中國葡萄酒產區酒酒球菌種質資源遺傳多樣性分析

金 剛，王 華,2,3，張 昂，李 華,2,3,*

中國葡萄酒產區酒酒球菌種質資源遺傳多樣性分析

金 剛1，王 華1,2,3，張 昂4，李 華1,2,3,*

（1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.西北農林科技大學，合陽葡萄試驗示范站，陜西 合陽 715300；3.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西 楊凌 712100；4.秦皇島出入境檢驗檢疫局，河北 秦皇島 066004）

為了解我國葡萄酒產區酒酒球菌種質資源遺傳多樣性，對22株篩選自我國不同葡萄酒產區的乳酸細菌進行了種特異性聚合酶鏈式反應（species-specific polymerase chain reaction，PCR）分析、16S rRNA序列分析和擴增片段長度多態性分析（amplified fragment length polymorphism，AFLP）基因分型。種特異性PCR和16S rRNA序列分析表明22株分離株為酒酒球菌（Oenococcus oeni）。建立了O. oeni基于HindⅢ和MseⅠ為內切酶的AFLP分析體系，對16對引物組合進行了篩選，結果表明HT-MA、HT-MT、HT-MC、HG-MA、HG-MT、HC-MT為O. oeniAFLP分析的最佳引物組合，且實驗重復性在98%以上。對O. oeni的AFLP分析結果顯示：22株O. oeni分為3個簇群，且簇群間遺傳相似性系數較小。所以，以HindⅢ和MseⅠ為內切酶的AFLP技術是研究O. oeni基因分型的有效方法，我國葡萄酒產區的O. oeni具有豐富的遺傳多樣性，O. oeni菌株間的遺傳相似性系數不僅僅與其生態地理分布有關，可能還與其所處的微生態和其他因素有關。

酒酒球菌；種特異性PCR；16S rRNA序列分析；擴增片段長度多態性分析技術

蘋果酸-乳酸發酵（malolactic fermentation，MLF）是葡萄酒釀造過程中基本的生物化學過程，它發生于酒精發酵之后，細菌把蘋果酸轉化成乳酸和二氧化碳[1]。酒酒球菌（Oenococcus oeni）被認為是MLF的主要完成者，它能降低葡萄酒的酸度、改善葡萄酒的質量和增強穩定性[2]。

隨著我國葡萄酒產業的發展壯大，葡萄酒產業已開始由單一的飲料葡萄酒到飲料葡萄酒和酒莊葡萄酒共同發展的局面。酒莊酒不僅對葡萄酒的質量有較高要求，而且突出了對葡萄酒個性風格的要求，葡萄酒的個性風格是葡萄酒對不同產地的包括釀酒微生物的風土條件的總體反映。所以，自然發酵和篩選當地微生物進行接種發酵對于釀造高品質的酒莊酒有重要意義。O. oeni在葡萄酒中的活性依賴于它對葡萄酒惡劣生境（高酸、高SO2含量、高酒精體積分數）的耐受性[1,3]。不同的菌株對于逆境的適應性不同。我國葡萄酒產區分布比較廣泛，各產區生態地理條件差異很大，必然蘊含著豐富和多樣性的O. oeni種質資源。因此，分離篩選我國葡萄酒產區O. oeni，研究它們的遺傳多樣性及其與生態地理分布的關系對于我國葡萄酒的生產具有重要意義。

分子生物學的發展使得微生物的分類鑒定變得更為高效和可靠。目前，各種分子生物學方法已廣泛應用于微生物的分類鑒定。不同種類的乳酸菌可能存在于同一發酵過程中，所以對于乳酸菌種水平上的鑒定是必要的。近年來，16S rRNA測序[4-5]、16S～23S rRNA間隔區序列分析[6-7]、種特異性聚合酶鏈式反應（species-specific polymerase chain reaction，PCR）技術[4-5,8-9]被廣泛應用于O. oeni的鑒定。

對于O. oeni菌株的基因分型，只有對于基因型微弱差異敏感的分子標記方法才能完成。這些分子標記方法包括隨機擴增多態性DNA-PCR（random amplified polymorphic DNA-PCR，RAPD-PCR）[10-11]，多位點序列分析（multiple locus sequence typing，MLST）[12-13]，脈沖電場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）[14]，擴增片段長度多態性分析技術（amplified fragment length polymorphism，AFLP）[5,15-16]。它們已被越來越多地應用于O. oeni及其他乳酸細菌的分類鑒定研究中。

AFLP是基于對基因組限制性酶切片段選擇性PCR擴增結果分析的基礎上來對不同基因組進行分型的技術[17]。AFLP結合了限制性片段長度多態性分析技術（restriction fragment length polymorphism，RFLP）和RAPD兩種技術的優點，被認為是目前最有效最理想的一種DNA分子標記技術。但它在葡萄酒微生物研究中仍然較少應用。目前，在對O. oeni的基因分型研究時仍然應用的是經典的EcoRⅠ和MseⅠ內切酶組合，本研究采用HindⅢ和MseⅠ兩種內切酶組合，以期較好的將AFLP應用于O. oeni基因研究中。

1 材料與方法

1.1菌株與培養基

供試菌株是分別從山東青島（SD-1a、SD-1b、SD-1c、SD-1d、SD-1e、SD-1f、SD-1g）、山東煙臺（SD-2a、SD-2b、SD-2d、SD-2ee、SD-2gf、SD-2gh、SD-2h、SD-2ji、SD-2kj）、河北沙城（HB-1a、HB-1b、HB-1c、HB-2b）、陜西楊凌（SX-1a、SX-1b）等地的葡萄酒中分離、初步鑒定得到的22株O. oeni。本實驗收集了1株O. oeni的標準菌株作為陽性對照，它是酒酒球菌31-DH，由中國食品發酵工業研究院提供。另外還收集了一株嗜酸乳桿菌（中國工業微生物菌種保藏管理中心，編號6005）作為陰性對照菌株，用于O. oeni的鑒定。

O. oeni的培養采用ATB培養基：蛋白胨10 g/L、酵母浸出物5 g/L、葡萄糖10 g/L、MgSO40.2 g/L、MnSO40.05 g/L、鹽酸半胱氨酸0.5 g/L，番茄汁250 mL/L，調節pH值至4.8，ATB固體培養基中加20 g/L的瓊脂，121℃滅菌15 min。

嗜酸乳桿菌的培養采用MRS培養基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、牛肉膏10 g、葡萄糖20 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸二銨2 g、吐溫-80 1 mL、MgSO40.58 g、MnSO40.05 g、K2HPO42 g，水1 000 mL。固體培養基加瓊脂粉17 g，121℃，1×105Pa滅菌20 min。

1.2試劑與儀器

DNA聚合酶 日本TaKaRa公司；內切酶HindⅢ、MseⅠ，T4 DNA連接酶Fermentas公司；DNA聚合酶天根生化科技（北京）有限公司。

凝膠成像分析系統 英國Syngene公司；Veriti梯度基因擴增儀 美國ABI公司；NanoDrop1000核酸蛋白測定儀 美國Thermo公司；JY 3000型電泳儀、JY-CX 2B型測序電泳槽 北京君意東方電泳設備有限公司。

1.3方法

1.3.1細菌的培養

1.3.1.1O. oeni的培養

固體培養：在28℃厭氧箱培養箱中充CO2培養，培養時間為5～7 d。液體培養：28℃靜置培養72 h。

1.3.1.2嗜酸乳桿菌的培養

固體培養：培養皿密封、倒置于37℃恒溫培養箱培養30 h。液體培養：37℃靜置培養48 h[18]。

1.3.2細菌總DNA的提取

參照文獻中的十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法和溶菌酶法[19]。

1.3.3O. oeni的種特異性PCR擴增

參照Zapparoli等[8]設計的引物On1：5’-TAATGTGG TTCTTGAGGAGAAAAT-3’和On2：5’-ATCATCGTCAAA CAAGAGGCCTT-3’，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應體系（2 0 ?L）：10×PCR Buffer 2.0 ?L，dNTPs 1.6 ?L（2.5 mmol/L），Mg2+1.6 ?L（25 mmol/L），上下游引物各0.8 ?L（10 ?mol/L），模板DNA 1.0 ?L，DNA聚合酶0.1 ?L（5 U/?L），加ddH2O至終體積為20 ?L。反應條件：94℃預變性2 min；94℃變性45 s，64℃退火2 min，72℃延伸2 min，30個循環。最后72℃延伸10 min。PCR產物上樣到1.0%的瓊脂糖凝膠上100 V電壓下電泳40 min，溴化乙錠染色，用凝膠成像分析系統照相。

1.3.4細菌16S rRNA序列分析

參照Klijn等[20]的引物P1（41～60：5’-GCGGCGTG C C T A A T A C A T G C-3’）和P 3（6 8 6～7 0 5：5’-ATCTACGCATTTCACCGCTA-3’），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應體系（50 ?L）：10×PCR Buffer 5.0 ?L、dNTPs 4 ?L（2.5 mmol/L）、Mg2+5 ?L（25 mmol/L）、上下游引物各5 ?L（10 ?mol/L）、模板DNA 2.0 ?L、DNA聚合酶0.3 ?L（5 U/?L），加ddH2O至終體積為50 ?L。反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，35個循環；最后72℃延伸10 min。PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測后對合格樣品送南京金斯瑞生物科技有限公司進行純化和測序。

1.3.5O. oeniAFLP分析方法的建立

1.3.5.1 DNA提取方法的建立

DNA模板的純度和質量對AFLP的成功起著關鍵作用，實驗中優化和比較了CTAB法和溶菌酶法兩種常見的細菌DNA提取方法。

1.3.5.2雙酶切反應體系的建立

通過實驗優化，獲得了O. oeni的HindⅢ和MseⅠ酶切和連接反應體系：在20 ?L反應體系中加入約200 ng基因組DNA、5 UMseⅠ和2 ?L 10×Buffer R，65℃酶切4 h，冷卻后加入10 UHindⅢ、MseⅠ接頭（5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’；5’-TACT CAGGACTCAT-3’）各0.5 ?L（10 ?mol/L）、HindⅢ接頭（5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’；5’-AGCTGGTACGCAGTC-3’）各0.25 ?L（10 ?mol/L）、1 ?L ATP、10 U T4 DNA連接酶、1 ?L Buffer R、3 ?L T4 DNA連接酶Buffer，加ddH2O至30 ?L，37℃酶切鏈接4 h。產物稀釋5倍用于預擴增反應。

1.3.5.3 PCR擴增反應體系優化

通過實驗優化反應條件得到的預擴增反應體系（25 ?L）：10×PCR Buffer 2.5 ?L、d N T P s 0.5 ?L（2.5 m m o l/L）、引物H 0（5’-G A C T G C G T A C C A G C T T-3’）1 ?L（10 ?mol/L）、M0（5’-GATGAGTCCTGAGTAA- 3’）1 ?L（10 ?mol/L）、模板4 ?L（酶切連接產物稀釋5倍）、D N A聚合酶0.6 ?L（2.5 U/?L）。反應條件：94℃2 min；94℃30 s，56℃60 s，72℃1 min，30個循環；最后72℃延伸7 min。預擴增產物稀釋20倍用于選擇性擴增。

通過實驗優化反應條件得到的選擇性擴增反應體系（25 ?L）：10×PCR Buffer 2.5 ?L、dNTPs 0.5 ?L（2.5 mmol/L）、引物Hx 1 ?L（10 ?mol/L）、My 1 ?L（10 ?mol/L）（引物組合見表2）、模板2.0 ?L（預擴增產物稀釋20倍）、DNA聚合酶0.6 ?L（2.5 U/?L）。反應條件：94℃2 min，66℃30 s（每個循環下降1℃），72℃2 min，10個循環。然后94℃20 s，56℃20 s，72℃2 min，20個循環。最后60℃延伸30 min。

1.3.5.4選擇性擴增產物的聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）與銀染

選擇性擴增產物加入1/3體積的變性上樣緩沖液（98%去離子甲酰胺、10 mmol/L pH 8.0乙二胺四乙酸、0.25%溴酚藍、0.25%二甲苯氰）混勻后95℃變性5 min，立即置于冰上。取5 ?L樣品于6%的PAGE上80 W恒功率進行電泳檢測，電泳結束后采用硝酸銀染色法顯色[21]。

1.3.5.5O. oeniAFLP引物組合的篩選

為篩選出O. oeniAFLP擴增效率高、多態性好的引物組合，16對引物組合被用于O. oeni菌株的擴增和分析。比較不同引物組合擴增的條帶數以及多態性位點數。

1.3.5.6中國葡萄酒產區篩選的O. oeni的AFLP分析

對從我國葡萄酒主產區篩選的22株O. oeni菌株進行AFLP分析，了解我國葡萄酒產區酒酒球菌的遺傳多樣性。

1.4數據分析

對變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜中擴增的條帶進行人工統計，按照等位基因有條帶的記為1，無條帶的記為0的方法，將AFLP指紋圖譜轉換成1和0構成的數字矩陣，輸入到Microsoft Excel表格中。用NTSYS 2.10軟件進行數據分析，用軟件中的SHAN程序和非加權配對算術平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）進行聚類分析，生成22株O. oeni遺傳相似性系數表，并通過系統發育樹生成聚類圖。

2 結果與分析

2.1細菌的種特異性PCR鑒定

依據Zapparoli等[8]設計的引物，22株菌株都能擴增得到一條長1 025 bp的片段（圖1），陰性對照嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）不能擴增出條帶。

圖1 222 株O..oeni的種特異性PPCCRR鑒定Fig.1 Identification of 22 O. oeni by species-specific PCR

2.2細菌的16S rRNA序列分析

使用擴增細菌16S rRNA基因序列41～705 bp的一對引物，對22株細菌進行16S rRNA測序，分析測序報告并完成序列處理，得到約600 bp的細菌16S rRNA基因序列。將這些序列與GenBank數據庫里的O. oeni菌株IOB 8413（登錄號：AJ831548）的16S rRNA基因序列進行比較，同源性為99.8%～100%。通過利用序列分析軟件ClustalX 1.83進行比對分析22株分離菌及O. oeniIOB 8413的16S rRNA基因的73～650 bp序列，發現除SD-2d在76～77 bp處插入了堿基“C”外，其余堿基全部相同。這說明O. oeni種內菌株間16S rRNA基因差異小。

種特異性PCR和16S rRNA基因序列分析表明22 株細菌為O. oeni。

2.3O. oeniAFLP分析方法的建立

2.3.1適于O. oeniAFLP分析的DNA提取方法的建立

表1 兩種DNA提取方法所得DNA質量濃度和純度的比較Table1 Concentrations and purities of DNA samples extracted by two different methods

圖2 O. oeni oeni兩種提取方法提取的DNA的PAGE結果AGEFig.2 Electrophoresis photograph of O. oeni DNA extracted by two different methods

本研究優化并比較了溶菌酶法和CTAB法兩種方法對O. oeniDNA的提取效果，結果表明溶菌酶法提取的O. oeniDNA濃度高、純度較差；CTAB法提取的DNA濃度低、純度很好（表1，圖2）。對于AFLP技術，酶切連接的效果直接決定了AFLP是否成功，由于后續需要對基因組DNA進行酶切鏈接，DNA提取物里的雜質會嚴重影響酶切連接效果，所以高純凈度的基因組DNA對于AFLP的成功與否是起決定性作用的。而且，AFLP技術不需要很高的模板濃度，所以CTAB法提取的基因組DNA可適用于AFLP分析，后續的研究也表明CTAB法提取的基因組DNA酶切連接效果比溶菌酶法更穩定。

2.3.2O. oeniAFLP分析引物組合的篩選

表2 16 對引物組合的序列及其相應的O. oeni AFLP擴增總條帶數和多態性比率Table2 Average number of fragments and polymorphism bands obtained from 16 pairs of selective primers and sequences to detect AFLPs among O. oeni strains isolated from Chinese wines

16對引物被用于O. oeni的AFLP分析，結果表明不同引物組合擴增得到的總條帶數和多態性條帶數差別很大。引物組合中HT-MA、HG-MA、HC-MA、HA-MT、HC-MT能夠擴增出最多的總條帶數，其中HC-MA擴增的條帶最多，達到最多70條，HC-MG擴增的總條帶數最少，最少為21條。引物組合HT-MC、HT-MA、HT-MT、HG-MT、HC-MT、HA-MG、HG-MG具有較高的多態性位點比率，其中HT-MC多態性位點比率最高達到52.9%，HA-MA多態性位點比率最低，最低達到10%。綜合分析總條帶數和多態性位點比率，引物組合HT-MA、HT-MT、HT-MC、HG-MA、HG-MT、HC-MT為O. oeniAFLP分析的最佳引物組合（表2）。重復性實驗表明，這些引物組合在O. oeniAFLP分析中的重復性為98%以上。

2.3.3中國葡萄酒產區篩選的O. oeni的AFLP分析

引物組合HC-MT被用于22株O. oeni的AFLP分析。由圖3可知，22株O. oeni的最小遺傳相似系數僅為0.45，表明不同產區O. oeni的種內遺傳多樣性豐富。在相似性系數0.565處，22株O. oeni可分為3個簇群，第一簇群包括：HB-1a、SD-1g、SX-1a、HB-2b、SX-1b、SD-2ji、SD-1f、SD-1c、SD-2kj、SD-1b、HB-1c分離自河北、陜西、山東的11株O.oeni菌株。這些菌株間的遺傳相似性系數差異很大，遺傳多樣性豐富，其中HB-1a、SD-1g、SX-1a、HB-2b、SX-1b具有較高的相似性形成一個亞簇，且亞簇內菌株間遺傳相似性系數差異也較大；第二簇群包括：SD-2gh、SD-2gf、SD-1a、SD-2d、SD-1e、HB-1b、SD-2b、SD-2a、SD-1d、SD-2ee分離自河北、山東的10株O. oeni，菌株間遺傳相似性系數差異小，遺傳多樣性單一；第三簇群僅有SD-2h一株，其與其他兩個簇群的相似系數僅有0.45。研究結果表明AFLP在O. oeni基因分型研究中具有很高的分辨率。

圖3 中國葡萄酒產區O. oeni的AFLP指紋圖譜聚類分析Fig.3 UPGMA dendrogram derived from AFLP patterns of 22 O. oeni isolated from Chinese wines

3 討 論

本研究采用了目前最為高效和可靠的方法對從中國葡萄酒產區分離的22株O. oeni進行了鑒定。同時首次發展了采用HindⅢ和MseⅠ兩種限制性內切酶進行酶切的高重現性的O. oeni的AFLP分析方法。

種特異性PCR和16S rRNA序列分析相結合是目前從種的水平上對O. oeni進行鑒定最高效和可靠的方法，被廣泛應用于O. oeni的鑒定。Lòpez等[22]從204株葡萄酒分離菌株中鑒定得到201株O. oeni；Cappello等[5]從葡萄酒中分離得到220株乳酸菌，鑒定出其中87株為O. oeni。本研究從107株葡萄酒分離菌株中鑒定得到22株O. oeni。

由于O. oeni菌株間差異較小，所以靈敏并且可靠的菌株區分方法對于O. oeni的分類鑒定非常重要。一些經典的分子生物學方法已經被應用于O. oeni的分類鑒定研究中。在這些方法中，PFGE顯示出強大的菌株區分能力[23-24]，但是PFGE對操作者的技術和設備有較高要求，而且其工作量很大，這些限制了其的廣泛應用[25-26]。RAPD技術快速、實驗成本低并且容易操作，然而PCR擴增的固有缺陷使得RAPD的實驗結果在不同實驗室間重現性差[17,27]。AFLP是一項非常有用的技術，它集合了PFGE和RAPD的優點，被證明是細菌包括乳酸菌種內菌株間基因分型的最佳技術[26,28-29]。到目前為止，在有限的O. oeniAFLP研究中仍然使用傳統的EcoRⅠ和MseⅠ兩種內切酶，但研究表明，EcoRⅠ和MseⅠ作為識別富含A+T序列的內切酶，更適用于分析G+C含量低的基因組DNA。在常用的限制性內切酶中，HindⅢ顯示出適用于消化G+C含量在40%～50%（物質的量百分比）左右的基因組DNA，MseⅠ則被選用于消化G+C含量低于50%的基因組DNA，O. oeni基因組的G+C含量在40%左右，所以HindⅢ和MseⅠ會是分析O. oeni基因組的完美組合。研究結果也表明以HindⅢ和MseⅠ為內切酶的O. oeniAFLP分析技術具有高擴增效率、高分辨率、高重現性的特點，而且以聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染體系作為檢測手段的AFLP技術對設備要求不高，適合于絕大多數實驗室應用。

目前，AFLP的檢測手段已發展為毛細管電泳檢測，采用專門的軟件進行數據分析，這大大提高了AFLP分析的效率，所以以HindⅢ和MseⅠ為內切酶的AFLP分析技術是分析O. oeni遺傳多樣性的有效工具。

本研究中，22株O. oeni菌株可分為3個簇群，第一簇群包含的菌株最多，簇群內菌株間遺傳多樣性豐富，可能跟菌株來源的多樣性有關（分別來源河北、陜西、山東）。第二簇群內菌株間遺傳多樣性單一，可能跟菌株來源單一有關（90%來源于山東）。第三簇群只有一株來源于山東煙臺的SD-2h，其與其他21株菌株之間遺傳相似性系數較低，遺傳距離較遠，說明來源于同一地區的菌株間也有可能遺傳差異很大，可能跟葡萄與葡萄酒微生態有相關性。

葡萄酒酒精發酵結束后，不同品種，甚至于不同發酵罐的葡萄酒酒精體積分數、溫度、營養物質都不盡相同，這些微生態環境會影響葡萄酒中細菌的種類、數量、細菌不同基因的表達等，進而影響葡萄酒的品質。所以需要更深入的研究來揭示生態地理和葡萄酒生態與釀酒微生物之間的關系。

參考文獻：

[1] 李華. 現代葡萄酒工藝學[M]. 2版. 西安∶ 陜西人民出版社, 2000∶68-80.

[2] CLAIRE L M, ELISABETH B, ALINE L F. Tolerance to high osmolality of the lactic acid bacterium Oenococcus oeni and identification of potential osmoprotectants[J]. International Journal of Food Microbiology, 2007, 115(3)∶ 335-342.

[3] RENOUF V, DELAHERCHE A, CLAISSE O, et al. Correlation between indigenous Oenococcus oeni strain resistance and the presence of genetic markers[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2008, 35(1)∶ 27-33.

[4] du PLESSIS H W, DICKS L M T, PRETORIUS I S, et al. Identification of lactic acid bacteria isolated from South African brandy base wines[J]. International Journal of Food Microbiology, 2004, 91(1)∶ 19-29.

[5] CAPPELLO M S, STEFANI D, GRIECO F, et al. Genotyping by amplified fragment length polymorphism and malate metabolism performances of indigenous Oenococcus oeni strains isolated from Primitivo wine[J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 127(3)∶ 241-245.

[6] ZAVALETA A J, MARTINEZ-MURCIA A J, RODRI GUEZVALERA F. Intraspecific genetic diversity of Oenococcus oeni as derived from DNA fingerprinting and sequence analyses[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1997, 63(4)∶ 1261-1267.

[7] HIRSCHH?USER S, FR?HLICH J, GNEIPEL A, et al. Fast protocols for the 5S rDNA and ITS-2 based identification of Oenococcus oeni[J]. FEMS Microbiology Letters, 2005, 244(1)∶ 165-171.

[8] ZAPPAROLI G, TORRIANI S, PESENTE P, et al. Design and evaluation of malolactic enzyme gene targeted primers for rapid identification and detection of Oenococcus oeni in wine[J]. Letters in Applied Microbiology, 1998, 27(5)∶ 243-246.

[9] MARIA A S, MARIA G B, GIOVANNI S. Isolation and characterization of Oenococcus oeni from Aglianico wines[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2008, 24(9)∶ 1829-1835.

[10] ZAPPAROLI G, REGUANT C, BORDONS A, et al. Genomic DNA fingerprinting of Oenococcus oeni strains by pulsed-field gel electrophoresis and randomly amplified polymorphic DNA-PCR[J]. Current Microbiology, 2000, 40(6)∶ 351-355.

[11] LI Hua, ZHANG Chunhui, LIU Yanlin. Species attribution and distinguishing strains of Oenococcus oeni isolated from Chinese wines[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2006, 22(5)∶ 515-518.

[12] de las RIVAS B, MARCOBAL A, MU?OZ R. Allelic diversity and population structure in Oenococcus oeni as determined from sequence analysis of housekeeping genes[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70(12)∶ 7210-7219.

[13] DELAHERCHE A, BON E, DUP? A, et al. Intraspecific diversity of Oenococcus oeni strains determined by sequence analysis of target genes[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2006, 73(2)∶ 394-403.

[14] MELANIE L, HARALD C, HELMUT K. Pulsed-field gel electrophoresis for the discrimination of Oenococcus oeni isolates from different wine-growing regions in Germany[J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 123(1/2)∶ 171-176.

[15] CAPPELLO M S, ZAPPAROLI G, STEFANI D, et al. Molecular and biochemical diversity of Oenococcus oeni strains isolated during spontaneous malolactic fermentation of Malvasia Nera wine[J]. Systematic and Applied Microbiology, 2010, 33(8)∶ 461-467.

[16] CAPPELLO M S, STEFANI D, LOGRIECO A, et al. Bio-molecular characterisation of indigenous Oenococcus oeni strains from Negroamaro wine[J]. Food Microbiology, 2014, 42∶ 142-148.

[17] VOS P, HOGERS R, BLEEKER M, et al. AFLP∶ a new technique for DNA fingerprinting[J]. Nucleic Acids Research, 1995, 23(21)∶4407-4414.

[18] 張帆, 王建華, 劉立恒, 等. 嗜酸乳桿菌的培養條件及其生物學特性[J].食品與發酵工業, 2005, 31(3)∶ 43-46.

[19] 金剛. 中國葡萄酒主產區酒酒球菌的鑒定及SE-AFLP分析[D]. 楊凌∶ 西北農林科技大學, 2010∶ 17.

[20] KLIJN N, WEERKAMP A H, de VOS W G. Detection and characterization of lactose utilizing Lactococcus subsp. in natural ecosystems[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1995, 61(2)∶788-792.

[21] 盧圣棟. 現代分子生物學實驗技術[M]. 2版. 北京∶ 中國協和醫科大學出版社, 1999∶ 101-104.

[22] L?PEZ I, TENORIO C, ZARAZAGA M, et al. Evidence of mixed wild populations of Oenococcus oeni strains during wine spontaneous malolactic fermentation[J]. European Food Research and Technology, 2007, 226(1/2)∶ 215-223.

[23] LECHIANCOLE T, BLAIOTTA T, MESSINA D, et al. Evaluation of intra-specific diversities in Oenococcus oeni through analysis of genomic and expressed DNA[J]. Systematic and Applied Microbiology, 2006, 29(5)∶ 375-381.

[24] VIGENTINI I, PICOZZI C, TIRELLI A, et al. Survey on indigenous Oenococcus oeni strains isolated from red wines of Valtellina, a cold climate wine-growing Italian area[J]. International Journal of Food Microbiology, 2009, 136(1)∶ 123-128.

[25] GIAMMANCO G M, MAMMINA C, ROMANI C, et al. A Evaluation of a modified single-enzyme amplified fragment length polymorphism (SE-AFLP) technique for subtyping Salmonella enterica serotype Enteritidis[J]. Research in Microbiology, 2007, 158(1)∶ 10-17.

[26] DIMITROV Z P, MINKOVA S, MICHAYLOVA M. Comparative evaluation of three molecular typing methods in their applicability to differentiate Lactobacillus strains with human origin[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2008, 24(8)∶ 1305-1312.

[27] SALMINEN S, ISOLAURI E, SALMINEN E. Clinical uses of probiotics for stabilizing the gut mucosal barrier∶ successful strains and future challenges[J]. Antonie Van Leeuwenhoek, 1996, 70(2/4)∶ 347-358.

[28] RICO A, ORTIZ-BARREDO A, RITTER E, et al. Genetic characterization of Erwinia amylovora strains by amplified fragment length polymorphism[J]. Journal of Applied Microbiology, 2004, 96(2)∶ 302-310.

[29] HONG Y, GARCA M, LEVISOHN S, et al. Differentiation of Mycoplasma gallisepticum strains using amplified fragment length polymorphism and other DNA-based typing methods[J]. Avian Diseases, 2005, 49(1)∶ 43-49.

Genetic Diversity Analysis of Oenococcus oeni Strains Isolated from Chinese Wines

JIN Gang1, WANG Hua1,2,3, ZHANG Ang4, LI Hua1,2,3,*
(1. College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. Heyang Experimental Demonstration Station, Northwest A&F University, Heyang 715300, China; 3. Shaanxi Engineering Research Center for Viti-Viniculture, Yangling 712100, China; 4. Qinhuangdao Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Qinhuangdao 066004, China)

Oenococcus oeni(O. oeni)is considered as the key processer of malolactic fermentation (MLF), which will influence wine quality. Indigenous microorganisms are increasingly considered as one of the factors influencing the quality of individual wines. In order to understand the genetic diversity ofO. oeni, species-specific PCR and 16S rRNA sequence were used to identify 22 bacterial strains isolated from wines from different producing regions in China. Amplified fragment length polymorphism (AFLP) based onHindIIIandMseI was developed to analyze the genotypes of 22O. oenistrains.The results of species-specific PCR and 16S rRNA sequence analysis showed that the 22 isolates wereO. oeni. Double restriction enzyme digestion and ligation system, PCR reaction system, polyacrylamide gel electrophoresis were developed to analyzeO. oeni. The combinations of 16 AFLP primers were tested. The results showed that HT-MA, HT-MT, HT-MC, HG-MA, HG-MT, and HC-MT were the optimal primer combinations for analyzingO. oeni. The 22O. oenistrains were analyzed by AFLP, and cluster analysis indicated that the 22O. oenistrains fell into three groups and their genetic similarity was low. In conclusion, AFLP is a good method to genotypeO. oeniby usingHindIIIandMseI. TheO. oenistrains in China have very rich genetic diversity. The genetic similarity ofO.oenistrains is related to their ecological geographic distribution and other factors.

Oenococcus oeni; species-specific polymerase chain reaction; 16S rRNA sequence; amplified fragment length polymorphism (AFLP)

TS261.1

1002-6630（2015）17-0134-06

10.7506/spkx1002-6630-201517026

2015-01-13

國家自然科學基金面上項目（31471708）

金剛（1984—），男，博士研究生，研究方向為釀酒微生物。E-mail：gjinwine@hotmail.com

*通信作者：李華（1959—），男，教授，博士，研究方向為葡萄與葡萄酒學。E-mail：lihuawine@nwsuaf.edu.cn