短柄五加果實(shí)多糖對果蠅非特異性刺激下生存函數(shù)的影響

李東波，周天林，肖朝霞，張博

（隴東學(xué)院甘肅省高校隴東生物資源保護(hù)與利用省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅慶陽745000）

短柄五加果實(shí)多糖對果蠅非特異性刺激下生存函數(shù)的影響

李東波，周天林，肖朝霞，張博

（隴東學(xué)院甘肅省高校隴東生物資源保護(hù)與利用省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅慶陽745000）

目的研究短柄五加果實(shí)多糖對果蠅非特異性刺激（冷、熱和重金屬）下生存函數(shù)的影響。方法用短柄五加果實(shí)多糖（0.00%、0.01%、0.05%、0.20%、1.00%）飼喂果蠅，然后分別置于冷（3℃）、熱（35℃）和重金屬（Cd、Cu、Pb）脅迫下，統(tǒng)計(jì)其不同時(shí)段死亡數(shù)。用Kaplan-meier模型建立對數(shù)生存函數(shù)并求得果蠅的平均生存時(shí)間、中位生存時(shí)間和最長生存時(shí)間。結(jié)果0.05%的短柄五加果實(shí)多糖使果蠅在高溫脅迫下生存能力提高27.3%、在低溫脅迫下生存能力提高18.6%，在鎘脅迫環(huán)境下生存能力提高91.7%，且不受果蠅身體素質(zhì)影響。結(jié)論短柄五加果實(shí)多糖可能具有提高動(dòng)物冷、熱適應(yīng)能力及解重金屬毒害的作用，為短柄五加進(jìn)一步的藥物和功能食品開發(fā)提供理論依據(jù)。

短柄五加多糖；果蠅；非特異性刺激；生存函數(shù)

短柄五加（Acanthopanax brachypus）是五加科五加屬藥食兩用植物。世界上僅我國西北部黃土高原區(qū)有少量分布，屬我國特有瀕危珍稀灌木[1]。五加科植物多具有重要的藥理活性，《本草綱目》記載“寧要五加一握，不要金玉滿車”。短柄五加根及莖皮具有益氣健脾、寧心安神、開郁活血等功效[2]。其根、莖等常用于治療神經(jīng)衰弱、男子性功能障礙、婦女更年期綜合征等疾病[3]。目前對短柄五加的研究主要集中在根莖化學(xué)成分[4，5]、生殖生物學(xué)和生態(tài)學(xué)方面[6]，而對其有效成分的藥理學(xué)研究相對不足。

五加科植物多糖常具有重要而明顯的生物活性，如抗衰老、抗腫瘤、增強(qiáng)對非特異性刺激的耐受性、免疫調(diào)節(jié)等，且低毒甚至無毒，是目前藥學(xué)研究的熱門之一[7]。通過文獻(xiàn)查新可知，由于短柄五加珍貴稀少，其果實(shí)多糖藥理活性目前尚未見相關(guān)報(bào)道。

果蠅是目前被研究透徹的模式生物之一，將其作為疾病模型進(jìn)行藥理活性研究和新藥開發(fā)已被國際認(rèn)可[8]。目前，果蠅已廣泛用于藥物抗衰老[7]、抗非特異性刺激等方面[9，10]。本研究以黑腹果蠅為動(dòng)物模型，研究短柄五加果實(shí)多糖對果蠅非特異性刺激下（高、低溫和重金屬）生存函數(shù)的影響，旨在為高效、合理開發(fā)短柄五加和新藥研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)及數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

短柄五加果實(shí)多糖（本實(shí)驗(yàn)室自制）、w1118野生型果蠅（Drosophila melanogaster）（隴東學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院遺傳學(xué)教研室提供）、乙酸鉛、氧化鎘、氯化銅、丙酸、乙醚、玉米粉、酵母膏、瓊脂、食品級白砂糖。

1.2 儀器與設(shè)備

MGC-300A型智能光照培養(yǎng)箱（北京中科浩宇科技發(fā)展有限公司），DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司），BS-223S電子精密天平（北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.3 果蠅實(shí)驗(yàn)

1.3.1 基本培養(yǎng)基和多糖培養(yǎng)基配制基本培養(yǎng)基采用瓊脂玉米培養(yǎng)基[11]：玉米粉28 g、白砂糖22 g、水150 ml，混勻加熱至糊狀；瓊脂2.5 g加入100 ml水中，加熱溶解，倒入玉米糊中，攪勻冷卻至室溫，加酵母膏2.5 g，丙酸2 ml，攪拌混勻，分裝至果蠅管中備用。多糖培養(yǎng)基：在基本培養(yǎng)基中添加短柄五加果實(shí)多糖溶液，制成終濃度為0.01%、0.05%、0.20%、1.00%的4個(gè)多糖培養(yǎng)基[12]。

1.3.2 果蠅飼養(yǎng)w1118野生型果蠅，回交6代，以確保遺傳背景一致。在溫度25℃，相對濕度65%，光周期為12 h/d條件下培養(yǎng)果蠅，收集12 h內(nèi)羽化果蠅，乙醚麻醉，分雌雄，收集處女蠅以備實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 短柄五加果實(shí)多糖對高溫脅迫下果蠅死亡率的影響將處女蠅分別在基本培養(yǎng)基（0.00%）及多糖培養(yǎng)基（0.01%、0.05%、0.20%、1.00%）中培養(yǎng)7d，然后將不同處理組果蠅轉(zhuǎn)入相應(yīng)含1%瓊脂的果蠅管中，在溫度35℃，相對濕度65%，光周期為12 h/d的恒定條件下培養(yǎng)[13]，每隔12 h統(tǒng)計(jì)一次，直至果蠅全部死亡。每處理組50只果蠅（每管10只，共5個(gè)平行管），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 短柄五加果實(shí)多糖對低溫脅迫下果蠅死亡率的影響將處女蠅分別在基本培養(yǎng)基（0.00%）及多糖培養(yǎng)基（0.01%、0．05%、0．20%、1．00%）中培養(yǎng)7 d，然后將不同處理組果蠅轉(zhuǎn)入相應(yīng)含1%瓊脂的果蠅管中，在溫度3℃（經(jīng)多次預(yù)實(shí)驗(yàn)確定），相對濕度65%，光周期為12 h/d的恒定條件下培養(yǎng)，每隔12 h統(tǒng)計(jì)一次，直至果蠅全部死亡。每處理組50只果蠅（每管10只，共5個(gè)平行管），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 短柄五加果實(shí)多糖對重金屬脅迫下果蠅存活率的影響通過半數(shù)致死率實(shí)驗(yàn)求得重金屬對果蠅的半致死濃度（氧化鎘0．5%、氯化銅0．5%、乙酸鉛5%）。將處女蠅分別在多糖培養(yǎng)基（0．00%、0．05%）中培養(yǎng)7 d，分別轉(zhuǎn)入基本培養(yǎng)基和重金屬培養(yǎng)基（鎘、銅、鉛）中，在溫度25℃，相對濕度65%，光周期為12 h/d的恒定條件下培養(yǎng)，每隔12 h統(tǒng)計(jì)一次，直至果蠅全部死亡。每處理組50只果蠅（每管10只，共5個(gè)平行管），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用SPSS 19．0軟件進(jìn)行分析和作圖，用Kaplan－meier模型做數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 短柄五加果實(shí)多糖對高溫脅迫下果蠅生存函數(shù)的影響（見圖1）

圖1 短柄五加果實(shí)多糖對高溫脅迫下果蠅生存函數(shù)的影響

由圖1可知：高溫脅迫下果蠅平均生存時(shí)間分別為55 h（0．00%）、60 h（0．01%）、70 h（0．05%）、56 h（0．20%）和63 h（1．00%）。經(jīng)Log－Rank比較分析可知，0．05%組與0．00%組生存時(shí)間差異顯著（P＜0．05），說明濃度為0．05%的短柄五加果實(shí)多糖對果蠅抗高溫脅迫效果最好（比0．00%組提高27．3%）。

高溫脅迫下果蠅中位生存時(shí)間分別為48 h（0．00%）、60 h（0．01%）、60 h（0．05%）、60 h（0．20%）和48 h（1．00%），說明0．01%～0．20%的短柄五加果實(shí)多糖對體弱果蠅的抗低溫脅迫效果均好，1．00%的短柄五加果實(shí)多糖效果不明顯。最長生存時(shí)間分別為120 h（0．00%）、132 h（0．01%）、156 h（0．05%）、120 h（0．20%）和132 h（1．00%），說明0．05%的短柄五加果實(shí)多糖對強(qiáng)壯果蠅的抗高溫脅迫效果也最好。

2.2 短柄五加果實(shí)多糖對低溫脅迫下果蠅生存函數(shù)的影響（見圖2）

由圖2可知：低溫脅迫下果蠅平均生存時(shí)間分別為102 h（0．00%）、115 h（0．01%）、121 h（0．05%）、105 h（0．20%）和103 h（1．00%）。經(jīng)Log－Rank比較分析可知，0．05%組和0．00%組結(jié)果差異顯著（P＞0．05），說明0．05%的短柄五加果實(shí)多糖對果蠅抗低溫脅迫效果最好（比0．00%組提高18．6%）。

低溫脅迫下果蠅中位生存時(shí)間分別為96 h（0．00%）、108 h（0．01%）、120 h（0．05%）、108 h（0．20%）和96 h（1．00%），最長生存時(shí)間分別為156 h（0．00%）、156 h（0．01%）、170 h（0．05%）、156 h（0．20%）和156 h（1．00%），說明0．05%的短柄五加果實(shí)多糖對體弱和強(qiáng)壯果蠅的抗低溫脅迫效果最好。

圖2 短柄五加果實(shí)多糖對低溫脅迫下果蠅生存函數(shù)的影響

2.3 0.5%氧化鎘脅迫下0.05%短柄五加果實(shí)多糖對果蠅生存函數(shù)的影響（見圖3）

圖3 0．5%氧化鎘脅迫下短柄五加果實(shí)多糖對果蠅生存函數(shù)的影響

由圖3可知：果蠅平均生存時(shí)間分別為36 h（0．00%）、69 h（0．05%）。經(jīng)Log－Rank比較分析可知，0．05%組和0．00%組差異顯著（P＜0．01），說明0．05%的短柄五加果實(shí)多糖對果蠅抗氧化鎘脅迫效果好（比0．00%組提高91．7%）。

0．5%氧化鎘脅迫下果蠅中位生存時(shí)間分別為36 h（0．00%）、60 h（0．05%），最長生存時(shí)間分別為60 h（0．00%）、108 h（0．05%），說明0．05%的短柄五加果實(shí)多糖對體弱和強(qiáng)壯果蠅的抗氧化鎘脅迫效果也好。

2.4 0.5%氯化銅脅迫下0.05%短柄五加果實(shí)多糖對果蠅生存函數(shù)的影響（見圖4）

由圖4可知：0．5%氯化銅脅迫下果蠅平均生存時(shí)間分別為68 h（0．00%）、59 h（0．05%）。經(jīng)Log－Rank比較分析可知，0．05%組和0．00%組差異無顯著性（P＞0．05），說明0．05%的短柄五加果實(shí)多糖對果蠅抗氯化銅脅迫效果不顯著。

圖4 0．5%氯化銅脅迫下短柄五加果實(shí)多糖對果蠅死亡函數(shù)的影響

0．5%氯化銅脅迫下果蠅中位生存時(shí)間分別為84 h（0．00%）、60 h（0．05%），最長生存時(shí)間分別為84 h（0．00%）、84 h（0．05%），說明0．05%的短柄五加果實(shí)多糖對體弱和強(qiáng)壯果蠅的抗氯化銅脅迫效果不顯著。

2.5 5%乙酸鉛脅迫下0.05%短柄五加果實(shí)多糖對果蠅生存函數(shù)的影響（見圖5）

圖5 5%乙酸鉛脅迫下短柄五加果實(shí)多糖對果蠅生存函數(shù)的影響

由圖5可知：5%乙酸鉛脅迫下果蠅平均生存時(shí)間分別為62 h（0．00%）、72 h（0．05%）。經(jīng)Log－Rank比較分析可知，0．05%組和0．00%組差異無顯著性（P＞0．05），說明0．05%的短柄五加果實(shí)多糖對果蠅抗乙酸鉛脅迫效果不顯著。

5%乙酸鉛脅迫下果蠅中位生存時(shí)間分別為60 h（0．00%）、60 h（0．05%），最長生存時(shí)間分別為84 h（0．00%）、84 h（0．05%），說明0．05%的短柄五加果實(shí)多糖對體弱和強(qiáng)壯果蠅的抗乙酸鉛脅迫效果不顯著。

3 討論

藥物篩選是一個(gè)成本高、時(shí)間長的艱苦工作，用小鼠或大鼠做藥物模型，常由于人道主義問題、成本高和飼養(yǎng)管理不便受到限制。果蠅遺傳背景清晰，飼養(yǎng)簡便，成本低，繁殖快，不存在倫理問題，而且其在生長發(fā)育、生理功能、代謝途徑等方面與哺乳動(dòng)物基本相似，超過60%的人類疾病基因在果蠅中具有同源基因，這些優(yōu)勢使其成為很好的代替人的動(dòng)物模型。郭俊生等[13]證明果蠅可以用做研究提高熱適應(yīng)能力物質(zhì)的動(dòng)物模型，黃云鵬等[10]認(rèn)為果蠅可以作為研究金屬元素和疾病之間關(guān)系的動(dòng)物模型。

果蠅生存試驗(yàn)可以靈敏地反映環(huán)境、藥物等因素對壽命的影響，其中，平均生存時(shí)間是最重要的指標(biāo)，為綜合藥效的反映；中位生存時(shí)間反映藥物對體弱果蠅的延壽效果；最長生存時(shí)間反映藥物對強(qiáng)壯果蠅的延壽效果。本研究表明，0．05%的短柄五加果實(shí)多糖能增強(qiáng)果蠅耐高、低溫能力和抗重金屬鎘的毒害，且不受身體素質(zhì)的影響。這些結(jié)果提示短柄五加果實(shí)多糖可能具有提高動(dòng)物冷、熱適應(yīng)能力及解重金屬毒害的作用，為短柄五加的藥物開發(fā)提供又一方向。

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G424.31

B

1671-1246（2015）05-0102-03

注：本文系甘肅省教育廳項(xiàng)目（1010-08）；慶陽市重大科技支撐項(xiàng)目（1003NKCM020）；隴東學(xué)院科研基金項(xiàng)目（lyzk1101）