苦丁茶冬青苦丁茶提取物與3,5-雙咖啡酰奎尼酸對腸道微生物體外發酵的影響

謝旻皓，王晴川，徐冬蘭，劉天囡，孫 怡*，曾曉雄

苦丁茶冬青苦丁茶提取物與3,5-雙咖啡酰奎尼酸對腸道微生物體外發酵的影響

謝旻皓，王晴川，徐冬蘭，劉天囡，孫 怡*，曾曉雄

（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

制備苦丁茶冬青苦丁茶的水提物和醇提物，并通過HP-20大孔樹脂層析和半制備色譜分離純化得到苦丁茶多酚中含量較高的3,5-雙咖啡酰奎尼酸（3,5-dicaffeoylquinic acid，3,5-diCQA）組分。運用體外厭氧發酵和熒光原位雜交技術，探究了苦丁茶提取物和3,5-diCQA對腸道微生物菌群的影響，并測定了發酵體系中短鏈脂肪酸和乳酸的含量。結果表明，苦丁茶冬青苦丁茶水提物、醇提物和3,5-diCQA能促進雙歧桿菌、乳酸菌/腸球菌的生長，同時抑制溶組織梭狀菌、普雷沃勒氏菌的生長；與空白對照相比，它們還能促進甲酸、乙酸和丙酸的生成，但對丁酸的合成沒有影響。因此，苦丁茶冬青苦丁茶及3,5-diCQA具有一定的調節腸道微生態的作用。

苦丁茶冬青苦丁茶；多酚；3,5-雙咖啡酰奎尼酸；腸道微生物

苦丁茶是一類中國傳統代茶飲料的統稱，在我國已有2 000多年的飲用歷史[1]。它廣泛分布于我國海南、廣西、浙江、貴州、福建、江西等省份，涉及12個科13個屬共30多種植物，主要包括木犀科苦丁茶和冬青科苦丁茶兩大類[2]。冬青科苦丁茶包含苦丁茶冬青（Ilex kudingchaC.J. Tseng）、大葉冬青（I. latifoliaThunb）以及枸骨（I. cornutaLindl）等。目前苦丁茶市場上主流的商品原植物為苦丁茶冬青、大葉冬青和粗壯女貞（Ligustrum robustum（Roxb.）Blume）[3]。苦丁茶富含多酚類、萜類、黃酮類、多糖等活性物質，具有清熱、解毒、消腫止痛、除煩解渴、除風祛濕、降血糖、降血脂、降血壓、抗血栓、活血脈等藥理功能[4-7]。苦丁茶冬青富含的多酚類物質具有抗氧化活性并且被證明是咖啡酰奎尼酸類化合物（caffeoylquinic acids，CQAs）[8]。冬青科苦丁茶中的主要多酚是CQAs，包括3-O-咖啡酰奎尼酸（3-CQA）、4-O-咖啡酰奎尼酸（4-CQA）、5-O-咖啡酰奎尼酸（5-CQA）、3,5-O-雙咖啡酰奎尼酸（3,5-diCQA）和4,5-O-雙咖啡酰奎尼酸（4,5-diCQA），與木犀科苦丁茶中所含有的多酚成分完全不同[9]。

膳食中的多酚在經過小腸時，大約只有5%～10%左右能夠被吸收，而剩余絕大部分的多酚類物質會進入大腸，與腸道微生物發生作用[10]。腸道微生物是人體消化系統的重要組成部分，其菌群組成高度復雜、多樣，它們廣泛地參與機體中食物的消化吸收、免疫調節以及抵抗病原微生物感染等生理過程，對機體正常生理功能的維持具有不可忽視的作用[11-12]。研究表明，腸道菌群的結構與肥胖存在密切關系。腸道菌群可以通過多種方式影響宿主能量的儲存機制，例如，腸道菌群可以將食物中機體本身不能夠消化吸收的物質轉化為短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）而為機體提供相應的能量，腸道菌群的存在還可以促進一些能量代謝有關酶的基因表達，如AMP活化蛋白激酶[13]。因此，腸道菌群在脂肪形成和堆積過程中發揮了重要作用。膳食多酚進入大腸后，會被腸道微生物進一步代謝，這可能是多酚發揮生物活性的方式[10]。近年來，關于腸道微生物轉化多酚的報道大量涌現，例如，綠原酸（5-CQA）會被代謝成咖啡酸、阿魏酸、二氫咖啡酸、二氫阿魏酸、3-（3-羥基苯基）丙酸等11種產物[14]。另一方面，膳食多酚也會影響腸道微生物的菌群結構。本課題組之前的研究表明，烏龍茶中的表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（gallocatechin-3-gallate，GCG）以及甲基化EGCG（EGCG3”Me）等兒茶素類能影響菌群組成[15]。但到目前為止，本課題組對膳食多酚與腸道微生物的交互作用以及多酚進一步對機體影響的了解還很有限。

本課題組建立了苦丁茶冬青苦丁茶CQAs的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析方法，并且通過大孔樹脂層析和半制備液相色譜制備了高純度的CQA單體[16]。本研究采用體外厭氧培養糞便中腸道微生物和熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization，FISH）的方法，探究苦丁茶冬青苦丁茶提取物和含量較高的組分3,5-diCQA對體外發酵菌群結構的影響，并分析相應發酵體系中SCFAs的產量。以期為闡述飲用苦丁茶冬青苦丁茶如何通過調節腸道微生態的方式影響機體健康提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料、試劑與培養基

苦丁茶冬青苦丁茶，購自海南椰仙生物科技有限公司。

序列5’端連接熒光基團吲哚二羧菁（Cy3）的16S rRNA寡核苷酸單鏈探針（探針名稱、靶菌種屬及探針序列見表1） 生工生物工程（上海）股份有限公司；刃天青、氯化血紅素、L-半胱氨酸、VK、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、甲醇（色譜純） 美國Sigma公司；90%低聚果糖（fructooligosaccharide，FOS）量子高科（中國）生物股份有限公司；大孔樹脂HP-20日本三菱公司；厭氧混合氣體（80%N2、10%H2和10%CO2） 南京特種氣體廠；4,6-聯瞇-2-苯基吲哚二鹽酸（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI） 德國Roche公司；其他化學試劑均為國產分析純。

表1 16S rRNA寡核苷酸單鏈探針Table1 Specific 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes

基礎培養基[17-18]：蛋白胨2.0 g/L、酵母膏2.0 g/L、NaCl 0.1 g/L、K2HPO40.04 g/L、KH2PO40.04 g/L、MgSO4·7H2O 0.01 g/L、CaCl2·7H2O 0.01 g/L、NaHCO32.0 g/L、氯化血紅素0.02 g/L、L-半胱氨酸0.5 g/L、膽汁酸鹽0.5 g/L、吐溫-80 2.0 mL/L、VK 10μL/L、0.25 g/L刃天青溶液4 mL/L。

1.2儀器與設備

AY-120型分析天平 日本Shimadzu公司；Heidolph Laborota 4000真空旋轉蒸發儀 德國Heidolph公司；?KTA Purifier蛋白純化系統 美國通用電氣公司；LyoQuest-55真空冷凍干燥機 西班牙Telstar公司；Agilent 1100高效液相色譜儀 美國Agilent公司；YQX-I型厭氧培養箱 上海躍進醫療器械廠；Zeiss Axio Imager A1型熒光正置顯微鏡 德國Carl Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1樣品的制備

苦丁茶冬青苦丁茶水提物的制備：稱取10 g粉碎過篩的苦丁茶冬青苦丁茶粉末，加入100 mL沸水（料液比為1∶10（m/V，下同）），并于95℃水浴中浸提30 min，浸提液經過5 000×g離心10 min后，取出上清液，濃縮、冷凍干燥得到粗提物。

苦丁茶冬青苦丁茶醇提物的制備：稱取一定量苦丁茶冬青苦丁茶粉末，按料液比1∶10加入70%乙醇溶液，80℃熱水浴浸提30 min，浸提液經過5 000×g離心10 min后，取出上清液，濃縮、冷凍干燥得到多酚粗提物。

3,5-diCQA的制備[16]：苦丁茶冬青苦丁茶水提物經過HP-20大孔樹脂吸附后，先后用2個柱床體積（BV）的水和70%乙醇洗脫。乙醇洗脫組分濃縮凍干后采用?KTA Purifier系統做進一步純化，純化流程使用YMC-PACK ODS-A色譜柱（10 mm×250 mm，5μm），檢測波長為280 nm，每次進樣200μL，流速為1.5 mL/min的40%甲醇洗脫。根據紫外檢測器的實時監控結果收集洗脫液，多次上樣后，將所需的3,5-diCQA收集起來，旋轉蒸發、濃縮凍干。

1.3.2腸道微生物體外發酵

選取3位受試者，年齡均為25歲左右，身體狀況良好、健康，且2個月內未服用過抗生素。收集受試對象的新鮮全便，混合均勻后稱取1 g并加入9 mL經脫氧處理的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），立即放入厭氧手套箱，旋渦振蕩混勻配制成糞便懸液。

稱取苦丁茶冬青苦丁茶水提物、醇提物、3,5-diCQA各15 mg，提前放在厭氧培養箱中，并加入1.35 mL滅菌的基礎培養基，渦旋振蕩至混勻后，加入150μL糞便樣液，放入37℃厭氧培養箱中進行發酵。在發酵0、12、24、36、48 h時，分別取150μL發酵液用于SCFA分析，100μL用于FISH統計菌數。各個處理設置3組平行，設置空白組不添加任何樣品，陽性對照組加入相同量的FOS。

1.3.3腸道菌群FISH計數

腸道菌群計數參照Vernazza[18]和Sánchez-Patán[19]等的方法并略作修改。將1.3.2節中得到的100μL發酵液放入離心管，各加入300μL過濾除菌的體積分數為4%的多聚甲醛，放入4℃冰箱固定16 h。菌體完成固定后，10 000 r/min離心10 min，除去上清液，經PBS兩次洗滌后用600μL緩沖液懸浮。

向經過鉻明膠預先包埋的10孔油漆示載玻片的圓孔內滴加6μL固定后的菌體懸液，放在陰暗通風處自然風干，再先后經過50%、80%和96%的乙醇脫水后自然晾干。

載玻片各孔滴加10μL探針溶液，迅速放入含有雜交緩沖液（含5%NaCl、0.1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）的20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.2）的不透光濕盒中。雜交10 h以上，雜交溫度分別為：50℃（Bif164、Chis150）、45℃（Lab158、Bac303）和37℃（Erec482）。雜交結束后，用清洗緩沖液（含5%NaCl的20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.2）清洗2次，再用超純水清洗，除去未雜交上的探針、緩沖液和SDS，最后避光晾干。測定總菌時，滴加10μL1.25 ng/μLDAPI染液于雜交后的載玻片上，染色10 min，用超純水清洗，避光晾干。

觀察計數前，在載玻片上滴加護色液，蓋上蓋玻片。使用Zeiss Axio Imager A1型熒光正置顯微鏡觀察，并使用AxioVision熒光成像系統隨機選取5～9個視野拍照。采用Image J軟件進行圖像分析，記錄每個視野中的熒光點數，即該探針特異性雜交的細菌，從而進行菌體計數。通過視野范圍內的映光點數以及稀釋倍數，算出不同樣品處理和對照組發酵液中不同種屬微生物的數量。

1.3.4 SCFAs和乳酸的測定

腸道微生物體外發酵產生的SCFAs和乳酸采用HPLC測定。色譜條件：C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相A相為超純水，B相為100%甲醇，洗脫梯度：0～10 min，10%～30%B，10～15 min，30%B；檢測波長為210 nm；柱溫為30℃；流速為0.8 mL/min，進樣量20μL。分別配制濃度梯度在20～100 mmol/L范圍內的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸標準溶液，分別以其濃度為橫坐標，對應色譜峰的峰面積為縱坐標，繪制各酸的標準曲線。

1.4統計分析

2 結果與分析

2.1苦丁茶提取物純度

一定量的苦丁茶茶粉經熱水浸提，濃縮和凍干，得到苦丁茶水提物。由于水提物中含有一定量茶多糖、生物堿、脂類、蛋白質類等雜質，所以另用70%乙醇溶液浸提苦丁茶茶粉，降低雜質的含量，同時保持苦丁茶中CQA類物質的含量不受影響。用Folin-酚法測定苦丁茶粉末浸提得到的水提物，多酚含量達到10.33%；醇提物中，多酚含量達到18.11%。經過大孔樹脂、半制備色譜分離純化之后，得到的3,5-diCQA產量較高；經HPLC分析，純度在95%以上。

2.2苦丁茶提取物和3,5-diCQA對腸道菌群和總菌的影響

厭氧糞樣混合培養法在研究食源性物質對腸道菌群的影響時被廣泛運用，主要是該方法取自健康人體的糞便中包含了所有的人體腸道菌群，同時體外厭氧糞樣混合培養評價系統具備發酵時間短、用量少、操作簡便、定量準確等優點。此外，本實驗采用FISH技術對菌體數目進行測定。帶有熒光標記的特異性寡核苷酸探針，能靶向結合已經固定的菌體細胞DNA，當這種特異性的雜交完成后，特定的菌體帶有了熒光，通過熒光顯微鏡捕捉熒光信號，從而對菌體進行觀察和計數。由于人體糞便中包含所有腸道菌群，在體外模擬腸道厭氧發酵，可以初步探究樣品對腸道菌群的作用。圖1為空白對照和苦丁茶醇提物發酵12 h后，使用不同探針對發酵樣液進行FISH處理或DAPI染色后，熒光顯微鏡下觀察的結果。

圖1 不同探針雜交以及DAPI染色后熒光顯微鏡下對照組和苦丁茶醇提物體外發酵后各菌群的照片（1 000×） 00Fig.1 Images of microbial communities cultured in vitro in the presence of Kudingcha ethanol extract after FISH or DAPI dying under fluorescent microscope (1 000×)

由圖1可知，苦丁茶冬青苦丁茶提取物對不同腸道微生物菌群體外發酵有顯著影響。總體來說，苦丁茶冬青苦丁茶提取物和3,5-diCQA能促進不同發酵時間下雙歧桿菌（Bifidobacteriumspp.）、乳酸菌/腸球菌（Lactobacillus/Enterococcusspp.）的生長，而抑制了溶組織梭狀菌（Clostridium histolyticum）、普雷沃勒氏菌（Bacteroides-Prevotellaspp.）的生長，對雙歧桿菌的生長效果尤其明顯，對總菌的數目沒有顯著影響（P＞0.05）。苦丁茶不同提取物樣品在不同發酵時間對雙歧桿菌的增殖效果如表2所示。與空白對照組相比，12、36、48 h時，苦丁茶水提物、醇提物、3,5-diCQA及陽性對照組均對雙歧桿菌起到促進增殖的顯著效果（P＜0.05）。與12 h相比，36 h時苦丁茶水提物樣品開始對雙歧桿菌有顯著的促進增殖作用（P＜0.05），而醇提物和3,5-diCQA在24 h時對雙歧桿菌的增殖有顯著促進效果（P＜0.05），其后，醇提物組的雙歧桿菌仍有增殖趨勢，而3,5-diCQA組的雙歧桿菌則在36 h開始有下降趨勢。

表2 不同發酵時間后雙歧桿菌生長情況Table2 Numbers of Bififi dobacterium in anaerobic fermentation broth

雙歧桿菌和乳酸菌/腸球菌屬是益生菌，具有增強免疫、阻止有害菌黏附以及幫助宿主消化吸收營養物質等多種生理功能[20-21]。雖然擬桿菌門微生物廣泛參與了多糖、膽汁酸和類固醇物質的代謝，對維持腸道功能有重要作用，但其中的普雷沃勒氏菌屬數量異常增高與潰瘍性結腸炎和肥胖密切相關[22-23]；溶組織梭狀菌和球形菌是腸道中參與代謝的重要菌群，但它們數量過多也會增加腸道潰瘍和結腸癌的風險[24-27]。普雷沃勒氏菌和溶鏈梭菌數量增多還會破壞人體腸道菌群的平衡，引起感染、腹瀉、痢疾等疾病[28-29]。苦丁茶冬青苦丁茶提取物以及3,5-diCQA能夠促進雙歧桿菌和乳酸菌/腸球菌等益生菌的增殖，抑制溶組織梭狀菌、普雷沃勒氏菌的增殖，表明苦丁茶冬青苦丁茶具有一定的調節腸道微生態和益生的功效。據報道，各種膳食多酚具有調節腸道微生態結構的作用，如姜黃素可以降低糖尿病大鼠腸道中Melainabacteria的豐度，還可以減小厚壁菌/擬桿菌比例[30]；烏龍茶多酚可以促進雙歧桿菌、乳酸菌/腸球菌并且抑制溶組織梭狀菌、擬桿菌-普雷沃勒氏菌的生長[15]，表現出和苦丁茶冬青苦丁茶類似的作用趨勢。食品來源的成分有些可以被特定的菌群分解利用，促進該菌群的生長；有些多酚成分對特定菌群表現出毒性，從而導致其他耐受菌群豐度的提高[31]。這可能是苦丁茶冬青苦丁茶表現出腸道微生態調節作用的機制。

2.3苦丁茶提取物及3,5-diCQA對腸道微生物體外發酵SCFAs和乳酸產量的影響

添加了不同苦丁茶提取物的發酵體系中，各種SCFAs和乳酸的含量如表3所示。結果表明，除空白對照外，水提物、醇提物和3,5-diCQA在發酵至48 h后，甲酸產量最高，但與空白對照組相比，苦丁茶提取物以及3,5-diCQA對腸道微生物體外發酵的甲酸產量沒有顯著影響。加入苦丁茶冬青苦丁茶水提物培養48 h后，乙酸含量達到最高；苦丁茶醇提物組在發酵至36 h時乙酸含量達到最高，在發酵至48 h時，含量顯著下降；基礎培養基中僅添加3,5-diCQA，在0～36 h的發酵過程中，乙酸含量變化不顯著，發酵至48 h時，乙酸產量上升。苦丁茶冬青苦丁茶水提物和3,5-diCQA經過48 h發酵后，丙酸和乳酸含量達到最高且顯著高于空白對照，而醇提物在36 h發酵后，丙酸產量就達到最高。但是，腸道微生物體外發酵模型中，與腸道營養密切聯系的丁酸在添加了苦丁茶的體系中含量很低或沒有被檢測到。

表3 各種苦丁茶提取物對SCFAs和乳酸產量的影響Table3 Effects of Kudingcha extracts and 3,5-diCQA on production of SCFAs and lactic acid

SCFAs對腸道具有維持水電解質平衡、抗病原微生物和抗炎、調節菌群平衡及改善腸道功能、抗腫瘤和調控基因表達等重要作用[32]。膳食中的碳水化合物，尤其是抗性淀粉和膳食纖維，是腸道微生物發酵產生SCFAs的主要底物[33]。另外，SCFAs也是蛋白質降解和氨基酸發酵的產物。梭菌可利用多種氨基酸生成相應的有機酸[34]。在本實驗模型中，碳水化合物較少，而很多微生物生長在多酚的作用下被抑制，以致SCFAs尤其是丁酸的產生量有限。

其他文獻也報道，多酚可能引起腸道內微生物數量和種類的變化，改變微生物代謝及產酶的種類和數量；多酚代謝產物可與細菌細胞表面作用，抑制酶的活性，從而影響能量代謝[35]。綜合以上結果，可以初步判斷，苦丁茶冬青苦丁茶提取物及多酚可以改變腸道菌群結構和調節微生物代謝，具有一定的益生效果。

3 結 論

本實驗以苦丁茶冬青苦丁茶水提物、醇提物及3,5-diCQA單體為實驗樣品，通過體外模擬人體腸道厭氧環境，對糞樣中微生物群進行混合培養，使用FISH技術對菌群結構變化進行研究比較，并使用HPLC對培養過程中SCFAs的含量進行監控。結果顯示，添加了苦丁茶冬青苦丁茶提取物和3,5-diCQA的培養基中，雙歧桿菌等有益菌的數量在36 h內得到了一定的增長，溶組織梭狀菌、普雷沃勒氏菌等的生長被抑制。與空白對照組相比，實驗組的甲酸、乳酸、乙酸和丙酸含量都在0～36 h內呈升高趨勢，但丁酸產量很少。本研究結果表明，苦丁茶冬青苦丁茶對改善人體腸道微生態、調節腸道平衡具有一定的作用，其作用機制有待進一步研究。

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Comparative Study of the Effects on Colonic Microbiota Fermentation in vitro of Extracts from Ilex kudingcha C.J. Tseng and 3,5-Dicaffeoylquinic Acid

XIE Minhao, WANG Qingchuan, XU Donglan, LIU Tiannan, SUN Yi*, ZENG Xiaoxiong
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

We prepared aqueous and ethanolic Kudingcha extracts fromIlex kudingchaC.J. Tseng and3,5-dicaffeoylquinic acid,the main fraction of Kudingcha polyphenols, purified from the aqueous extract by HP-20 macroporous resin chromatography and semi-preparative chromatography. Anaerobic fermentation technology and fluorescencein situhybridization were employed to investigate the effects of the Kudingcha extracts and 3,5-diCQA on fermentation characteristicsin vitroof the human gut mictobiota, and the production of short-chain fatty acids and latic acid during the culture we re also examined. The results showed that both Kudingcha extracts and 3,5-diCQA could promote the growthofBifi dobacteriumspp. andLactobacillus/Enterococcusspp., and inhibitBacteroides-Prevotellaspp. andClostridiumhistolyticumgroup. The concentrations of formic, acetic and proponic acids in cultures with Kudingch extracts were relatively higher than those of the control, but there was no difference in butyric acid. The results suggest that both Kudingcha fromI. kudingchaC.J. Tseng and its polyphenol 3,5-diCQA have potential prebiotic-like activity by modulating the intestinal microbiota.

Kudingcha; polyphenol; 3,5-dicaffeoylquinic acid (3,5-diCQA); colonic microbiota

TS272；TS201.3

1002-6630（2015）17-0124-06

10.7506/spkx1002-6630-201517024

2014-12-22

國家自然科學基金面上項目（31171666）；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目

謝旻皓（1990—），男，博士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：2014208020@njau.edu.cn

*通信作者：孫怡（1966—），女，高級實驗師，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：zengxx@njau.edu.cn