一株柴胡紅景天中內生真菌的抗氧化活性

崔晉龍，郭婷婷,2，王俊宏，王夢亮,*

（1.山西大學應用化學研究所，山西 太原 030006；2.山西大學生物技術研究所，山西 太原 030006）

一株柴胡紅景天中內生真菌的抗氧化活性

崔晉龍1，郭婷婷1,2，王俊宏1，王夢亮1,*

（1.山西大學應用化學研究所，山西 太原 030006；2.山西大學生物技術研究所，山西 太原 030006）

對柴胡紅景天中一株具有抗氧化活性的內生真菌Rb-R-1進行研究，獲得其分類地位并評價抗氧化活性強弱。結果表明：這株真菌為Ascomacota門Hypocreales目Neonectria屬的N. ramulariae真菌，具有較強的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）、NO2-清除能力和Fe2+螯合能力，IC50值分別為8.86、4.40、9.65、16.53、1.91 mg/mL；其發酵產物中總酚和總黃酮含量分別達18.12、22.48 mg/g。發酵條件優化結果表明，在以乳糖為碳源、牛肉膏為氮源、裝液量90 mL/250 mL、pH 7.0、25℃條件下培養10 d時，內生真菌Rb-R-1發酵產物對DPPH自由基的清除率最大，達到93.12%；總酚和總黃酮含量最高，分別為19.14 mg/g和28.25 mg/g。

柴胡紅景天；內生真菌；抗氧化；發酵條件優化

高山植物紅景天（Rhodiola roseaL.）是2002年我國衛生部頒布的“關于進一步規范保健食品原料管理的通知（衛法監發[2002]51）”中規定的“可用于保健食品的物品”之一，也是世界許多民族長期使用的抗氧化植物藥和食品添加原料[1]。在我國，紅景天主要分布于海拔超過3 000 m的高寒、強紫外線輻射、多風的青藏高原等山區[2]，其主要化學成分有40多種，包括苯丙烷類、苯乙醇及它們的衍生物[2-3]如紅景天苷、酪醇等[3]，許多屬于酚類、黃酮類物質的范疇，這賦予了紅景天良好的以抗氧化和抗缺氧雙向調節為基礎的抗高山反應、抗衰老、抗疲勞等適應原活性[4]。

內生真菌，是生活于健康植物組織內部，不引起植物明顯病原特征的微生物[5]。在長期的共進化過程中，內生真菌與宿主共同應對各種生物與非生物脅迫，形成了專一性很強的共生關系[5-6]。自1993年Stierle等[6]從紅豆杉內生真菌Taxomyces andreanae中分離出紫杉醇以來，人們陸續從特定功能的藥用植物中分離出了類似功能的多種內生真菌[7]。因此，從特定藥理功能植物中尋找特定活性的內生真菌已成為尋找新天然產物的研究熱點[8]。

截至目前，大多數這樣的內生真菌來自于溫帶或亞熱帶植物[9]，而對高山、海洋等特殊環境中的植物，尤其是具有特定功能的珍稀植物研究很少[10]。尤其是對于紅景天內生真菌的研究，國內外均無報道。本實驗室對我國主要的紅景天品種——柴胡紅景天（Rhodiola bupleuroides）內生真菌進行了研究，獲得一株具有開發價值的抗氧化活性內生真菌，在明確其分類地位的基礎上，評價其抗氧化活性，為這一資源的進一步開發利用提供數據基礎。

1 材料與方法

1.1材料

柴胡紅景天于2012年9月采集于西藏米拉山口（海拔5 700 m，東經92 °22’50”，北緯29 °11’25”），由山西大學崔晉龍副教授鑒定為柴胡紅景天（R. bupleuroides）[11]。真菌Rb-R-1分離自柴胡紅景天的健康塊莖。以上材料與菌種均保藏于山西大學應用化學研究所。

1.2儀器與設備

PTX200聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；BX53攝影生物顯微鏡 日本Olympus公司；HEI-VAP/LR20旋轉蒸發儀德國Heidolph公司；CS/50CXII型高速冷凍離心機 日本Hitachi公司；UV2450型紫外-可見分光光度計 日本島津公司。

1.3方法

1.3.1真菌Rb-R-1的鑒定

形態學鑒定：將真菌Rb-R-1接種于察氏（Czapek’s，CZ）培養基平板上，28℃培養7 d，觀察菌落形態特征；挑取菌絲，在顯微鏡下觀察菌絲、孢子、產孢結構等特征，鑒定真菌Rb-R-1的屬種。

分子鑒定：采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取真菌R b-R-1的基因組D N A，用引物I T S 1（T C C G T A G G T G A A C C T G C G G）和I T S 4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）[12]對真菌rDNA-ITS進行PCR擴增，程序為94℃3 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，30個循環；72℃延伸5 min，4℃保藏。將PCR產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將序列提交至GenBank（http∶//www.ncbi. nlm.nih.gov/），進行BLAST比對，采用MEGA 4.0軟件進行相似菌種的Neighbor-Joining（NJ）遺傳樹構建，確定其遺傳關系，最終確定其屬種地位。

1.3.2內生真菌Rb-R-1發酵產物中總酚、總黃酮含量的測定

將純化好的內生真菌Rb-R-1接種于裝有100 mL液體CZ培養基的三角瓶（250 mL）中，25℃、120 r/min培養10 d，4層紗布過濾。收集濾液，10 000 r/min離心10 min，取上清液，加入5倍體積的95%乙醇，去除沉淀。上清液于45℃、8×103Pa條件下旋轉蒸發，獲得發酵液濃縮物，稱質量。加無菌去離子水定容為10 mg/mL的樣液，置于4℃條件下備用。

總酚含量的測定采用Fo lin-酚法[13]：配制0.05、0.10、0.15、0.25、0.50 mg/mL的沒食子酸對照品梯度溶液，分別移取1 mL于100 mL容量瓶中，加入60 mL水、5 mL Folin-酚試劑混勻；在0.5～8 min內，加入15 mL質量分數20%Na2CO3溶液，搖勻，去離子水定容；20℃放置2 h，于765 nm波長處測定吸光度，獲得標準曲線方程為y＝1.396 96x-0.001 28（R2＝0.999 9）。

總黃酮含量的測定采用蘆丁法[14]：分別移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL蘆丁對照品溶液（0.20 mg/mL）至10 mL容量瓶中，分別加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min；再加入10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min；最后加入10%NaOH溶液4.0 mL，去離子水定容后搖勻；放置15 min，在510 nm波長處測定其吸光度，獲得標準曲線方程為y＝8.238 19x-0.009 5（R2＝0.999 3）。

以1 mL樣液分別代替沒食子酸和蘆丁，通過上述方法和標準曲線方程計算出真菌發酵液粗提物中的總酚、總黃酮含量。

1.3.3內生真菌Rb-R-1發酵產物抗氧化能力測定

內生真菌Rb-R-1發酵產物的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力，亞鐵離子（Fe2+）螯合能力測定及計算參照文獻[15]的方法進行；亞硝酸根離子（NO2-）清除能力測定及計算參照文獻[16]的方法進行。

采用南京建成生物工程研究所研制的總抗氧化能力測定試劑盒對內生真菌發酵產物的總抗氧化能力進行測定。總抗氧化能力（U）定義為在37℃時，每分鐘每毫升待測液使反應體系的光密度（OD520nm）值每增加0.01為一個總抗氧化能力單位。根據下式計算內生真菌發酵產物的總抗氧化能力。

式中：OD0為空白對照組的光密度；ODi為樣品組或陽性對照組反應體系的光密度；發酵產物質量＝待測液體積/mL×待測液質量濃度/（mg/mL）。

以上實驗均設3次重復。O2-·清除能力測定實驗中以乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diamine tetraacetic aciddisodium salt，EDTA-2Na）為陽性對照，其余實驗均以VC為陽性對照。各抗氧化實驗中內生真菌Rb-R-1發酵產物的抗氧化能力以IC50值表示，其值越小，表明發酵產物的抗氧化能力越強。

1.3.4內生真菌Rb-R-1發酵條件的優化

1.3.4.1單因素試驗設計

以CZ培養基為菌種發酵的基礎培養基，以DPPH自由基清除率為評價指標，分別測定不同碳源、氮源、初始pH值、發酵溫度、裝液量、發酵時間對內生真菌Rb-R-1發酵產物DPPH自由基清除能力的影響。

分別選擇可溶性淀粉（C-A）、乳糖（C-B）、蔗糖（C-C）、葡萄糖（C-D）、麥芽糖（C-E）為內生真菌Rb-R-1發酵的碳源，添加量均為30 g/L；固定氮源為硝酸鈉、pH值為7.0、發酵溫度為30℃、裝液量為120 mL、發酵時間為8 d，測定發酵完成后產物的DPPH自由基清除率。

分別以酵母膏（N-A）、蛋白胨（N-B）、牛肉膏（N-C）、硝酸鈉（N-D）、氯化銨（N-E）為內生真菌Rb-R-1發酵的氮源，添加量均為3 g/L；固定碳源為乳糖、pH值為7.0、發酵溫度為30℃、裝液量為120 mL、發酵時間為8 d，測定發酵完成后產物的DPPH自由基清除率。

分別以5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0為內生真菌Rb-R-1發酵的初始pH值；固定碳源為乳糖、氮源為牛肉膏、發酵溫度為30℃、裝液量為120 mL、發酵時間為8 d，測定發酵完成后產物的DPPH自由基清除率。

分別以15、20、25、30、35、38℃為內生真菌Rb-R-1發酵的發酵溫度；固定碳源為乳糖、氮源為牛肉膏、pH值為7.0、裝液量為120 mL、發酵時間為8 d，測定發酵完成后產物的DPPH自由基清除率。

分別以30、60、90、120、150、180 mL為內生真菌Rb-R-1在250 mL三角瓶中發酵的裝液量；固定碳源為乳糖、氮源為牛肉膏、pH值為7.0、發酵溫度為25℃、發酵時間為8 d，測定發酵完成后產物的DPPH自由基清除率。

分別以4、6、8、10、12、14 d為內生真菌Rb-R-1的發酵時間，固定碳源為乳糖、氮源為牛肉膏、pH值為7.0、發酵溫度為25℃、裝液量為90 mL，測定發酵完成后產物的DPPH自由基清除率。

1.3.4.2正交試驗設計

以單因素試驗結果為基礎，進行正交試驗設計，以獲得最佳發酵條件。選取碳源量、氮源量、初始pH值、發酵溫度、裝液量5個因素，每個因素選取4個水平，利用DPS軟件設計L16（45）正交試驗，確定最佳發酵條件。在正交試驗獲得的最佳發酵條件下，進一步確定最佳發酵時間（分別培養4、6、8、10、12 d）。同時測定優化條件下發酵液中的總酚、總黃酮含量，以最終確定內生真菌Rb-R-1的最佳發酵條件。

1.4數據統計分析

抗氧化實驗中內生真菌Rb-R-1發酵產物的抗氧化能力數據采用SPSS Statistics 17.0分析完成。數據的差異顯著性采用DPS數據處理軟件，通過最小顯著差異法（least-significant difference，LSD）進行分析。

2 結果與分析

2.1內生真菌Rb-R-1鑒定結果

內生真菌Rb-R-1的菌落為黃褐色，表面菌絲黃白色，短絨狀，背面深橘黃色；分生孢子無色，圓柱狀，連續產生；分生孢子梗直，細長，無色，分支不規則。結合文獻[17]的報道，鑒定此菌為柱孢屬真菌（Cylindrocarponsp.），其菌落形態和顯微結構如圖1所示。對該菌進行rDNA-ITS測序，將測序結果提交至GenBank，獲得序列登錄號為KJ542260，與GenBank數據庫比對結果表明，該菌與Neonectria ramulariae（GenBank登錄號KM249079）具有100%的同源性和99%的相似性；另外，將該菌與GenBank數據庫中同源性高度相似的菌種進行NJ遺傳樹的構建，進一步確定了其遺傳關系（圖2）；結合前人研究成果[18]，最終確定N. ramulariae為C. obtusiusculum的有性型。因此，鑒定內生真菌Rb-R-1為N. ramulariae或C. obtusiusculum真菌。

圖1 內生真菌Rb-R-1的菌落（A）及顯微（B）形態特征Fig.1 Colony (A) and morphological (B) characteristics of Rb-R-1

圖2 基于rDNA-ITS序列構建的Rb-R-1與其相似序列菌株的NJ遺傳樹Fig.2 Neighbor-Joining tree of Rb-R-1 and its similar isolates based on their rDNA-ITS sequences

2.2內生真菌Rb-R-1發酵產物的抗氧化活性及總酚與總黃酮含量

通過6種抗氧化活性測定方法對內生真菌Rb-R-1的抗氧化能力進行了評價，由表1可知，內生真菌Rb-R-1發酵產物質量濃度與抗氧化能力成量-效關系。隨著發酵產物質量濃度的增大，其抗氧化能力逐漸增強，當發酵產物質量濃度為10 mg/mL時，其DPPH自由基清除率、·OH清除率、O2-·清除率、NO2-清除率、Fe2+螯合率、總抗氧化能力均達到最大值，分別為62.65%、79.99%、51.44%、28.00%、85.80%和4.72 U/mL。從IC50值可以看出，與陽性對照VC和EDTA-2Na相比，內生真菌Rb-R-1發酵產物的DPPH自由基、·OH、O2-·清除能力和Fe2+螯合能力較好。內生真菌Rb-R-1發酵產物中總酚和總黃酮的含量分別為18.12、22.48 mg/g；總抗氧化能力測定結果表明，在質量濃度為10 mg/mL時，內生真菌Rb-R-1發酵產物和VC的總抗氧化能力分別為4.72 U/mL和28.78 U/mL。

表1 不同質量濃度內生真菌Rb-R-1發酵產物的抗氧化能力Table1 Antioxidant activities of the fermentation supernatant of Rb-R-1 at different concentrations

2.3內生真菌Rb-R-1發酵條件優化結果

2.3.1單因素試驗結果

單因素試驗結果表明，不同單因素培養條件下，內生真菌Rb-R-1發酵產物對DPPH自由基的清除能力不同。

圖3 不同碳源對內生真菌Rb-R-1發酵產物DPPH自由基清除能力的影響Fig.3 Effects of different carbon sources on the DPPH radical scavenging-capacity of Rb-R-1 fermentation products

如圖3所示，不同碳源培養條件下，內生真菌Rb-R-1發酵產物對DPPH自由基的清除能力表現為乳糖（43.21%）＞蔗糖（37.69%）＞葡萄糖（36.40%）＞麥芽糖（35.91%）＞可溶性淀粉（32.53%）。

圖4 不同氮源對內生真菌Rb-R-1發酵產物DPPH自由基清除能力的影響Fig.4 Effects of different nitrogen sources on the DPPH radical scavenging-capacity of Rb-R-1 fermentation products

如圖4所示，不同氮源培養條件下，內生真菌Rb-R-1發酵產物對DPPH自由基的清除能力表現為牛肉膏（56.40%）＞蛋白胨（54.36%）＞酵母膏（48.70%）＞硝酸鈉（45.14%）＞氯化銨（43.28%）。

以乳糖和牛肉膏分別為碳源和氮源時，各單因素試驗結果（圖5～8）表明，當初始pH值為7.0、發酵溫度為25 ℃、裝液量為90 mL/250 mL、發酵時間為10 d時，內生真菌Rb-R-1發酵產物具有最高的DPPH自由基清除率，分別為64.65%、68.61%、70.08%和78.71%。

圖5 不同初始pH值對內生真菌Rb-R-1發酵產物DPPH自由基清除能力的影響Fig.5 Effects of different pH values on the DPPH radical scavengingcapacity of Rb-R-1 fermentation products

圖6 不同發酵溫度對內生真菌Rb-R-1發酵產物DPPH自由基清除能力的影響Fig.6 Effects of different fermentation temperatures on the DPPH radical scavenging-capacity of Rb-R-1 fermentation products

圖7 不同裝液量對內生真菌Rb-R-1發酵產物DPPH自由基清除能力的影響Fig.7 Effects of different medium volumes on the DPPH radical scavenging-capacity of Rb-R-1 fermentation products

圖8 不同發酵時間對內生真菌Rb-R-1發酵產物DPPH自由基清除能力的影響Fig.8 Effects of different fermentation times on the DPPH radical scavenging-capacity of Rb-R-1 fermentation products

2.3.2 正交試驗結果

表2 內生真菌Rb-R-1最佳發酵條件的正交試驗設計及結果Table2 Orthogonal array design with experimental results for optimal culture conditions of Rb-R-1

各因素對試驗結果影響極顯著（P＜0.01）。極差R值的大小表示該因素對試驗結果影響的大小，如表2所示，各因素對內生真菌Rb-R-1發酵產物DPPH自由基清除能力影響大小為：氮源量＞發酵溫度＞碳源量＞裝液量＞初始pH值。k值為不同發酵條件下同一因素相同水平下的DPPH自由基清除率平均值。取k值最大時對應的因素水平，即可得出最優組合為A1B1C3D2E2，即最佳發酵條件為碳源量（乳糖）20 g/L、氮源量（牛肉膏）1 g/L、初始pH 7.0、發酵溫度25℃、裝液量90 mL/250 mL。

進一步對試驗結果進行方差分析，結果如表3所示。因素A、B、C、D、E差異均達到極顯著水平（P＜0.01），表明這5個因素對內生真菌Rb-R-1發酵產物DPPH自由基清除能力的影響都較大。

表3 正交試驗結果方差分析Table3 Analysis of variance of the experimental results of orthogonal array dessiiggnn

以上述最佳發酵條件為基礎，再次進行最佳發酵時間測定的單因素試驗，結果表明，培養10 d后，內生真菌Rb-R-1發酵產物對DPPH自由基的清除率達到最大，為93.12%，明顯高于正交試驗優化前的單因素試驗結果。在上述最優發酵條件下，內生真菌Rb-R-1發酵產物中的總酚、總黃酮含量分別為19.14 mg/g和28.25 mg/g，均高于優化前的含量，表明正交試驗優化結果良好。

3 討 論

新叢赤殼屬（Neonectriasp.）真菌是叢赤殼科（Nectriaceae）的重要成員，物種較多。1999年，分類學家重新澄清了其屬的概念，認為它們的無性型均屬于柱孢屬（Cylindrocarpon）[19-20]。該真菌地理范圍分布很廣，遍布亞洲、歐洲、北美洲[21]。同時，Zhao Peng等[21]采用DNA條形碼（ITS rDNA、β-tubulin、EF-1α和RPB2）對該屬真菌的分類地位和遺傳關系進行了詳細總結。該真菌與宿主共生方式多樣，曾經作為蟲生真菌[22]、云杉小蠹蟲伴生真菌[21]、內生真菌[21,23]、植物病原菌[18]被廣泛分離和研究。而在本實驗中，此真菌作為內生真菌從柴胡紅景天中被分離出來，這為高山植物紅景天微生態群落的探討提供了依據。

該真菌作為植物內生真菌或菌根真菌從多種植物中分離出來，表現出了多種多樣的生物活性，是尋找天然產物的良好真菌資源。日本學者Shiono等[23]從糙米中分離了內生真菌N. ramulariae，經過研究發現其產生的兩種新堿Pyrrospirones A和B具有抑制急性早幼粒細胞白血病HL-60細胞增殖和誘導細胞凋亡的功能；另一項研究表明，N. ramulariae具有產生可以降解聚氨酯等塑料物質的酶的能力[24]。而在本實驗中，N. ramulariae被從以強抗氧化能力著稱的柴胡紅景天中分離出來，表現出強烈的抗氧化能力，這顯示出內生真菌與宿主在功能上的一致性，這為進一步豐富該真菌的功能多樣性提供了證據，也為從柴胡紅景天內生真菌中尋找新的天然抗氧化劑提供了可能。

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An Endophytic Fungus with Antioxidant Activity from Rhodiola bupleuroides

CUI Jinlong1, GUO Tingting1,2, WANG Junhong1, WANG Mengliang1,*
(1. Institute of Applied Chemistry, Shanxi University, Taiyuan 030006, China; 2. Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

In this study, we reported for the first time an endophytic fungus, named Rb-R-1, with antioxidant activity isolated and identified fromRhodiola bupleuroides. The isolate Rb-R-1 was affiliated toNeonectria ramulariaebelonging to the order Hypocrealesin the phylumAscomacota. The fungus possessed high scavenging activities against 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH),·OH, O2-·and NO2-radicals and Fe2+chelating activity, with half maximal inhibitory concentration (IC50) of 8.86, 4.40, 9.65, 16.53 and 1.91 mg/mL, respectively. The contents of total phenolics and total flavonoids in the concentrated culture supernatant of Rb-R-1 were 18.12 and 22.48 mg/g, respectively. The optimal culture conditions that provided maximal DPPH radical scavenging rate (93.12%) were determined as lactose as the carbon source, beef extract as the nitrogen source, initial pH 7.0, 90 mL of the medium in a 250-mL flask and 25℃. In the meantime, the maximal contents of total phenolics and total flavonoids of 19.14 and 28.25 mg/g, respectively, were obtained under these culture conditions.

Rhodiola bupleuroides; endophytic fungi; antioxidant; fermentation condition optimization

Q939.5

1002-6630（2015）17-0022-06

10.7506/spkx1002-6630-201517005

2014-11-03

國家自然科學基金面上項目（31270383）；2012年度高等學校博士學科點專項科研基金項目（20121401120001）；山西省自然科學基金項目（2014011029-1）

崔晉龍（1976—），男，副教授，博士，研究方向為珍稀藥用植物及藥用真菌資源開發。E-mail：cjl717@163.com

*通信作者：王夢亮（1966—），男，教授，博士，研究方向為藥物中間體合成及開發。E-mail：mlwang@sxu.edu.cn