吳曉東

（赤峰學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

1 引言

PCR（聚合酶鏈式反應(yīng)）技術(shù)是指在體外快速擴增DNA目的序列或特定基因的方法，因此又稱做基因的體外擴增法.PCR擴增技術(shù)正如DNA自我復(fù)制的自然過程，其特異性依賴于與靶基因目標序列兩端互補的寡核苷酸引物序列.PCR技術(shù)能快速簡便特異地檢測和擴增任何需要的目的基因或相關(guān)DNA序列片段，并能基于DNA細胞分子起始水平的目的基因擴增達到克級、微克、毫納克的特異性DNA目的基因片段，正因如此，PCR（聚合酶鏈式反應(yīng)）已經(jīng)被應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個領(lǐng)域迅速而廣泛的被采納.隨著PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用，早已成為了一項重要的“革命性的技術(shù)”，不僅推動了醫(yī)學(xué)遺傳與分子生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展，而且在臨床與其他診斷技術(shù)相結(jié)合，極大地提高了臨床醫(yī)學(xué)診斷技術(shù).

5-脂氧合酶（5-lipoxygenase 5-LO）是花生四烯酸代謝途徑中非常關(guān)鍵的一個酶，花生四烯酸的代謝產(chǎn)物白三烯（Leukotrienes LTs）可以引起支氣管痙攣、氣道變應(yīng)性炎癥和氣道高反應(yīng)性，其生物活性強烈、作用時間持久，是引起哮喘的主要炎性介質(zhì).5-LO基因含有14個外顯子，mRNA全長為2568bp，文獻[1-2]顯示該酶基因的多態(tài)性可能與哮喘病相關(guān)聯(lián)，其cDNA760位的G突變成A，760G>A位于第六個外顯子中，在基因庫中也有記載,其對應(yīng)的254位的氨基酸由帶負電荷的谷氨酸(E)突變成帶正電荷的賴氨酸(K)，這一單核苷酸多態(tài)性（SNP）引起了電荷的改變對酶的功能或者該酶與其他酶的相互作用都有可能受影響.5-LO基因抑制劑是治療哮喘的新方法以及治愈哮喘的有效藥物，它的作用機理是通過抑制5-LO基因的作用以阻遏其下游產(chǎn)物的產(chǎn)生，通過檢測哮喘病人的5-LO基因E254k突變位點，研究該位點突變與5-LO抑制劑的藥物反應(yīng)，對臨床治療哮喘意義重大.本文介紹了一種經(jīng)濟、簡便、快速檢測哮喘患者5-LO E254K的方法，因此值得推廣.

2 研究對象和方法

2.1 研究對象

正常對照是無過敏史的正常人，哮喘患者是經(jīng)臨床診斷且知情同意后的自愿者.

2.2 試劑與儀器設(shè)備

引物是由北京賽百盛基因技術(shù)集團有限公司生物合成、外周血中提取基因組DNA試劑盒購自北京百泰克生物集團技術(shù)有限公司、紅細胞裂解液購自北京索萊寶科技集團有限公司、瓊脂糖購自西班牙原裝進口、其它所需藥品和試劑均為國內(nèi)產(chǎn)品；電泳設(shè)備(北京六一儀器廠)、高速離心機、超微量分光光度計（NanoDrop 2000）、真空濃縮儀（VC-15SP）、全自動凝膠成像儀(Tocan240)、高壓滅菌鍋、低速離心機、渦旋混合儀、eppendorf移液器、PCR儀（ABI2720）等.

2.3 引物設(shè)計

表1-1 設(shè)計的引物

等位基因特異性PCR法是利用Taq酶缺乏3’-5’外切酶活性的特點，在突變型引物擴增正常DNA模板時，延伸反應(yīng)會因磷酸酯鍵難于形成而不能進行，也就得不到特異長度的條帶，從而表明模板DNA無此突變.反之，表明有突變產(chǎn)生.將突變型引物和非突變型引物分別用于同一DNA模板的擴增，判斷有無特定位點基因的特定突變[3].根據(jù)這一原理針對野生型和突變型設(shè)計3’端的堿基，一般倒數(shù)第二位的堿基設(shè)計故意錯配的堿基，用以提高引物的特異性[4].我們參考文獻[5]設(shè)計的引物見表1-1.設(shè)計的對照用左側(cè)引物為5LOEX8S，對照用右側(cè)引物為5LOEX8A，PCR產(chǎn)物為600bp；用于檢測5-LO野生型（Glu）的左側(cè)引物為5-LO 254W，用于檢測5-LO突變型（Lys）的左側(cè)引物為5-LO 254M，共用的右側(cè)引物為5-LO EX6A，PCR產(chǎn)物為301bp.

2.4 樣本的采集與處理

收集外周血標本，提取基因組DNA作為擴增反應(yīng)的模板，具體方法如下[6]

2.4.1 白細胞的分離：

血細胞中的紅細胞沒有細胞核，基因組DNA要在白細胞中提取，低滲溶血法，利用白細胞對低滲液的抗性差別很大，紅細胞在0.2%NaCL溶液中極易破裂，待紅細胞完全破壞后，離心得到白細胞沉淀.即3ml全血倒入10ml離心管（1500r,5min）;血漿移入2ml的離心管剩余加0.2%NaCl到10ml,混勻（2500r,5min），棄上清加 0.2%NaCl混勻(2500r,5min)棄上清，加1ml 0.2%NaCl吸打混勻，移入1.5ml離心管（1200r,1min）,吸上清并貼標簽-20℃保存[7].

2.4.2 基因組DNA的提取：

將上述白細胞從冰箱中取出，按基因組DNA提取試劑盒的說明操作，最后加入100ulDNA溶解液，混勻后測基因組DNA的純度和濃度.

2.5 PCR反應(yīng)體系和條件

2.5.1 PCR反應(yīng)體系

分A管和B管，分別加入野生型和突變型的引物，兩管中均加入對照用一對引物和共用的右側(cè)引物.反應(yīng)體系中加入 PCR mix(北京百泰克公司)：25μl；引物 5LO EX8S和5LO EX8A（10μM）各 1μl；引物 5-LO 254W(A管)/5-LO 254M(B管)和 5LOEX6A（10μM）各 1μl；模板（100-150ng/μl）:1μl；滅菌水：20μl，總體系 50μl.

2.5.2 PCR反應(yīng)條件

聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)是模擬生物體內(nèi)DNA自我復(fù)制過程，包括三個步驟，即變性、退火、延伸.變性：94-95℃加熱，使DNA雙螺旋打開，便于引物結(jié)合；退火：40-70℃使引物與模板DNA序列互補，形成雜交鏈；延伸72℃下按照堿基互補配對原則，在ToqDNA聚合酶作用下將dNTP依次加引物的3’端，直到新的DNA雙鏈形成，如此反復(fù)進行，經(jīng)30個循環(huán)可獲得230個拷貝數(shù)產(chǎn)物.本實驗中采用以下反應(yīng)條件見表1-2：95℃預(yù)變性5分鐘，然后按95℃30秒、56℃30秒、72℃1分鐘循環(huán)30次，末次循環(huán)后72℃延伸10分鐘，4℃保存.

表1-2 PCR反應(yīng)條件

2.6 瓊脂糖凝膠電泳

2.6.1 制備2%瓊脂糖凝膠

首先稱取瓊脂糖2.0g，加入三角瓶中，相繼再加1﹡TAE緩沖液100ml；然后放入微波爐加熱，取出后再依次煮沸、2-3次震蕩；制膠膜具、插好梳子；等到溶液膠冷卻到60%左右后（注意不要過涼而發(fā)生凝固），將瓊脂糖融化好后，慢慢傾入本實驗的電泳槽，此時樣品孔應(yīng)在在陰極端；最后向電泳槽中加入1xTAE緩沖液，膠面頁面高于1-2mm，瓊脂糖凝膠有效范圍如表1-3所示.

表1-3 瓊脂糖凝膠與的DNA分子的有效分離范圍

2.6.2 上樣

取PCR產(chǎn)物10μL，將吸頭垂直插入液面下，小心加入凝膠孔中；接通號電源，打開測試儀電源開關(guān)，直至出現(xiàn)氣泡（鉑金線為準）.

2.6.3 染色

凝膠結(jié)束后，將凝膠小心放入EB染液中浸泡30min,于Tocan240中觀察并分析，最后將結(jié)果保存.

3 結(jié)果

3.1 基因組DNA的濃度與純度測定結(jié)果

雙擊桌面NanoDrop2000軟件按鈕，選擇應(yīng)用Nucleic Acid;確定儀器是閉合狀態(tài)；取2μLDNA溶解液點在微量基座上，放上下臂點Blank進行空白對照；每次測量完成都要用吸水紙擦干凈.測量臺及上方的偵測部位；在SampleID位置輸入樣品名稱，取2μL混勻的樣品點在測量基座上，放上下臂，按Measure進行測量，測量結(jié)果如表1-4所示：

表1-4 基因組DNA濃度和純度測定

經(jīng)檢測后,OD260/280所有值都在1.80-2.0之間，則表明DNA的純度較高，濃度平均為598.6ng/ul，說明基因組DNA提取質(zhì)量較高，實驗結(jié)果可信.

3.2 凝膠電泳結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳：PCR擴增后取PCR產(chǎn)物10ul，進行2%的瓊脂糖凝膠電泳，鑒定PCR擴增的結(jié)果,取5ulDNA markerI作為標記，條帶分別為 600、500、400、300、200、100，見圖1.

圖1 等位基因特異性PCR法檢測5-LO E254K電泳結(jié)果

第1泳道為marker,A管加的是野生型引物，B管加的是突變型引物，第2和3泳道為同一個模板，結(jié)果顯示只有A管除了有內(nèi)參照物條帶外還有目的條帶，而B管未出現(xiàn)目的條帶說明為野生型GG；第4和5泳道為另一個模板，結(jié)果顯示為A管和B管除了有內(nèi)參照物條帶外都出現(xiàn)了目的條帶，說明是雜合突變型GA.

4 討論

研究SNPs常用的方法有測序法、酶切法和等位基因特異性PCR(allele-specific PCR,AS-PCR)法.測序法的優(yōu)點在于可以發(fā)現(xiàn)新的突變位點，當一個外顯子中含有多個（5個以上）SNP位點時，采用測序法比較經(jīng)濟有效且直接.當已知突變位點正好處于酶切位點時可以采用酶切法.本文介紹了等位基因特異性PCR法快速檢測5-LO基因E254K多態(tài)性的詳細步驟，本研究用的AS-PCR技術(shù)檢測重要的成敗因素在于其引物設(shè)計，利用由北京賽百盛基因技術(shù)集團有限公司合成的引物和相關(guān)的試劑，較為簡便地成功檢測了5-LO E254K突變基因，用該方法可以直接擴增分型，跟測序法和限制性內(nèi)切酶酶切法相比，具有經(jīng)濟、快速、簡便、易行等特點.特別適用于大批樣本單個位點的研究.

5-脂氧合酶是花生四烯酸代謝途徑非常關(guān)鍵的一個酶，其代謝產(chǎn)物白三烯是引起哮喘發(fā)作的一個重要的炎性介質(zhì).治療哮喘的新藥5-脂氧合酶抑制劑就是通過抑制5-脂氧合酶的作用以阻止下游產(chǎn)物白三烯的大量生成.檢測哮喘患者的5-LO E254K多態(tài)性，觀察該多態(tài)性對5-脂氧合酶抑制劑的藥物反應(yīng)，對臨床治療哮喘有非常重要的意義.本文介紹了一種快速檢測5-LO E254K多態(tài)性的方法，應(yīng)用該方法可以快速直接進行分型，區(qū)分不同基因型的標志性條帶都清晰可見，突變型和野生型條帶都很清晰，沒有雜帶，減少了人為誤差，電泳結(jié)果與測序結(jié)果完全吻合.我們經(jīng)過大批量的實驗已經(jīng)摸索出了非常成熟的條件，可以用于臨床快速檢測5-LO E254K多態(tài)性.

5 前景與展望

隨著傳統(tǒng)PCR（聚合酶鏈式反應(yīng)）技術(shù)及其衍生出來的技術(shù)方法和不斷發(fā)展創(chuàng)新的新型PCR檢測技術(shù)的出現(xiàn)，這些新技術(shù)已逐漸廣泛應(yīng)用到醫(yī)學(xué)基因疾病診斷和治療研究的各個領(lǐng)域.該技術(shù)與方法的不斷完善和創(chuàng)新，必然會導(dǎo)致醫(yī)學(xué)事業(yè)的蓬勃發(fā)展.同時對于臨床醫(yī)學(xué)來講，PCR技術(shù)應(yīng)用范圍將不斷的擴大和深入，PCR檢測技術(shù)在檢驗、醫(yī)學(xué)生物、診斷治療和其他各個領(lǐng)域的應(yīng)用都會發(fā)揮其重要的作用，例如在高通量的突變基因檢測方面具有極其重要的地位.同時未來的PCR研究主要會致力于在疾病的基因診斷的方法改進上，以及整合其他技術(shù)應(yīng)用，從而在未來臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和相關(guān)檢測和治療領(lǐng)域中產(chǎn)生質(zhì)的飛躍，促進醫(yī)學(xué)衛(wèi)生事業(yè)出現(xiàn)令人期待的應(yīng)用前景.而本研究對哮喘突變基因的檢測方法作為PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的一部分值得探討和推廣.

〔1〕Chunying B，Eiko M，Hidenori O，et al．A novel polymorphism，E254K，in the 5-lipoxygenase gene associated with bronchial asthma[J]．Intern J Molec Med，2008，21:139-144．

〔2〕Bai C(白春英),Yu X,Yun R,Shi T,Zhang C,Zhou J,Sachurangui,Tong L,Li X,Gao L.Association of 5-lipoxygenase gene polymorphisms with bronchial asthma.Exp Ther Med.2012,4(6):967-971.

〔3〕李春曉，張曉龍，曹曉梅，等.特異性等位基因PCR擴增技術(shù)檢測家蠅擊倒抗性相關(guān)鈉通道的基因突變[J].中國媒介生物學(xué)及控制雜志，2007，18（3）：255-256.

〔4〕徐克前.分子生物學(xué)檢驗技術(shù)實驗指導(dǎo)[M].人民衛(wèi)生出版社，2007.154-158.

〔5〕白春英，史鐵偉，瑞云，等.等位基因特異性PCR法檢測5-脂氧合酶基因多態(tài)性[J].山東醫(yī)藥雜志，2012，52（31）：28-29.

〔6〕白春英，周靜,瑞云，等.經(jīng)濟、有效提取外周血基因組DNA的方法[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床,2010(17):1795-1798.

〔7〕吳曉東，張博文，王博楠，等.應(yīng)用PCR技術(shù)擴增SRY基因檢測性別[J].赤峰學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2013，29(7)：138-141.