亞麻籽中木脂素及其水解產(chǎn)物的分離、鑒定和抗氧化活性

李 欣，何 敏，袁建平，王江海,*

（1.廣東科貿(mào)職業(yè)學院生物技術系，廣東 廣州 510430；2.中山大學海洋學院，廣東省海洋資源與近岸工程重點實驗室，廣東 廣州 510006）

亞麻籽中木脂素及其水解產(chǎn)物的分離、鑒定和抗氧化活性

李 欣1,2，何 敏1，袁建平2，王江海2,*

（1.廣東科貿(mào)職業(yè)學院生物技術系，廣東 廣州 510430；2.中山大學海洋學院，廣東省海洋資源與近岸工程重點實驗室，廣東 廣州 510006）

采用快速柱層析和制備薄層色譜相結合的新方法，從亞麻籽中分離木脂素開環(huán)異落葉松脂酚二糖苷和對香豆酸苷甲酯。同時發(fā)現(xiàn)，亞麻籽開環(huán)異落葉松脂酚二糖苷在酸水解時除生成開環(huán)異落葉松脂酚和無水開環(huán)異落葉松脂酚，還部分轉化為開環(huán)異落葉松脂酚單糖苷。從亞麻籽的酸水解產(chǎn)物中分離出6個化合物，分別鑒定為：開環(huán)異落葉松脂酚單糖苷、開環(huán)異落葉松脂酚、無水開環(huán)異落葉松脂酚、對香豆酸甲酯、阿魏酸甲酯和5-羥甲基糠醛；其中對香豆酸苷甲酯、對香豆酸甲酯和阿魏酸甲酯為首次從亞麻籽水解產(chǎn)物中分離獲得，分別由對香豆酸苷、對香豆酸和阿魏酸在水解時與甲醇發(fā)生酯交換形成。體外抗氧化測試結果表明，開環(huán)異落葉松脂酚二糖苷、開環(huán)異落葉松脂酚單糖苷和開環(huán)異落葉松脂酚對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（O2-·）均具有清除作用，且呈明顯的量效關系。

亞麻籽；木脂素；水解產(chǎn)物；抗氧化活性

木脂素是植物中廣泛存在的酚類化合物，是植物雌激素中的一類[1-2]。在所有谷物、豆類、蔬菜和水果中，亞麻籽（Linum usitatissimum）木脂素開環(huán)異落葉松脂酚（secoisolariciresinol，SECO）含量最高[3-4]。SECO在腸道微生物作用下可代謝為動物雌激素腸二醇和腸內(nèi)脂[5-6]。木脂素具有降低血清膽固醇及減少Ⅱ型糖尿病、乳腺癌、前列腺癌和直腸癌等發(fā)病風險的生物活性[7-10]。亞麻籽中的SECO與糖苷結合，以開環(huán)異落葉松脂酚二糖苷（secoisolariciresinol diglucoside，SDG）形式存在，SDG與3-羥基-3甲基戊二酸、對香豆酸苷、阿魏酸苷和草棉素糖苷等結合形成分子質量約為4 000 D的SDG聚合物[4,11-12]。亞麻籽木脂素在分離提取時需通過水解將其酯鍵和糖苷鍵打斷[13-15]。SDG聚合物在堿水解后，SDG會游離出來，然后通過酸水解或酶水解使糖苷鍵斷裂，從SDG中釋放出SECO；在酸性條件下，SECO中相鄰的兩個羥基會發(fā)生縮合而脫去一個水分子，生成無水開環(huán)異落葉松脂酚（anhydrosecoisolariciresinol，ASECO）[2,16]。研究發(fā)現(xiàn)，開環(huán)異落葉松脂酚單糖苷（secoisolariciresinol monoglucoside，SMG）是SDG在人類腸道微生物作用下脫掉糖苷生成SECO過程中的中間產(chǎn)物[4]；然而，在酸水解時是否產(chǎn)生SMG則未見報道。分離純化亞麻籽中木脂素的方法目前主要有反相高效液相制備色譜、高速逆流色譜、固相萃取和柱色譜等[11,17-20]。本實驗采用快速柱層析分離（flash columnar chromatography，F(xiàn)CC）和制備薄層色譜（preparative thin layer chromatography，PTLC）相結合的方法，從亞麻籽粉中分離制備了SDG純品。并對亞麻籽木脂素酸水解產(chǎn)物進行了分離和結構鑒定，明確了化合物間的轉化關系。通過測定SDG及其酸水解產(chǎn)物SMG、SECO、ASECO的體外抗氧化活性，為亞麻籽木脂素的高效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

亞麻籽粉（含SDG約40%） 湖南德瑞生物產(chǎn)業(yè)集團有限公司。

SECO（純度95%）、5-羥甲基糠醛（純度95%）美國Sigma-Aldrich公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 上海晶純實業(yè)有限公司；鄰苯三酚（焦性沒食子酸）、鄰二氮菲 上海國藥集團化學試劑有限公司；Tris-HCl生工生物工程（上海）股份有限公司；硅膠H（薄層層析用，粒度10～40μm） 青島海洋化工廠；可剪截型薄層層析板（鋁基硅膠G板） 天津市天河醫(yī)療有限公司；C18柱（500 mg/3 mL） 美國Supelco公司；PTLC板：玻璃板（20 cm×20 cm，2 mm）鋪10 g活化后的硅膠，硅膠層厚度約0.5 mm；制備柱（Φ＝20 mm，L= 30 cm）。

1.2儀器與設備

Alpha 1-4真空冷凍干燥儀 香港HUA-YEE儀器公司；Varian INOVA 500NB傅里葉變換超導核磁共振譜儀 美國Varian公司；雙聚焦磁質譜儀 英國VG公司；Muhiskan Spectrum全波長酶標儀 美國賽默飛世爾科技公司；732N紫外分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；Heidolph-4001旋轉蒸發(fā)儀 北京博勵行儀器有限公司；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠。

1.3亞麻籽堿水解產(chǎn)物的提取

稱取10 g亞麻籽粉，加入60 mL體積分數(shù)為70%的甲醇水溶液后提取3次；提取液合并后濃縮至約20 mL時進行堿水解（反應液NaOH濃度約為20 mmol/L）；在50℃水浴中保持1 h后，用醋酸調節(jié)pH值至5.0；低溫濃縮，加入無水硫酸鈉靜置過夜后，用甲醇洗滌回收；提取液經(jīng)減壓濃縮得到5.6 g浸膏，見圖1。取適量用少量乙醇溶解后，加入4倍量的硅膠吸附，再進行FCC。依次用150 mL乙酸乙酯-乙醇（8.5∶1.5，V/V）、100 mL乙酸乙酯-乙醇（8∶2，V/V）和50 mL乙酸乙酯-乙醇（7∶3，V/V）的混合溶液梯度洗脫，每20 mL洗脫液收集一管，分離過程用薄層色譜法監(jiān)控，合并組成類似的收集物，用PTLC純化（展開劑：乙酸乙酯-乙醇8∶2，V/V），純化后的樣品經(jīng)濃縮后進行冷凍干燥，得到2個化合物；其中化合物A為2.6 g，化合物B為290 mg。

1.4亞麻籽粉提取液水解產(chǎn)物的純化和鑒定

稱取20 g亞麻籽粉的甲醇提取物，加25 mL水溶解，堿水解后，在1 mol/L HCl條件下，于95℃水浴中振蕩3 h；再用乙酸乙酯萃取3次，收集水相用C18柱純化；甲醇洗脫回收SMG后，用PTLC純化[展開劑：乙酸乙酯-乙醇（8.5∶1.5，V/V）]，得到化合物1為白色固體，其質量約44 mg。有機相合并濃縮后，再用硅膠吸附、上樣；采用FCC分離，分別用乙酸乙酯-石油醚（5∶5，V/V），乙酸乙酯-石油醚（8∶2，V/V）和乙酸乙酯淋洗，收集合并組分類似的收集液；采用FCC和PTLC純化，得到化合物2（38 mg）、化合物3（47 mg）、化合物4（17 mg）、化合物5（14 mg）和化合物6（13 mg）5個化合物。過程見圖1。

圖1 亞麻籽SDG及主要水解產(chǎn)物提取路線Fig.1 Separation procedures of SDG and the main hydrolysates from flaxseeds

1.5 SDG及其酸水解產(chǎn)物的抗氧化活性測定

參照周先麗等[21]方法，采用酶標儀微量法和紫外-可見光分光光度法，以VC為陽性對照，分別測定SDG及其酸水解產(chǎn)物SMG、SECO和ASECO對DPPH自由基、羥自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（O2-·）的清除能力。上述實驗均設3次重復，計算清除率和半數(shù)清除率（IC50，Logit法計算）。

2 結果與分析

2.1亞麻籽堿水解產(chǎn)物的分離

劉大川等[18]采用硅膠柱層析甲醇-氯仿-冰醋酸混合溶劑洗脫分離木脂素。為了提高提取效率和木脂素的純度，本實驗采用乙酸乙酯-乙醇梯度洗脫FCC分離、PTLC純化亞麻籽木脂素SDG。通過液相色譜測定SDG峰面積占總峰面積的比例，確定SDG的純度約為96%。結合核磁共振和質譜分析結果，對SDG的結構進行了確認。該方法所需的儀器簡單，提取試劑無毒、無污染，提高了木脂素分離方法的安全性并降低了成本。

化合物A：白色無定形粉末；FAB-MSm/z686[M]+；1H NMR（CD3OD，500 MHz）δ：6.59（2H，d，J= 1.8 Hz，H-2, 2’），6.64（2H，d，J= 8.0 Hz，H-5, 5’），6.56（2H，dd，J= 1.8,8.0 Hz，H-6, 6’），2.61（2H，dd，J= 7.9,13.8 Hz，H-7, 7’a），2.68（2H，dd，J= 6.9,13.8 Hz，H-7, 7’b），2.12（2H，m，H-8, 8’），4.06（2H，dd，J= 5.6,9.9 Hz，H-9, 9’a），3.47（2H，dd，J= 6.4,9.9 Hz，H-9, 9’b），3.73（3H，s，OCH3），4.23（2H，d，J= 7.8 Hz，H-1a,1a’），3.21（2H，t，J= 7.8,9.0 Hz，H-2a, 2a’），3.25（2H，m，H-5a, 5a’），3.84（2H，brd，J= 2.3,11.8 Hz，H-6a-a/6a’-a），3.68（2H，dd，J= 5.5,11.8 Hz，H-6a-b/6a’-b）。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]報道的波譜數(shù)據(jù)一致，確定化合物A為SDG。

化合物B：白色無定形粉末；FAB-MSm/z343[M-H]+；1H NMR（CDCl3, 500 MHz）δ：7.55（1H，d，J= 8.7 Hz，H-2），7.12（2H，d，J= 8.8 Hz，H-3,5），7.55（1H，d，J= 8.6 Hz，H-6），7.65（1H，d，J= 15.8 Hz，H-7），6.41（1H，d，J= 16.0 Hz，H-8），3.77（3H，s，OCH3），4.844（1H，s，Aro-OH），4.96（1H，d，J= 7.3 Hz，H-1a），3.70（1H，dd，J= 2.8,10.4 Hz，H-6a），4.96（1H，dd，J= 2.4,9.8 Hz，H-6b）。根據(jù)1H-NMR和質譜分析結果，確定化合物B為Methyl CouAG。

研究表明，亞麻籽中的SDG與3-羥基-3甲基戊二酸連接構成亞麻籽多聚體結構的鏈狀骨架；對香豆酸苷和阿魏酸苷分別以酯鍵連接在該多聚體骨架上[4,22]。CouAG甲酯的形成說明堿水解后多聚體酯鍵斷裂，并使對香豆酸苷和阿魏酸苷的糖苷配基的—COOH基團暴露出來，與反應液中的甲醇發(fā)生酯交換，生成CouAG甲酯和阿魏酸苷甲酯。

2.2亞麻籽粉提取液酸水解產(chǎn)物的分離

SDG在體內(nèi)的代謝需借助特定的腸道菌群。若體內(nèi)缺失該菌群，則SDG不能被人體吸收利用。因此，對亞麻籽木脂素酸水解產(chǎn)物的鑒別非常必要，且具有重要的應用價值，有助于尋找更易吸收利用的木脂素衍生物。本實驗對亞麻籽粉的酸水解液進行了分離鑒定。水解液用乙酸乙酯萃取后，分別從水相和有機相中分離得到6種化合物，化合物結構如圖2所示。

化合物1：白色無定形粉末；其結構參數(shù)為：FAB-MSm/z524[M]+；1H NMR（CD3OD，500 MHz）δ：6.60（1H，d，J= 1.8 Hz，H-2），6.60（1H，d，J= 1.8 Hz，H-2’），6.65（2H，d，J= 7.9 Hz，H-5, 5’），6.56（1H，dd，J= 1.9,5.3 Hz，H-6），6.54（1H，dd，J= 2.0,5.3 Hz，H-6’）, 2.67（1H，dd，J= 7.3,13.6 Hz，H-7b），2.10（1H，m，H-8），1.94（1H，m，H-8’），4.05（1H，dd，J= 6.1,9.8 Hz，H-9a），3.47（1H，dd，J= 6.2,9.9 Hz，H-9b），3.64（1H，dd，J= 6.4,11.2 Hz，H-9’a），3.55（1H，dd，J= 6.0,11.0 Hz，H-9’b），4.21（1H，d，J= 7.8 Hz，H-1a），3.20（1H，t，J= 7.9,9.0 Hz，H-2a），3.23（1H，m，H-5a），3.84（1H，dd，J= 2.4,11.9 Hz，H-6a-a），3.68（1H，dd，J= 5.6,11.9 Hz，H-6a-b），3.74（3H，s，OCH3）；13C NMR（CD3OD，500 MHz） δ：134.0（C-1），133.8（C-1’），113.5（C-2），113.5（C-2’），148.7（C-3/3’），145.4（C-4/4’），115.7（C-5/5’），122.8（C-6），122.8（C-6’），35.9（C-7b），35.9（C-7a），35.5（C-7’a，7’b），41.4（C-8），43.9（C-8’），71.1（C-9a），71.1（C-9b），62.6（C-9’a），62.6（C-9’b），104.7（C-1a），75.2（C-2a），78.2（C-3a），71.7（C-4a），77.9（C-5a），62.8（C-6a-a），62.8（C-6a-b）和56.2（OCH3）。根據(jù)1H-NMR和13C-NMR譜及質譜（fast atom bombardment mass spectrometry，F(xiàn)AB-MS）數(shù)據(jù)，確定化合物1為SMG。Clavel等[5]發(fā)現(xiàn)，梭狀芽孢桿菌能使SDG脫去2個糖基形成SECO和脫去1個糖基形成SMG，本研究表明，在酸水解時SDG也能部分脫去糖基生成SMG。

化合物2：白色無定形粉末；與SECO標準品的多個溶劑系統(tǒng)進行薄層色譜鑒別，發(fā)現(xiàn)兩者的薄層色譜斑點Rf一致。用硫酸-乙醇顯色均呈藍色，結合1H-NMR譜和FAB-MS分析結果，確定化合物2為SECO。其結構參數(shù)為：FAB-MSm/z362[M]+；1H NMR（CD3OD，500 MHz）δ：6.59（2H，d，J= 1.9 Hz，H-2, 2’），6.66（2H，d，J= 7.9 Hz，H-5, 5’），6.54（2H，dd，J= 1.9,7.9 Hz，H-6, 6’），2.56（2H，dd，J= 7.5,13.7 Hz，H-7,7’a），2.66（2H，dd，J= 6.8,13.8 Hz，H-7, 7’b），1.90（2H，brd，J= 6.1 Hz，H-8, 8’），3.58（2H，m，H-9,9’a），3.31（2H，m，H-9,9’b），3.74（3H，s，OCH3）。

化合物3：白色無定形粉末；其結構參數(shù)為：FABMSm/z344[M]+；1H NMR（CDCl3，500 MHz）δ：6.84（2H，d，J= 1.7 Hz，H-2, 2’），7.13（2H，d，J= 8.0 Hz，H-5, 5’），6.92（2H，dd，J= 1.7,8.0 Hz，H-6, 6’），2.85（2H，dd，J= 7.8,13.8 Hz，H-7,7’a），2.92（2H，dd，J= 6.6,13.7 Hz，H-7,7’b），2.50（2H，m，H-8, 8’），4.25（2H，dd，J= 6.5,8.6 Hz，H-9,9’a），3.86（2H，dd，J= 5.6,8.7 Hz，H-9,9’b），4.16（3H，s，OCH3）。數(shù)據(jù)與文獻報道[8]數(shù)據(jù)一致，確定化合物3為ASECO。

化合物4：白色無定形粉末；其結構參數(shù)為：FAB-MSm/z179[M-H]+；1H NMR（CDCl3，500 MHz）δ：7.54（1H，d，J= 8.6 Hz，H-2），6.89（1H，d，J= 8.7 Hz，H-3），6.89（1H，d，J= 8.7 Hz，H-5），7.54（1H，d，J= 8.6 Hz，H-6），7.60（1H，d，J= 16.0 Hz，H-7），6.34（1H，d，J= 16.0 Hz，H-8），3.72（3H，s，OCH3）。1H-NMR譜和質譜分析結果表明，化合物4為Methyl CouA。

化合物5：白色無定形粉末；其結構參數(shù)為：FAB-MSm/z209[M-H]+；1H NMR（CDCl3，500 MHz）δ：7.32（1H，d，J= 8.6 Hz，H-2），6.87（1H，d，J= 8.7 Hz，H-5），7.14（1H，dd，J= 2.0,8.2 Hz，H-6），7.59（1H，d，J= 15.9 Hz，H-7），6.39（1H，d，J= 15.9 Hz，H-8），3.72（3H，s，OCH3），3.91（3H，s，AroOCH3）。1H-NMR譜和質譜分析結果表明，化合物5為Methyl FeA。

化合物6：白色無定形粉末；與5-HMF標準品的多個溶劑系統(tǒng)進行薄層色譜鑒別，發(fā)現(xiàn)兩者的薄層色譜斑點Rf一致。用硫酸-乙醇顯色均呈藍色，確定化合物6為5-HMF。5-HMF是己糖在酸性條件下的降解產(chǎn)物[23]。在SDG多聚體中含大量葡萄糖殘基[24]。前人在亞麻籽提取物中也曾分離出蔗糖[25]。5-HMF可能是亞麻籽中的己糖（如蔗糖等）或糖苷中的葡萄糖殘基經(jīng)酸水解形成的。

圖2 亞麻籽中SDG及其主要水解產(chǎn)物的結構Fig.2 Structures of SDG and its hydrolysates from flaxseeds

2.3 SDG及其酸水解產(chǎn)物的抗氧化活性

圖3 SDG、SMG、SECO和ASECO對DPPH自由基的清除作用Fig.3 Scavenging capability of SDG, SMG, SECO and ASECO against DPPH free radical

由圖3可知，SDG及其酸水解產(chǎn)物SMG、SECO和ASECO對DPPH自由基的清除率隨著質量濃度增加而增加，呈明顯量效關系，IC50分別為2.85、3.32、2.75 mg/L和4.86 mg/L（對照VC的IC50為3.34 mg/L）；對·OH的清除作用隨著質量濃度的增大，清除作用不斷增大（圖4），IC50分別為11.11、11.59、10.82 mg/L和19.88 mg/L（對照VC的IC50為11.90 mg/L）；對O2-·的清除能力同樣呈明顯的量效關系（圖5），IC50分別為7.40、8.25、6.91 mg/L和16.85 mg/L（對照VC的IC50為8.40 mg/L）。由此可見，木脂素SDG、SECO和SMG能夠有效清除自由基，具有較強的抗氧化活性。

圖4 SDG、SMG、SECO和ASECO對·OH的清除作用Fig.4 Scavenging capability of SDG, SMG, SECO and ASECO against hydroxyl free radical

圖5 SDG、SMG、SECO和ASECOO對的清除作用Fig.5 Scavenging capability of SDG, SMG, SECO and ASECO against superoxide anion radical

3 結 論

采用快速柱層析分離和制備薄層色譜相結合的方法，從亞麻籽粉中分離制備SDG，純度高，所用試劑無毒、無污染，提高了分離純化工藝的安全性和經(jīng)濟性。研究發(fā)現(xiàn)亞麻籽SDG在酸水解時除生成SECO和ASECO外，還會部分脫糖苷轉化為SMG。另外本實驗從水解產(chǎn)物中分離出對香豆酸苷甲酯、對香豆酸甲酯和阿魏酸甲酯，它們分別是亞麻籽多聚體中的對香豆酸苷、對香豆酸和阿魏酸在水解時游離，并與甲醇發(fā)生酯交換形成的。體外抗氧化活性研究表明，亞麻籽SDG及其酸水解產(chǎn)物SMG、SECO、ASECO在體外均有較好的抗氧化活性，且呈明顯的量效關系。有學者認為亞麻籽木脂素的抗腫瘤活性與它的抗氧化活性密切相關，需進一步明確亞麻籽木脂素成分在體內(nèi)的轉化及其抗氧化活性。

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Separation, Identification and Antioxidant Activities of Lignans and Their Hydrolysates in Flaxseeds

LI Xin1,2, HE Min1, YUAN Jianping2, WANG Jianghai2,*(1. Department of Biotechnology, Guangdong Vocational College of Science and Trade, Guangzhou 510430, China; 2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Marine Resources and Coastal Engineering, School of Marine Sciences, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510006, China)

In the present study, secoisolariciresinol diglucoside andp-coumaric acid methyl ester were separated from flaxseeds by a novel method combining flash column chromatography with preparative thin layer chromatography. Secoisolariciresinol diglucoside was transformed into secoisolariciresinol and anhydrosecoisolariciresinol or into secoisolariciresinol monoglucosides during the acid hydrolysis. Six compounds were isolated from the acid hydrolysates of flaxseeds, and were respectively identified as secoisolariciresinol monoglucoside, secoisolariciresinol, anhydrosecoisolariciresinol,p-coumaric acid methyl ester, ferulic acid methyl ester, and 5-hydroxymethyl-2-furfural on the basis of their spectral data.p-Coumaric acid glucoside methyl ester,p-coumaric acid methyl ester and ferulic acid methyl ester were separated for the first time from the flaxseed hydrolysates, which were produced by the transesterification ofp-coumaric acid glucoside,p-coumaric acid, and ferulic acid with methanol in hydrolysis. Interestingly, secoisolariciresinol diglucoside, secoisolariciresinol monoglucoside, and secoisolariciresinol had scavenging capabilities against 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical, hydroxy radical and superoxide aion radicals, and had a good dose-effect relationship between their concentrations and antioxidant activities.

flaxseed; lignans; hydrolysates; antioxidant activities

TS201.2

1002-6630（2015）17-0099-05

10.7506/spkx1002-6630-201517019

2014-11-30

教育部高等學校博士學科點專項科研基金項目（20090171110015）；廣東省科技攻關計劃項目（2013B020311005）

李欣（1980—），女，副教授，博士，研究方向為天然產(chǎn)物分離與應用。E-mail：lylx08@126.com

*通信作者：王江海（1965—），男，研究員，博士，研究方向為海洋生物學。E-mail：wangjhai@mail.sysu.edu.cn