 1.41 × 106, respectively, and the regeneration rate was 31.71%. Transformation efficiency with PAKHB plasmid by PEG-mediated was more than 8 transformants per μg of plasmid DNA.

Neurospora crassa; protoplasts; producti on; regeneration; transformation

TS201

1002-6630（2015）17-0169-04

10.7506/spkx1002-6630-201517032

2014-11-26

食品科學與技術國家重點實驗室（南昌大學）目標導向課題（SKLF-ZZA-201303）；江西省科技支撐計劃項目（2010BSB03004）

楊建遠（1979—），男，講師，博士研究生，研究方向為食品生物技術與食品營養。E-mail：yjy731@sohu.com

*通信作者：鄧澤元（1963—），男，教授，博士，研究方向為食品營養與功能食品。E-mail：dengzy@ncu.edu.cn