他莫昔芬對大鼠脊髓損傷后炎性反應及細胞凋亡的影響

韋竑宇++++++梁立

[摘要] 目的 檢測他莫昔芬對脊髓損傷大鼠核因子kappa B抑制蛋白激酶復合體/核因子kappa B（IKK/NF-κB）通路及細胞凋亡的影響，研究其神經保護機制。 方法 將51只Sprague-Dawley（SD）大鼠隨機分為3組（每組17只）：假手術組（僅行椎板切除術）、對照組（脊髓損傷后硬膜下注射2%二甲基亞砜5 mL/kg）和他莫昔芬組[脊髓損傷后硬膜下注射他莫昔芬5 mg/kg（溶于2%二甲基亞砜1 mg/mL）]。改良Allen法（25 g·cm）制作T12節段脊髓損傷模型。術后24 h采用免疫印跡法（Western blot）檢測損傷節段脊髓核因子kappa B p65（NF-κB p65）、磷酸化核因子κB抑制因子α（pI-κB α）和活性半胱天冬酶-3（caspase-3）表達水平，應用Gel Pro Analyser 4.0定量灰度值（OD）；比色法檢測脊髓組織中髓過氧化物酶（MPO）活性。統計方法采用單因素方差分析和Bonferrni檢驗。 結果 與假手術組相比，對照組和他莫昔芬組術后24 h炎癥相關指標NF-κB p65[（0.31±0.03）比（3.17±0.12）比（1.55±0.07），P < 0.05]、pI-κB α[（0.12±0.01）比（0.98±0.05）比（0.53±0.03），P < 0.05]的表達水平及MPO活性較高[（0.06±0.01）U/mg比（0.64±0.03）U/mg比（0.35±0.02）U/mg，P < 0.05]，但他莫昔芬組低于對照組，組間差異有統計學意義（P < 0.05）；此外，凋亡相關的活性caspase-3在假手術組表達水平極低，另外兩組則明顯升高，其中對照組升高更為顯著[（0.08±0.01）比（1.03±0.05）比（0.36±0.02），P < 0.05]。 結論 他莫昔芬能夠調控脊髓損傷部位的細胞凋亡，并減輕炎性反應，從而發揮神經保護作用。

[關鍵詞] 他莫昔芬；脊髓損傷；核因子kappa B抑制蛋白激酶復合體/核因子kappa B；細胞凋亡；炎性反應

[中圖分類號] R683.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）12（a）-0023-04

他莫昔芬作為乳腺癌患者內分泌治療藥物在臨床已被廣泛應用。近年來研究發現，他莫昔芬在缺血缺氧性腦損傷、脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）、腦出血等疾病中可發揮神經保護作用[1-3]。但他莫昔芬在SCI中發揮神經保護作用的機制仍是未解之謎。

本研究旨在通過檢測核因子kappa B p65（NF-κB p65）及磷酸化核因子κB抑制因子α（pI-κB α）表達，觀察他莫昔芬對核因子-kappa B抑制蛋白激酶復合體/核因子kappa B（IKK/NF-κB）通路的調控；通過檢測活性半胱天冬酶-3（caspase-3）活化水平，觀察其對細胞凋亡的影響；通過檢測髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性，觀察其對炎癥細胞浸潤的影響，從而探討其神經保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠51只（由中日友好醫院實驗動物中心提供），鼠齡10～12周，體重200～220 g，隨機分為3組：假手術組（n=17，僅行椎板切除術）；對照組（n=17，SCI+硬膜下注射二甲基亞砜）；他莫昔芬組（n=17，SCI+硬膜下注射他莫昔芬）。

1.2 模型制備及給藥

3組大鼠麻醉后，假手術組僅行T11～T13段椎板切除。其余兩組以T12棘突為中心，咬除椎板，暴露脊髓，用質量為20 g的不銹鋼棒從12.5 mm高處垂直落下（打擊量25 g·cm），誘發脊髓損傷。

SCI后30 min，對照組硬膜下注射2%二甲基亞砜5 mL/kg；他莫昔芬組損傷部位硬膜下注射他莫昔芬5 mg/kg（溶于2%二甲基亞砜1 mg/mL）。

術后24 h，3組大鼠以10%水合氯醛（600 mg/kg）麻醉后，以含有1 U/mL肝素的生理鹽水進行心臟灌洗，截取10 mm損傷節段脊髓，置于-80℃冰箱保存備用。

1.3 免疫印跡法檢測NF-κB p65、pI-κB α和活性caspase-3

蛋白提取按照蛋白抽提試劑盒說明書進行（普利萊基因有限公司，北京），BCA法蛋白定量檢測濃度（普利萊基因有限公司，北京），計算蛋白電泳加樣量。根據蛋白濃度進行上樣、電泳、轉膜、洗膜、封閉、4℃一抗過夜，一抗分別為小鼠抗大鼠NF-κB p65單克隆抗體（1∶1000，Santa Cruz公司，美國）、兔抗大鼠pI-κB α單克隆抗體（1∶500，Cell Signalling公司，美國）、兔抗大鼠活性caspase-3單克隆抗體（1∶1000，Cell Signalling公司，美國）；洗膜，將標記辣根過氧化物酶的羊抗兔或羊抗小鼠二抗分別加入二抗稀釋液中（1∶2000，Jackson West Grove公司，美國），37℃孵育1 h，漂洗二抗，ECL法發光（ECL試劑盒：普利萊基因有限公司，北京）。X線曝光10 s～1 min。掃描膠片，運用Gel-Pro Analyzer 4.0軟件（Media Cybernetics公司，美國）進行灰度值分析，以其光密度（Optical density，OD）表示。

1.4 比色法檢測MPO活性

脊髓組織中MPO活性檢測按照MPO活性檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，南京）說明書進行，在460 nm處，1 cm光徑，測各組OD 值，根據說明書中的計算公式，推算MPO活性。

1.5 統計學方法

采用SPSS 17.0 軟件進行分析（SPSS公司，美國），計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析和Bonferrni檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。endprint

2 結果

2.1 NF-κB p65的表達

免疫印跡法檢測各組脊髓組織NF-κB p65的表達水平，結果顯示：與假手術組相比，對照組術后24 h NF-κB p65的表達水平較高，他莫昔芬組NF-κB p65表達水平顯著低于對照組（P < 0.05）。見圖1、表1。

2.2 pI-κB α的表達

采用免疫印跡檢測各組脊髓組織中pI-κB α的表達水平，結果顯示：與假手術組相比，對照組pI-κB α顯著升高，而他莫昔芬明顯抑制了pI-κB α的表達，差異均有統計學意義（均P < 0.05）。見圖2、表1。

2.3 活性caspase-3的表達

本研究選擇活性caspase-3作為細胞凋亡相關的指標進行檢測，結果顯示：脊髓損傷24 h后，與假手術組相比，對照組活性caspase-3表達水平明顯升高，他莫昔芬顯著降低了活性caspase-3的表達，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖3、表1。

2.4 MPO活性

通過檢測脊髓組織中MPO活性反映炎性細胞浸潤程度，結果顯示：假手術組中，MPO活性極低，另外兩組則明顯升高，其中對照組升高更為顯著（P < 0.05）。見表2。

3 討論

多個研究表明他莫昔芬可發揮神經保護作用，據報道，他莫昔芬能夠減輕腦出血部位周圍細胞水腫，減輕SCI后組織水腫，促進癱瘓肢體的運動功能恢復[4-6]；在缺血缺氧過程中參與氧自由基的清除，從而大大減少過氧硝酸鹽的生成[7-8]；同時可減弱小膠質細胞及反應性星形膠質細胞活化，發揮抗放射性腦損傷作用[9]。學者們發現，通過抑制炎性反應和神經細胞凋亡可有效緩解脊髓損傷，促進神經功能恢復[10-12]。本研究旨在觀察他莫昔芬對SCI過程中炎性反應及細胞凋亡的影響，探討其神經保護機制。

眾所周知，轉錄因子NF-κB家族是調控人體炎性反應的重要環節，有多條路徑可激活NF-κB，I-κB激酶復合體磷酸化I-κB（I-κB α、I-κB β、I-κB ε）介導的經典路徑在固有免疫的啟動中發揮重要作用。據報道，對IKK/NF-κB通路的成功干預可有效緩解SCI的病理過程[13]。NF-κB并非是一種單一蛋白，而是NF-κB/Rel家族成員構成各種二聚體的總稱。已知有5種哺乳類Rel蛋白：NF-κB1（p50及其前體p105）、NF-κB2（p52及其前體p100）、c-Rel、RelA（p65）和RelB。由p65：p50構成的異二聚體是絕大多數細胞最為常見的NF-κB形式，而且，僅RelA（p65）和c-Rel具有轉錄激活結構域。現已發現多種藥物通過影響NF-κB通路及其基因產物在體外發揮神經保護作用[14-17]。本研究選取p65和pI-κB α作為代表IKK/NF-κB通路活化程度的指標進行檢測，結果顯示，他莫昔芬成功抑制了IKK/NF-κB通路的傳導，在兩組SCI大鼠中檢測到pI-κB α表達水平明顯高于假手術組，而他莫昔芬的應用降低了pI-κB α的表達水平，同時使p65表達水平顯著降低。

SCI發生后炎性反應緊隨其來，炎癥細胞開始釋放大量的促炎遞質及神經毒性物質，如活性氧自由基ROS和活性氮自由基RNS，加重脂質過氧化，損害神經元，從而加重神經功能障礙[18]。在所有炎癥細胞中，中性粒細胞是最快到達損傷部位的。MPO是主要存在中性粒細胞嗜天青顆粒中的一種酶，可催化過氧化氫和氯陰離子反應生成次氯酸和氯胺類，其活性的高低反映中性粒細胞的浸潤程度、數量及活性，從而反映出炎癥的嚴重程度，為判定脊髓損傷程度提供依據[19]。本實驗結果表明在SCI組MPO表達顯著升高，而應用他莫昔芬可大大降低損傷脊髓組織內MPO的表達水平，下調了炎性反應的程度。

SCI中的另一關鍵病理過程是凋亡，Crowe等[20]研究表明，在大鼠SCI模型脊髓白質中可發現大量凋亡細胞。凋亡所致的軸突變性及白質纖維脫髓鞘可最終引發神經元功能損傷[21-23]。細胞凋亡轉錄啟動最重要的因子為caspase-3蛋白酶[24]，它的激活是觸發細胞凋亡的關鍵，被稱為“分子開關”[25]。因此，caspase-3的活性可反映損傷部位細胞凋亡的發生程度。本研究發現，損傷24 h后，對照組的活性caspase-3表達明顯升高，損傷部位注射他莫昔芬可顯著降低caspase-3活性，表明他莫昔芬在脊髓損傷中具有抗凋亡特性。

綜上所述，本研究提示他莫昔芬成功降低NF-κB p65和pI-κB α的表達，從而抑制IKK/NF-κB通路介導的炎性反應。通過檢測組織中MPO活性證實了他莫昔芬可減少脊髓損傷部位炎癥細胞浸潤，此外，他莫昔芬可降低caspase-3活性發揮抗細胞凋亡作用。

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（收稿日期：2014-08-15 本文編輯：程 銘）endprint

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