水分含量對蓮子淀粉回生影響及分子動力學模擬分析

李雨露，劉小如，李紅艷，范亞葦，胡蔣寧，李 靜，王紅明，鄧澤元,,*

（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學高等研究院，江西 南昌 330031）

水分含量對蓮子淀粉回生影響及分子動力學模擬分析

李雨露1，劉小如1，李紅艷1，范亞葦1，胡蔣寧1，李 靜1，王紅明2，鄧澤元1,2,*

（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學高等研究院，江西 南昌 330031）

采用差示掃描量熱儀和X射線衍射儀對不同水分含量的糊化蓮子淀粉的回生特性進行研究。結果表明，水分含量是影響淀粉回生的重要因素，其過高或過低對蓮子淀粉的老化都有一定的抑制作用；當水分含量70%時，蓮子淀粉最易重結晶，體系老化程度最高；分子動力學模擬系統探討了不同水分含量淀粉老化模型的分子構象、水分子擴散系數、非共價鍵相互作用等參數的變化，發現在水分含量70%體系中，直鏈淀粉分子結構更趨于有序化、非共價鍵相互作用更強，這可在微觀層面解釋蓮子淀粉回生的機理。

蓮子淀粉；水分含量；老化；分子動力學

蓮子是睡蓮科蓮屬（Nelumbo nuciferaGaertn）植物的果實或種子，是我國重要的特產經濟資源，位于江西的廣昌和石城縣有著“中國白蓮之鄉”的美稱[1]。蓮子具有豐富的營養成分及生理活性成分[2-4]，是藥食兩用的滋補佳品，所以通過加工提高其附加值是產業發展的重要一環。但淀粉類食品易于回生，影響產品的食用品質。卓曉紅[5]的研究結果表明，天然的蓮子淀粉中包括直鏈淀粉和支鏈淀粉，其中直鏈淀粉的含量達42%，高直鏈淀粉含量使得蓮子制品更易回生，其硬度、口感、透明度、黏彈性等功能特性發生顯著變化，嚴重影響到加工后蓮子產品的品質。

淀粉的回生是一個淀粉分子從無序到有序的過程。完全糊化的淀粉，當溫度降到一定程度之后，由于分子熱運動能量的不足，體系處于熱力學非平衡狀態，分子鏈間借氫鍵相互吸引與排列，使體系自由焓降低，最終形成結晶[6]。影響淀粉回生特性的主要因素有水分含量、溫度、分子組成以及糖類和脂類等物質[7-10]。水作為一種增塑劑，它影響糊化后淀粉分子鏈的遷移，決定淀粉分子鏈重新聚合的速率。水分含量較低時，淀粉分子鏈的遷移困難；水分含量較高時，雖然淀粉分子鏈遷移速率提高，但由于濃度的降低，淀粉分子交聯纏繞和聚合有序的機會減少。周國燕等[11]的研究表明，水分含量60%～75%時，淀粉最易發生老化。

分子動力學（molecular dynamics，MD）模擬是在評估和預測材料結構和性質方面模擬原子和分子微觀領域的相互作用的重要方法，通過計算機對原子核和電子所構成的多體體系中的微觀粒子之間相互作用和運動進行模擬，按照統計物理的方法計算可得出物質的結構和性質等宏觀性能[12]。分子模擬在淀粉研究中已有十分廣泛的應用，張革新等[13]運用分子動力學的方法模擬了直鏈淀粉分子的結構；Yu Haibo等[14]運用分子動力學方法研究了甲基效應對直鏈淀粉和纖維素的穩定性和溶解自由能的影響；Sankri等[15]模擬了離子液體對直鏈淀粉的增塑，發現咪唑類離子液體對淀粉有很好的增塑作用；Xie等[16]運用分子動力學的方法模擬研究了單臂碳納米管與直鏈淀粉的非共價鍵結合作用。

雖然已有許多報道了關于水分對淀粉老化的影響，但對其微觀結構變化機理研究較少，本實驗擬采用差示掃描量熱儀（differential scanning calorimetry，DSC）和X射線衍射儀（X-ray diffractometer，XRD），研究不同水分含量對蓮子淀粉老化的影響上，通過分子動力學模擬不同水分含量直鏈淀粉分子構象參數，以及分子之間的非共價鍵作用，從分子微觀層面探討淀粉老化機理，以期為蓮子淀粉的加工和延緩淀粉制品的回生提供科學數據。

1 材料與方法

1.1材料

新鮮蓮子 江西廣昌白蓮基地。

1.2儀器與設備

SXT-06索氏提取器 上海洪紀儀器設備有限公司；DF101B數顯集熱式攪拌器 金壇市大地自動化儀器廠；FD-1真空冷凍干燥機 北京德天佑科技發展有限公司；200F3-DSC差示掃描量熱儀 德國Netzsch公司；DI SYSTEM X射線衍射儀 英國Bede科學儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1蓮子淀粉制備

采用水洗法提取蓮子淀粉。取去殼通芯的新鮮蓮子，與蒸餾水按體積比2∶3混合、打漿，過100目篩，將濾液靜置沉降6 h，去除上清液和底部淀粉雜質，加入蒸餾水攪勻，靜置過夜，倒掉上清液，收集沉降物，重復操作3次后收集沉淀，并于45℃鼓風干燥箱干燥，得淀粉粗品。

將粗制蓮子淀粉粉碎過40目篩，用乙醚在索氏抽提器中回流12 h，脫去脂肪。用質量分數為1%NaCl溶液洗3次，再用0.01%NaCl溶液洗一次脫去蛋白質。最后用蒸餾水洗3次后，45℃烘干至恒質量。

1.3.2淀粉老化樣品（retrogradated starch，RS）制備

將蓮子淀粉樣品與去離子水按一定比例，配制成淀粉質量分數分別為20%、30%、40%、50%的溶液，于室溫下在磁力攪拌計上攪拌2 h，使兩者充分混合。然后將混合液在沸水浴上加熱糊化30 min，并不時搖動，然后取出冷卻至室溫并于4℃貯存放置14 d。將老化后的樣品真空冷凍干燥，經粉碎機粉碎后過100目篩備用。

1.3.3熱力學分析

用液體坩堝稱取3 mg淀粉老化樣品，加入6μL去離子水，壓片密封，室溫下平衡24 h。然后放入差示掃描量熱儀中以5℃/min掃描速率從20℃升溫到90℃，觀察樣品老化峰以及對應溫度。以空坩堝作為空白對比，以氮氣作為載氣，流速為20 mL/min。結果由Proteus Analysis 4.8軟件進行分析，記錄和計算起始糊化溫度（T0）、峰值糊化溫度（Tp）、終止溫度（Tc）及熱焓值（ΔH）。

1.3.4 X射線衍射分析

采用X射線衍射儀測定淀粉老化樣品的結晶度。衍射條件40 kV，40 mA，XRD掃描范圍為5°～35°（2θ），掃描速率為2°/min。

通過軟件Origin 9.0分析X射線衍射圖譜，對晶體峰和非晶峰進行面積積分，以晶體峰面積與衍射峰總面積之比計算淀粉相對結晶度。

1.3.5分子動力學模擬

使用MD模型來模擬不同水分含量對直鏈淀粉老化的影響。采用Materials Studio 4.4軟件建立直鏈淀粉模型，每條直鏈淀粉的葡萄糖單元數目為10，整齊排列9條直鏈淀粉分子片段，能量最小化獲得最合理構型。然后采用Gromacs 4.0軟件建立盒子，通過調節盒子大小來調節體系溶劑分子數目，加入水分子填滿整個盒子，此時建立了水分含量為50%、60%、70%和80%的淀粉溶液模型。建立周期邊界條件和能量最小化后，進行平衡，最后進行分子動力學模擬。

模擬參數：采用GROMOS 53a6力場，積分方法為半步蛙跳法，LJ勢能截斷，PME算法處理靜電相互作用，LINCS算法約束成鍵相互作用，范德華力截斷半徑為14 ?。先從293 K（20℃）升溫3 ps到393 K（120℃），保持393 K時長2 ps，然后降溫到277 K（4℃），總模擬時間為4 ns。

對模擬結果進行分析，包括溶液可及表面積（solvent accessible surface area，SASA）、直鏈淀粉回轉半徑（radius of gyration，Rg）、分子結構密度分布、水分子擴散系數及非共價鍵相互作用。

溶液可及表面積表示分子表面與溶液接觸的面積，用來衡量分子構象變化，此分析主要通過分析指令g_sas來完成。

分子的回轉半徑是指分子微分質量假設的集中點到轉動軸間的距離，用來度量結構的緊密度，此分析主要通過分析指令g_ryrate來完成。

分子結構的密度分布是指分子沿著盒子主軸方向的密度分布，用來度量結構的緊密度，此分析主要通過分析指令g_density來完成。

分子動力學模擬求解擴散系數D主要是通過愛因斯坦關系式求得：

式中：r（t）代表t時刻分子的坐標；r（0）代表初始坐標。

均方位移（mean square displacement，MSD）隨模擬時間變化的函數如下：

由式（1）和式（2）可得到擴散系數D，如下式表示：

式中：m為均方位移曲線對時間t的斜率。即均方位移曲線的斜率m越大，水分子的擴散系數越大。這部分的分析主要通過分析指令g_sdf來完成。

非共價鍵作用能主要包括范德華力能（Evdw）、靜電力能（Eef）和氫鍵能（Eh-bond），這部分的分析主要通過分析指令g_energy來完成。

1.4數據分析

所有實驗均重復3次，采用SPSS 19.0統計分析軟件對實驗數據進行方差分析和顯著性檢驗，圖表繪制用Excel及Origin完成。

2 結果與分析

2.1蓮子淀粉的熱力學特性

淀粉回生形成的晶體結構重新熔融，則必需外加能量。因此，老化后的淀粉熱焓在DSC分析圖譜中為向上的吸熱曲線，且吸熱峰面積所表示的晶體融化的熱焓焓變（ΔH）與淀粉老化程度成正相關，因而DSC可作為淀粉老化程度的指標[17]。DSC測定結果見表1。當水分含量較低（50%）時，老化淀粉的熔融熱焓較低，隨著水分含量的增加，焓變值增大，在水分含量70%時達到最大值（ΔH=8.16 J/g），而當水分含量繼續增加達到80%時，淀粉的老化焓變值反而降低。結晶融化的峰值溫度和終止溫度均隨著水分含量的增高而降低。

表1 水分含量對老化淀粉熱力學性質的影響Table1 Effect of water content on thermal properties of RS

2.2蓮子淀粉晶體特性

糊化后晶體結構消失，在一定條件下存放，則會產生自組織現象，形成結晶，結晶度與淀粉的老化程度成正相關，因而可作為淀粉老化程度的指標[18]。蓮子淀粉的X射線衍射圖見圖1和圖2。從圖1可以看出，天然的蓮子淀粉既具有谷類淀粉的A型特征峰15°、23°，又具有塊莖類淀粉的B型特征峰5.6°、17°、22°、24°，表明蓮子淀粉顆粒的結晶結構是C型。天然蓮子淀粉結晶度為37.2%。

圖1 天然蓮子淀粉的X射線衍射圖譜Fig.1 X-ray diffraction patterns of native lotus seed starch

從不同水分含量的老化蓮子淀粉X射線衍射圖（圖2）可以看出，老化的蓮子淀粉結晶峰型發生改變，只在17°處有較明顯的特征峰，形成了B型結晶[17]。結晶峰型的改變主要的原因是體系中支鏈淀粉的長期回生引起的[19]。隨著水分含量從50%增加到70%，老化淀粉的結晶度也隨之增大，說明老化程度加深，隨后水分含量繼續增加（80%），淀粉結晶度反之降低。

圖2 不同水分含量老化淀粉的X射線衍射圖譜Fig.2 X-ray diffraction patterns of RS with different water contents

2.3分子動力學模擬分析

2.3.1直鏈淀粉分子模擬參數分析

在分子模擬中，模擬的體系必須處于平衡狀態才能夠得到體系準確的性質，故要求模擬時間必須足夠長。判斷分子動力學模擬體系達到平衡的標準有能量平衡，從圖3a可以看出，體系的總能量和總勢能在升溫過程中先降低再升高，又在降溫過程中急劇下降并迅速達到平衡，并且總能比初始狀態更低，說明體系已達到平衡，并處于相對穩定狀態。圖3b曲線表示直鏈淀粉周圍SASA隨時間的變化，SASA先迅速降低再平緩達到相對穩定值，SASA的減小說明模擬“老化”過程中淀粉鏈的分子構象趨于有序化[20]。圖3c曲線表示直鏈淀粉回轉半徑隨時間的變化，可以看出隨著模擬時間的延長，直鏈淀粉的回轉半徑減小，說明分子結構更加緊密、更趨于有序化。圖3d曲線表示直鏈淀粉的密度分布情況，曲線越窄越高，局部最大密度值越大，說明分子密度分布越集中，分子結構越緊密。

圖3 水分含量7700%體系分子動力學模擬參數Fig.3 MD simulation parameters of system with 70% water content

直鏈淀粉鏈的溶劑可及表面積變化越大，說明分子的有序化程度越高[9]，從表2可以看出，水分含量70%時ΔSASA達到最大值，說明此模型老化程度最高，這與DSC和X衍射獲得的淀粉老化規律數據相符。表2中水分含量70%的淀粉老化體系回轉半徑最小、最大局部密度最大，說明分子結構緊密度最高。綜上所述，老化體系分子結構緊密度為：70%＞60%＞50%＞80%。

表2 不同水分含量的老化淀粉結構參數變化Table2 Changes in structural properties of RS with different water contents

2.3.2水分子的擴散系數

圖4 不同水分含量直鏈淀粉模型的水分子均方位移Fig.4 Mean square displacement of water molecules in amylose models with different water contents

由圖4可知，水分含量70%的直鏈淀粉模型的水分子MSD曲線的斜率最小，水分含量80%的直鏈淀粉模型的水分子MSD曲線的斜率最大，水分含量50%和60%的直鏈淀粉模型的水分子MSD曲線斜率介于兩者之間。由方程式（3）計算可得水分子的擴散系數D大小為：80%＞50%＞60%＞70%。

2.3.3非共價鍵作用

在不同水分含量體系中，直鏈淀粉分子與分子之間的非共價鍵作用，即范德華力能、靜電力能、氫鍵個數的變化見表3。數據表明范德華力能和靜電力能在淀粉鏈回生過程中亦顯著增強，并為負值，氫鍵個數顯著增多，這表明這3組力促進淀粉鏈有序化過程，并主導維持直鏈淀粉-水體系低能態穩定性，且范德華力能變化遠遠大于靜電力能，這與Xie等[16]觀點一致，他們認為范德華力能是導致高聚物有序化的主導驅動力。在水分含量70%的體系中，非共價鍵能變化量最大、分子間形成氫鍵個數最多，即表明70%水分子含量更有利于直鏈淀粉分子有序化構象的保持。

表3 直鏈淀粉分子間非共價鍵作用Table3 Non-covalent interaction between amyloses

3 討 論

3.1熱力學性質

由于不同淀粉的組成不同，其老化峰的起始溫度、峰值溫度及熱焓值也不同，糊化的淀粉經貯存后發生不同程度的老化，在DSC曲線上可以對老化程度進行定量分析。因此DSC是研究淀粉老化特性的重要手段。當水分含量從50%增加到70%時，淀粉分子遷移速率加快，分子間重結晶的機率增加，因而回生程度增大。參與重結晶的水分子數量增多，晶體融化溫度降低。當水分含量達到80%時，雖然淀粉分子的遷移速率增加，但是由于濃度降低，淀粉分子之間的交聯機會減少，因而回生程度反而降低。同時由于參與結晶層的水分子數量增多，重結晶的融化溫度也降低[21]。

3.2淀粉老化過程中晶體結構的變化

淀粉老化的結果是糊化后的無序結構締合形成了結晶，結晶程度和晶體結構的緊密度反映了淀粉的老化程度。在水分含量70%的老化體系里，結晶程度最高、溶液可及表面積變化量最大、回轉半徑最小、局部密度最大，這些數據一致表明此時直鏈淀粉的分子結構最緊密，最趨于有序化，因此當水分含量70%時淀粉的老化程度最高。產生這種現象的原因還需從微觀的分子間的相互作用來闡釋。

3.3非共價鍵作用在淀粉老化中的作用

一般可以認為，水分子的擴散系數越大，越容易滲透到直鏈淀粉的內部，一方面，可以通過增大直鏈淀粉鏈與鏈之間的物理距離來減小淀粉分子的羥基之間形成氫鍵；另一方面，滲透到直鏈淀粉內部的小分子的羥基也可以與淀粉之間形成氫鍵，這同樣減小了淀粉分子之間形成氫鍵的概率[22]。由此可知，水分子擴散系數D越小，直鏈淀粉間更容易形成氫鍵，則淀粉的老化程度越高。

當水分含量從50%增加到70%時，水分子的擴散系數D減小，說明淀粉分子間形成的氫鍵數增多，因而直鏈淀粉老化程度加劇。可能的原因是淀粉逐漸由非玻璃態轉變為玻璃態，水分子對淀粉分子的束縛作用增強，變得不易擴散，導致水分子的擴散系數顯著減小。當水分含量繼續增加達到80%時，水分子的擴散系數D反之增大，說明水分子更易滲透到直鏈淀粉內部，阻礙直鏈淀粉分子間氫鍵的生成，因而淀粉老化程度降低。淀粉的回生是由分子間的非共價鍵作用引起的，其中Chung等[23]認為范德華力是聚合物結晶的主要驅動力，因為范德華力導致結構的有序化。當水分含量70%時，淀粉分子間的非共價鍵相互作用最強，淀粉的老化程度最高。

4 結 論

本實驗采用差示掃描量熱、X射線衍射和分子動力學模擬方法，從宏觀和微觀層面研究水分含量對蓮子淀粉老化特性的影響。研究表明：隨著水分含量的增加，老化淀粉的結晶熔融峰值溫度和終止溫度均降低。老化淀粉的老化熱焓、結晶度、淀粉分子結構的緊密程度和分子間非共價鍵作用都隨水分含量的增加先增大后減小。宏觀和微觀結果均表明水分含量70%的老化蓮子淀粉體系中，直鏈淀粉的分子構象更趨于有序化，老化程度更高。這是由于此時水分子的擴散系數減小，不容易滲透到直鏈淀粉內部，使得淀粉分子間更容易生成氫鍵，相互締合而形成結晶。由此可知，調節淀粉制品的水分含量來延緩淀粉老化是可行的方法之一。

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Effect of Water Content on the Retrogradation of Lotus Seed Starch and Molecular Dynamics Simulation Analysis

LI Yulu1, LIU Xiaoru1, LI Hongyan1, FAN Yawei1, HU Jiangning1, LI Jing1, WANG Hongming2, DENG Zeyuan1,2,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China;
2. Institute for Advanced Study, Nanchang University, Nanchang 330031, China)

The effect of different water contents on the retrogradation of lotus seed starch was studied by differential scanning calorimetry (DSC) and X-ray diffractometer (XRD). The experimental results indicated that water content was a significant factor affecting the retrogradation of starch.and that the aging of starch was inhibited when the water content was too high or too low. The lotus seed starch was most easily recrystallized with a water content of 70%, and the degree of retrogradation was highest. The changes in molecular conformation parameters, water diffusion coefficient, and noncovalent interaction of aging models with different water contents were analyzed using molecular dynamic (MD) simulation method. It was shown that molecular structure of amylose with water content of 70%tended to be more orderly arranged and had stronger non-covalent interaction. These observations could explain the mechanism of retrogradation of starch at the microcosmic level.

lotus seed starch; water content; retrogradation; molecular dynamics (MD)

TS231

1002-6630（2015）17-0083-05

10.7506/spkx1002-6630-201517016

2014-12-02

中國博士后科學基金項目（2014T70618）；國家自然科學基金面上項目（31301578）

李雨露（1991—），女，碩士研究生，研究方向為天然產物與功能食品。E-mail：sanmu713@163.com

*通信作者：鄧澤元（1963—），男，教授，博士，研究方向為天然產物與功能食品。E-mail：dengzy@ncu.edu.cn