植物乳桿菌fmb10產細菌素發酵條件的優化

陳蕓蕓，陸兆新*，盧 靜，楊 杰，魏照輝

植物乳桿菌fmb10產細菌素發酵條件的優化

陳蕓蕓1,2，陸兆新2,*，盧 靜2，楊 杰2，魏照輝2

（1.閩南師范大學生物科學與技術學院，福建 漳州 363000；2.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210000）

通過單因素試驗對影響植物乳桿菌fmb10發酵產細菌素的8個影響因子進行初篩，采用Plackett-Burman設計法確定顯著影響因子，利用最陡爬坡試驗逼近最佳響應面區域，運用Design-Expert軟件的中心組合試驗設計（central composite design，CCD）對顯著影響因子的重要水平和交互作用進行研究。結果表明，菌株fmb10產細菌素的最佳發酵條件為：發酵溫度30.38℃、葡萄糖質量濃度21.1 g/L、酵母膏質量濃度11.0 g/L，在此條件下，植物乳桿菌fmb10發酵上清液對大腸桿菌抑菌圈直徑平均為22.90 mm，與預測值22.89 mm高度吻合，優化后植物乳桿菌fmb10發酵上清液抑菌圈直徑較原始抑菌圈直徑（18.37 mm）提高了24.66%。

植物乳桿菌；細菌素；Plackett-Burman設計；響應面

乳酸菌細菌素已成為天然防腐劑研究與開發應用的熱點[1]。它是乳酸菌在代謝過程中通過核糖體合成機制產生的一類具有抑菌活性的多肽、蛋白質或蛋白質復合物[2-3]。廣譜性乳酸菌細菌素的開發已經成為乳酸菌研究的熱點之一[4]，近幾年越來越多的抑菌廣譜性細菌素被發現[5]。目前已在革蘭氏陽性菌中發現50余種羊毛硫細菌素[6]，一部分乳酸菌細菌素已作為天然食品添加劑用于食品保藏以減少化學防腐劑的添加量[7]。

本實驗從福建漳州程溪本地特色水果鳳梨中篩選得到一株具有廣譜抑菌活性的植物乳桿菌fmb10，為提高其植物乳桿菌素產量，對其進行了單因素初篩、Plackett-Burman設計確定顯著影響因子、最陡爬坡試驗逼近最佳響應面區域、響應面法的中心組合試驗設計（central compositedesign，CCD）對顯著影響因子的重要水平和交互作用進行研究，以確定植物乳桿菌fmb10發酵產細菌素的最佳發酵條件，提高細菌素的產量。

1 材料與方法

1.1菌種

供試菌株：分離自福建漳州程溪菠蘿，編號fmb10。

指示菌：大腸桿菌（E. coli），南京農業大學食品科技學院酶工程實驗室保藏。

1.2培養基

乳酸菌活化及篩選采用MRS培養基[8]；指示細菌采用NA培養基[9]。

1.3方法

1.3.1菌種的活化與培養

植物乳桿菌fmb10經傳代活化后，以1%接種量接入液體MRS培養基，37℃靜置培養24 h[10]。

1.3.2指示菌平板制備及抑菌活性的測定

用移液槍吸取過夜培養的幼齡大腸桿菌1 mL于100 mL NA培養基中（50℃），充分搖勻，靜置冷卻備用；采用打孔擴散法測定抑菌活性[11]。

1.3.3單因素試驗

1.3.3.1 發酵溫度

分別設定發酵溫度為28、30、35、37、40℃，裝液量100 mL/250 mL，發酵24 h。

1.3.3.2初始pH值

用HCl調節培養基初始pH值為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，30℃、裝液量100 mL/250 mL，發酵24 h。

1.3.3.3裝液量

設定裝液量為40、60、80、100、120 mL/250 mL，30℃條件下發酵24 h。

1.3.3.4碳源

分別添加20 g/L的葡萄糖（G）、蔗糖（S）、麥芽糖（M）、乳糖（L），10 g/L G+10 g/L S、10 g/L G+ 10 g/L L、10 g/L G+10 g/L M，37℃，發酵24 h。單一碳源葡萄糖（G）質量濃度分別設為5、10、20、30 g/L，以不添加任何碳源為空白對照。

1.3.3.5氮源

分別添加20 g/L的蛋白胨（PP）、牛肉膏（BE）、酵母膏（Y E）、胰蛋白胨（T P）、檸檬酸三銨（AC），10 g/L YE+2 g/L AC（配方1）、10 g/L YE+10 g/L TP（配方2）、10 g/L YE+10 g/L TP+ 2 g/L AC（配方3）、10 g/L YE+10 g/L TP+5 g/L AC（配方4）、10 g/L YE+10 g/L BE+2 g/L AC（配方5）、10 g/L YE+10 g/L PP+2 g/L AC（配方6）、10 g/L YE+ 10 g/L TP+5 g/L PP+2 g/L AC（配方7），以不添加氮源為空白對照。

1.3.3.6磷酸鹽

分別添加2 g/L的Na3PO4、KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4、NaH2PO4、NH4H2PO4、(NH4)2HPO4；替換NaH2PO4添加量為1、2、3、4 g/L，以不添加磷酸鹽為空白對照。

1.3.3.7金屬離子

培養基中分別添加2 g/L的NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、MnCl2、CuSO4、FeSO4，發酵24 h，以不添加金屬離子為空白對照。

1.3.3.8生長因子

培養基中吐溫-80體積分數分別為0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，發酵24 h。

1.3.4 Plackett-Burman設計篩選

根據單因素試驗結果，采用數據處理軟件Minitab 16的Plackett-Burman設計法創建試驗次數N=12的試驗，對溫度、碳源、氮源、磷酸鹽、金屬離子5個主要因素進行考察，以抑菌圈直徑為響應值進行試驗各因素主效應分析，考察各因素對fmb10產細菌素影響的顯著性。

1.3.5最陡爬坡試驗

根據Plackett-Burman試驗篩選出的顯著因子，以試驗值變化的梯度方向為爬坡方向，根據各因素抑菌圈直徑的大小確定變化步長，逼近最佳區域，以建立有效的響應面擬合方程。

1.3.6響應面優化發酵條件模型的建立及其顯著性

根據Plackett-Burman試驗結果，選出3個顯著影響的因素，運用Design-Expert軟件的CCD法，每個因素取3個水平，以-1、0、1編碼進行試驗后，對數據進行二次回歸擬合，得到包括一次項、平方項和交互項的二階經驗模型，分析各因素對fmb10發酵產細菌素活性的主效應和交互效應，確定fmb10產細菌素的最優培養條件。

2 結果與分析

2.1不同發酵條件對植物乳桿菌fmb10發酵產細菌素的影響

圖1 不同發酵溫度（a）、初始pH值（b）和裝液量（c）對fmb10發酵產細菌素的影響Fig.1 Effects of culture temperature (a), initial pH (b) and medium volume (c) on the production of plantaricin

在不同發酵溫度、初始pH值及裝液量條件下發酵，考察發酵條件對植物乳桿菌fmb10發酵產細菌素的影響，結果見圖1。30℃時菌株fmb10的抑菌圈直徑最大，這與Ogunbanwo等[12]很多研究一致，在30℃時最有利于植物乳桿菌產細菌素。也有報道某些植物乳桿菌產細菌素的最佳發酵溫度較低，Delgado等[13]研究發現，Lactobacillus plantarum17.2b在24℃時抑菌活性最高。初始pH值和裝液量對菌株fmb10發酵產細菌素影響不明顯，本試驗選擇初始pH 6.0、裝液量100 mL/250 mL為后續研究的發酵條件。

2.2植物乳桿菌fmb10發酵產細菌素的培養基組分優化

2.2.1主要營養成分

圖2 不同碳源對fmb10發酵產細菌素的影響Fig.2 Effects of different carbon sources on the production of plantaricin

如圖2、3所示，單純加葡萄糖（G）為碳源，菌株fmb10的抑菌活性明顯高于其他碳源，且初始添加量為20 g/L時抑菌活性最大，Matsusaki等[14]研究也報道，Nisin Z類乳酸菌細菌素產生的最適碳源為葡萄糖和蔗糖。

圖3 不同質量濃度葡萄糖對fmb10發酵產細菌素的影響Fig.3 Effects of glucose concentration on the production of plantaricin

圖4 20 g/L不同單一氮源（a）和復合氮源（b）對fmb10發酵產細菌素的影響Fig.4 Effects of individual and combined nitrogen sources on the production of plantaricin

由圖4a、4b可知， 檸檬酸三銨（AC）為氮源時，由于使得最終發酵液體系pH值過高，抑制了菌株fmb10細菌素的產生；而添加20 g/L酵母膏（YE）培養得到的fmb10菌株抑菌活性最高；混合氮源明顯比單一氮源更有利于提高菌株fmb10發酵產細菌素，其中以10 g/L YE+10 g/L PP+2 g/L AC的組合抑菌作用最強，說明檸檬酸三銨（AC）作為單一氮源不適合，但作為復合氮源的成分，有重要的pH值緩沖作用，這與魯淵[15]的分析結果一致。

2.2.2其他成分

磷酸鹽的種類和質量濃度對細菌素產量變化有著明顯的影響[16]。圖5、6結果顯示，NaH2PO4對菌株fmb10產細菌素的效果最佳，其質量濃度為2 g/L時菌株fmb10的抑菌活性最大。

圖5 不同2 g/L的磷酸鹽對fmb10發酵產細菌素的影響Fig.5 Effects of different phosphate sources (2 g/L) on the production of plantaricin

圖6 不同質量濃度NaH2PO4對fmb10發酵產細菌素的影響Fig.6 Effects of NaH2PO4concentration on the production of plantaricin

圖7 不同2 g/L的金屬離子對fmb10發酵產細菌素的影響Fig.7 Effects of different metal ions (2 g/L) on the production of plantaricin

金屬離子不僅影響細菌的生長，如Mg2+、Mn2+和Fe2+會明顯促進細菌生長[17]，Cu2+具有較強的抑制作用[18]，同時也影響細菌素的發酵生產，極低質量濃度的Ca2+就能促進Nisin的活性提高20%[14]，而Zn2+、Cu2+均有不同程度的抑制作用，其中Cu2+的抑制作用最強[19]。由圖7可知，Cu2+對菌株fmb10合成細菌素有強烈的抑制作用，而2 g/L Na+可以提高菌株fmb10的抑菌活性，其他金屬離子對菌株fmb10細菌素的合成無明顯提高作用。

圖8 不同體積分數吐溫-80對fmb10發酵產細菌素的影響Fig.8 Effects of Tween-80 concentration on the production of plantaricin

適量吐溫-80會促進細菌素產生并提高抑菌活性，但過量吐溫-80會和硫酸銨反應形成沉淀，導致純化工藝變復雜[15]。由圖8可知，吐溫-80可提高細菌素的合成，但隨著其體積分數增大到0.5%，抑菌作用開始降低，加之高體積分數吐溫-80不利于分離純化，故選擇最適體積分數為0.1%。

2.3 Plackett-Burman設計優化發酵條件

在單因素試驗基礎上，選擇5個對植物乳桿菌fmb10發酵產細菌素有重要作用的因素：發酵溫度、葡萄糖質量濃度、酵母膏質量濃度、NaH2PO4質量濃度、NaCl質量濃度，以抑菌圈直徑為指標進行Plackett-Burman設計，考察這些因素對fmb10發酵產細菌素的影響，試驗因素水平與結果見表1。

Plackett-Burman方差分析和各因素顯著性檢驗結果見表2，對菌株fmb10產細菌素具有顯著影響的因子為：X1（P=0.006）、X2（P=0.014）和X3（P=0.015），且均為正效應，說明這3個因素在水平上限時更有利于菌株fmb10產細菌素，符合單因素篩選的試驗結果，中心點應適當上移[20]。

表1 Plackett-Burman試驗設計與結果Table1 Plackett-Burman design with experimental and predicted values of bacteriostatic diameter

表2 Plackett-Burman設計回歸模型方差分析Table2 Analysis of variance of regression model from Table2 Analysis of variance of regression model from Plackett-Burman design sign

2.4最陡爬坡試驗接近最大響應面區域

由Plackett-Burman試驗的結果選取X1（發酵溫度）、X2（葡萄糖質量濃度）和X3（酵母膏質量濃度）這3個顯著因素進行最陡爬坡試驗，見表3。

表3 最陡爬坡試驗設計及結果Table3 Experimental design and results of steepest ascent pathTable3 Experimental design and results of steepest ascent path

由表3可知，最佳因素的條件處于第3組，故以30℃、20 g/L葡萄糖和10 g/L酵母膏作為后續試驗的中心點進行響應面分析。

2.5響應面優化培養條件

2.5.1預測模型建立及顯著性檢驗

通過Plackett-Burman設計篩選出顯著影響因子，并通過最陡爬坡試驗確定接近響應值區域的因素水平，采用CCD進一步優化，結果見表4。

表4 中心組合試驗設計及結果Table4 Central composite design with experimental values of bacteriostatic diameter

利用Design-Expert分析軟件對表中數據進行多元回歸擬合，得到響應值抑菌圈直徑（Y）對自變量X1、X2和X3的二次多項回歸方程：

對上述回歸模型進行方差分析，結果如表5，該模型達到了極顯著水平（P＜0.000 1），回歸方程的失擬性（P=0.164 3）檢驗不顯著。回歸模型的R2Adj=0.982 8，說明該模型能解釋98.28%的變化，決定系數R2=0.992 5，表明菌株fmb10產細菌素抑菌活性的實測值與預測值之間有很好的擬合度。因此，此模型可用于分析和預測菌株fmb10產細菌素的發酵條件。

表5 中心組合試驗設計的回歸模型方差分析結果Table5 Analysis of variance of regression model from central composite design for bacteriostatic activity of plantaricin

2.5.2發酵條件的響應面分析與優化

由中心組合回歸模型得到的響應面圖見圖9，分別體現了影響菌株fmb10發酵產細菌素的各顯著因素間兩兩交互作用。可以看出，回歸方程存在穩定點，通過軟件分析，穩定點即最大值點，所對應的各顯著因素最佳條件分別為發酵溫度30.38℃、葡萄糖質量濃度21.1 g/L、酵母膏質量濃度11.0 g/L，此時fmb10發酵上清液的抑菌活性最高，抑菌圈直徑達到22.89 mm。

圖9 各因素交互作用對菌株fmb10細菌素合成影響的響應面圖Fig.9 Response surface plot showing the interactions of experimental factors on the production of plantaricin

2.5.3驗證實驗

以發酵溫度30℃、葡萄糖質量濃度21.1 g/L、酵母膏質量濃度11.0 g/L，分3批發酵菌株fmb10并測定其發酵上清液的抑菌活性，得到抑菌圈直徑分別為23.01、22.93、22.76 mm，平均值為22.90 mm，與預測值22.89 mm非常接近，比原始發酵上清液抑菌圈直徑（18.37 mm）提高了24.66%。

3 結 論

本研究在單因素試驗的基礎上，采用響應面法對菌株fmb10產細菌素發酵條件進行優化，通過Plackett-Burman設計確定發酵溫度、葡萄糖質量濃度、酵母膏質量濃度為顯著影響因子，利用最陡爬坡試驗逼近最佳響應面區域，最終運用Design-Expert軟件的中心組合試驗設計對顯著影響因子的重要水平和交互作用進行了研究，得到主要因子的最佳發酵條件為：發酵溫度30.38℃、葡萄糖質量濃度21.1 g/L、酵母膏質量濃度11.0 g/L，在此優化條件下對菌株fmb10進行發酵并測定發酵上清液的抑菌活性，同得到發酵上清液的抑菌圈直徑平均值為22.90 mm，比原始發酵上清液抑菌圈直徑（18.37 mm）提高了24.66%，與預測值22.89 mm也非常接近，說明回歸方程較真實地反映了篩選出的顯著因子對菌株fmb10發酵產細菌素的影響，建立的模型與實際情況基本相吻合，采用響應面法優化菌株fmb10發酵產細菌素是有效可行的。

對發酵上清液進行濃縮，并通過有機溶劑萃取、Sephadex LH-20分子篩及Sephadex G-25層析等純化后測定其抑菌圈大小，結果顯示其仍然具有很高的抑菌活性，此優化后的發酵條件為后續將要進行的細菌素分離純化鑒定工作提供了基礎。

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Optimization of Culture Conditions for Plantaricin Produced by Lactobacillus plantarum fmb10

CHEN Yunyun1,2, LU Zhaoxin2,*, LU Jing2, YANG Jie2, WEI Zhaohui2
(1. School of Biological Science and Biotechnology, Minnan Normal University, Zhangzhou 363000, China; 2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210000, China)

Influences of 8 factors (including medium components and culture conditions) on the production of plantaricin byLactobacillus plantarumfmb10 were evaluated by Plackett-Burman design to select the most significant factors. Subsequently, the path of steepest ascent design was used to approach the optimal region, followed by the use of central composite design (CCD) and response surface methodology for further optimization of the selected significant factors. Culture temperature, glucose concentration and yeast extract concentration were found to be the factors with the most significant influence on plantaricin production, and their optimum levels were determined as 30.38℃, 21.1 g/L and 11.0 g/L, respectively. Under the optimum conditions, the bacteriostatic diameter of the fermentation supernatant was 22.90 mm, indicating a 24.66%increase compared with that (18.37 mm) obtained before optimization.

Lactobacillus plantarum; plantaricin; Plackett-Burman design; response surface methodology

Q93.331

1002-6630（2015）17-0140-06

10.7506/spkx1002-6630-201517027

2014-09-16

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2011BAD23B05）

陳蕓蕓（1978—），女，講師，碩士，研究方向為食品微生物。E-mail：windy970530@163.com

*通信作者：陸兆新（1957—），男，教授，博士，研究方向為食品微生物與生物技術。E-mail：fmb@njau.edu.cn