土黨參多糖鐵配合物的制備及其理化性質

肖 雄，彭 梅，楊 娟*

（貴州省、中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州 貴陽 550002）

土黨參多糖鐵配合物的制備及其理化性質

肖 雄，彭 梅，楊 娟*

（貴州省、中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州 貴陽 550002）

以土黨參多糖（Campanumoea javanicapolysaccharide，CJP）和氯化鐵（FeCl3）為底物合成土黨參多糖鐵配合物（CJP-Fe3+）。采用鄰菲羅啉分光光度法測定配合物中鐵含量，分析配合物的理化性質、穩定性和還原性，通過紅外光譜法對其結構進行表征。結果表明：實驗制備的CJP-Fe3+為紅棕色無定型粉末，鐵含量達到22.81%；定性鑒定結果表明CJP-Fe3+中不存在游離的Fe3+，穩定性實驗結果顯示CJP與Fe3+形成了穩定的配合物，在空氣中不易分解。CJP-Fe3+在pH 3～12范圍內可以穩定存在，在此酸堿度范圍內配合物結構不會被破壞。CJP-Fe3+有望被開發為新型的補鐵劑。

土黨參多糖鐵配合物；理化性質；補鐵劑

土黨參為桔梗科金錢豹屬植物金錢豹（Campanumoea javanicaBl. subsp. japonica（Makino）Hong），民間以其根入藥，常用來燉雞、燉瘦肉等，具有補氣、止血、通乳等作用[1]。土黨參多糖（Campanumoea javanicapolysaccharide，CJP）由本課題組從土黨參根中提取得到，在土黨參中含量豐富且具有多種生物活性[2-5]。近年來不少學者利用生物多糖與鐵配合生成多糖鐵復合物，作為補鐵劑來治療缺鐵性貧血癥。許多以中藥或食品所含多糖作為配體的多糖鐵復合物如當歸多糖鐵[6]、香菇多糖鐵[7]、玉竹多糖鐵[8]、茶葉多糖鐵[9]、孔石莼多糖鐵[10]等見于報道。與傳統的補鐵劑相比，多糖鐵配合物具有穩定的高水溶性，能以分子形式被吸收，吸收率與硫酸亞鐵相當。無鐵離子存在，對胃腸黏膜無損害，補鐵劑在十二指腸被吸收且呈穩定的可溶狀態。多糖鐵具有很強的還原性，可被體內還原性物質（如VC等）還原成Fe2+吸收利用，符合理想補鐵劑的特點[11-16]。多糖鐵復合物具有很好的臨床療效，且不良反應少[17-20]。本實驗用土黨參多糖與氯化鐵（FeCl3）合成了土黨參多糖鐵配合物，分析了其含鐵量、穩定性、理化性質，用紅外光譜初步分析了土黨參多糖鐵配合物的結構特點，為土黨參多糖鐵配合物作為新型補鐵劑的開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

土黨參多糖（CJP）由本課題組從桔梗科金錢豹屬植物金錢豹（Campanumoea javanica）Bl.的根中提取得到。糖含量≥95%，分子質量2 900 D，為β-(2→1)-果聚糖。

透析袋（截留分子質量1 000 D） 上海綠鳥科技發展有限公司；FeCl3、K4[Fe(CN)6]、(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O、檸檬酸鈉、NaOH、無水乙醇、鄰菲羅啉、抗壞血酸、鹽酸羥胺等為國產分析純。

1.2儀器與設備

BUCHI-R220旋轉蒸發儀 美國GE公司；DZF-6021真空干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；C-MAG HS7磁力加熱攪拌器 德國IKA公司；AG285電子分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司；TDL-40C低速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；8453型紫外-可見分光光度計 美國惠普公司；FT-IR Vector-22傅里葉紅外光譜儀 德國Bruker公司。

1.3方法

1.3.1土黨參多糖鐵配合物的制備[21]

取100 mg干燥土黨參多糖（CJP）、500 mg檸檬酸鈉，混合加入到100 mL反應瓶中，加60 mL蒸餾水溶解，在70℃水浴中持續攪拌，同時緩緩滴加質量分數20%的NaOH溶液和2 mol/L的FeCl3溶液，控制二者的滴速并不斷檢測反應體系的pH值，使pH值始終維持在8.0～9.0左右。當反應液中剛好有不溶的紅棕色沉淀生成，立即停止滴加FeCl3和NaOH溶液，繼續攪拌反應1 h后趁熱4 000 r/min離心15 min，收集紅棕色的上清液，加3倍體積的無水乙醇攪拌均勻后，靜置24 h。離心收集沉淀并用蒸餾水溶解，加入到截留分子質量為1 000 D的透析袋中，流水透析24 h后再用蒸餾水透析24 h，減壓濃縮，60℃真空干燥后得紅褐色的土黨參多糖鐵配合物（CJP-Fe3+）。

1.3.2 CJP-Fe3+中鐵含量的測定

采用鄰菲羅啉比色法對CJP-Fe3+中鐵含量進行測定[22]。精密稱取0.702 3 g (NH4)2Fe(SO4)2·6H2O用少量純水溶解，加3.0 mL HCl，蒸餾水定容至1.0 L，得100 mg/L的Fe2+溶液，冷藏備用。取10 mL該溶液定容至100 mL，配制成10 mg/L的標準Fe2+溶液（現配現用）。

鐵含量標準曲線的繪制：精密量取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.5、3.0 mL Fe2+標準溶液，加入2.0 mL 10%抗壞血酸溶液和2.5 mL 0.1%的鄰菲羅啉溶液，用蒸餾水稀釋至10 mL，混合均勻后在37℃反應10 min，以蒸餾水加試劑溶液為空白，在510 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，Fe2+的質量濃度為橫坐標，在軟件上做出標準曲線。

CJP-Fe3+中鐵含量的測定：精密稱取3份CJP-Fe3+樣品20.0 mg置于25 mL（V1）容量瓶中，用蒸餾水溶解，定容至刻度，量取樣品溶液1.0 mL（V）至帶刻度試管中，加入10%抗壞血酸溶液2.0 mL和0.1%的鄰菲羅啉溶液2.5 mL，用蒸餾水定容至10 mL（V2），混合均勻后37℃靜置1.0 h，然后在510 nm波長處測定樣品溶液吸光度，將結果代入鐵含量標準曲線，計算出CJP-Fe2+中Fe2+的質量濃度ρ（mg/mL），按照下式計算CJP-Fe3+中鐵含量（S）。

式中：m為CJP-Fe3+樣品的質量/mg。

1.3.3 CJP-Fe3+的結構分析

紅外光譜分析：采用KBr壓片法，將完全干燥的CJP-Fe3+樣品與KBr按照1∶100（m/m）的比例混合，研磨成粉末狀后壓片，于紅外光譜儀上對樣品進行掃描，以空氣為空白吸收，掃描范圍為4 000～400 cm-1。

1.3.4 CJP-Fe3+的定性鑒定

CJP-Fe3+是在堿性條件下由土黨參多糖和FeCl3合成制備的，在此條件下，Fe(OH)3的生成是難以避免的，為了進一步確定生成的紅棕色粉末是多糖鐵配合物而非Fe(OH)3沉淀，參考2010版《中華人民共和國藥典（二部）》[23]中高價鐵鹽的鑒別方法，將合成得到的CJP-Fe3+和Fe(OH)3進行定性比較。

CJP-Fe3+溶液的配制：稱取干燥的紅棕色樣品粉末適量，加50 mL蒸餾水充分溶解，即得到CJP-Fe3+溶液。

Fe(OH)3溶膠的制備：將飽和FeCl3溶液滴加到50 mL沸水中，直至溶液變為紅褐色，得到Fe(OH)3溶膠。

分別量取CJP-Fe3+溶液和Fe(OH)3溶膠2 mL于試管中，觀察兩種溶液是否有丁達爾現象；加入3倍體積95%乙醇，觀察是否有醇沉現象；分別在兩支試管中加入NaOH、K4[Fe(CN)6]、KSCN溶液，觀察是否有沉淀產生。

1.3.5 CJP-Fe3+的穩定性實驗

將透析除鹽后的CJP-Fe3+溶于水，觀察加入K4[Fe(CN)6]后，水浴加熱至沸騰過程中，CJP-Fe3+溶液的顏色變化。

1.3.6 CJP-Fe3+的水解實驗

配制0.01 mg/mL的CJP-Fe3+溶液，用NaOH和HCl調節溶液的pH值，觀察CJP-Fe3+溶液變化情況。

1.3.7 CJP-Fe3+的還原性實驗

采用鄰菲羅啉比色法對CJP-Fe3+進行還原性實驗。配制Fe3+濃度為1.0 mmol/L的CJP-Fe3+溶液50 mL，分別量取CJP-Fe3+溶液5.0 mL于8個50 mL的容量瓶里，分別加NaOH溶液和HCl溶液，使溶液的pH值分別為1、2、3、4、5、6、7、8，然后分別依次加入10%抗壞血酸2.0 mL、0.1%鄰菲羅啉3.0 mL，定容至刻度，恒溫37℃水浴還原，然后每隔0.5 h取不同pH值條件下的反應液5.0 mL，在510 nm波長處測定吸光度，以不加CJP-Fe3+溶液為空白組。

2 結果與分析

2.1 CJP-Fe3+中的鐵含量

以Fe2+的質量濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度（A510nm）為縱坐標，得到標準曲線的回歸方程y＝197.93x-0.003 8（R2＝0.999 6）。在實驗所設定的Fe2+質量濃度范圍內線性關系良好，根據鐵含量計算公式，平行3次實驗，得到樣品的平均鐵含量為22.81%。結果表明鄰菲羅啉比色法測定CJP-Fe3+中的鐵含量具有操作簡單、結果穩定、誤差小的優點。

2.2 CJP-Fe3+結構分析結果

圖1 CJP（A）和CJP--ee3+（B）紅外光譜圖Fig.1 IR spectra of CJP (A) and CJP-Fe3+(B)

對CJP與CJP-Fe3+的紅外光譜進行比較。如圖1所示，CJP-Fe3+在865 cm-1和639 cm-1處的特征吸收峰與文獻[24]報道的β-FeOOH的特征吸收峰數據一致，說明CJP-Fe3+中鐵核是聚合的β-FeOOH結構。1 622 cm-1處為多糖內H—OH的吸收峰，此處的吸收峰明顯增強，說明多糖的—OH參與了絡合反應。在1 033 cm-1處的C—O—C伸縮振動及指紋區900～600 cm-1范圍內的峰形發生了變化，是多糖與鐵形成配合物所引起的。土黨參多糖與金屬離子絡合并沒有使多糖的結構發生改變，保留了多糖原來的特征吸收峰，3 422 cm-1處是多糖分子中O—H的伸縮振動吸收峰，2 926 cm-1處是多糖分子中C—H鍵[25]。紅外光譜圖顯示，土黨參多糖與FeCl3反應，形成了CJP-Fe3+。

2.3 CJP-Fe3+的定性鑒定結果

觀察結果顯示，合成所得產物是一種土黨參多糖與鐵的絡合物，而非Fe(OH)3沉淀，定性鑒定結果見表1。CJP-Fe3+溶液與Fe(OH)3溶膠的定性鑒定實驗現象有很大的區別，CJP-Fe3+溶液中沒有檢測到游離的Fe3+，而是生成了穩定的配合物，說明CJP-Fe3+的結構修飾是成功的。定性鑒定實驗結果充分說明了CJP-Fe3+和Fe(OH)3是完全不同的兩種物質。

表1 CJP--Fe3+定性鑒定實驗結果Table1 Qualitative identification of CJP-Fe3+

2.4 CJP-Fe3+的穩定性

CJP-Fe3+為紅棕色無定形粉末，易在水中溶解，而不溶于一般有機溶劑。透析除鹽后的CJP-Fe3+樣品溶于蒸餾水中，用K4[Fe(CN)6]對其水溶液進行檢測，結果未出現Fe3+的特殊反應現象，說明CJP-Fe3+形成了穩定的多糖鐵配合物，沒有游離的Fe3+存在，并且將CJP-Fe3+粉末長期（＞48 h）放置空氣中，用K4[Fe(CN)6]對其水溶液進行檢測，也未出現Fe3+的特殊反應現象，說明CJP-Fe3+形成了穩定的多糖鐵配合物。

2.5 CJP-Fe3+的水解性

配制0.01 mg/mL的CJP-Fe3+溶液，用NaOH溶液和HCl溶液調節溶液的pH值。在CJP-Fe3+溶液中滴加NaOH溶液，當溶液pH值達到12時，沒有混濁現象發生，繼續緩緩滴加NaOH溶液，有紅棕色沉淀生成，隨著pH值的不斷增大，沉淀增多。向CJP-Fe3+溶液中滴加HCl溶液，當溶液pH值降到3時，沒有混濁現象發生，繼續緩緩滴加HCl溶液，溶液中就會有少量的沉淀生成，隨著pH值的不斷減小，沉淀增多。結果表明，CJP-Fe3+在pH 3～12范圍內可以穩定存在。在pH≥12或者pH≤3時，CJP-Fe3+的結構被破壞，生成沉淀。

2.6 CJP-Fe3+的還原性

圖2 CJP--FFee3+被抗壞血酸還原的反應曲線Fig.2 Reduction curves of CJP-Fe3+by ascorbic acid

采用鄰菲羅啉比色法對CJP-Fe3+進行還原性實驗，測得不同pH值條件下各個時間點溶液的吸光度。由圖2可知，CJP-Fe3+中的鐵可以被抗壞血酸還原，而且A510nm在反應0.5 h時即趨于穩定，說明CJP-Fe3+中的Fe3+在0.5 h左右可以全部被還原成Fe2+。

3 結 論

以土黨參多糖和FeCl3為底物合成土黨參多糖鐵配合物，鐵含量可達到22.81%。評價補鐵劑生物利用度高低的主要指標之一是補鐵劑在機體中鐵的主要吸收部位——十二指腸（生理pH 6～7）中是否可溶[13]。CJP-Fe3+在pH 3～12范圍內均可溶且能夠穩定存在，配合物結構不會被破壞，說明其具有較高的生物利用度。定性鑒定結果表明CJP-Fe3+中不存在游離的Fe3+。穩定性實驗結果顯示CJP與Fe3+形成了穩定的配合物，在空氣中不易分解，因而土黨參多糖鐵應有較好的生物利用度，有望成為具有開發前景的生物活性補鐵劑。

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Preparation and Physicochemical Characterization of Campanumoea javanica Polysaccharides-Iron (Ⅲ) Complex

XIAO Xiong, PENG Mei, YANG Juan*(Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences, Guiyang 550002, China)

In this experiment,Campanumoea javanicapolysaccharide-iron (Ⅲ) complexes (CJP-Fe3+) were synthesized withCampanumoea javanicapolysaccharide and ferric chloride as substrates. The iron content of the complex was measuredby phenanthroline spectrophotometry and physiochemical properties, stability and reducing power were also investigated.Its structural characteristics were analyzed by infrared (IR) spectroscopy. The CJP-Fe3+complexes were obtained as a redbrown amorphous powder with an iron content of 22.81%. Qualitative identification experiments showed that there was nofree Fe3+detectedin CJP-Fe3+complexes. The complex was stable in the air and within a broad pH range from 3 to 12; thestructure of this complex in this pH range was not destroyed. Thus, CJP-Fe3+can be developed as a new iron supplementary.

Campanumoea javanicapolysaccharides-Fe3+complex; physicochemical properties; iron supplementary

R284. 3

1002-6630（2015）17-0013-04

10.7506/spkx1002-6630-201517003

2014-10-29

國家自然科學基金地區科學基金項目（81160513）

肖雄（1988—），男，碩士研究生，主要從事天然產物提取分離與活性研究。E-mail：382310002@qq.com

*通信作者：楊娟（1971—），女，研究員，博士，主要從事天然活性成分研究。E-mail：yangxz2002@126.com