不同時期增生性瘢痕組織中前列腺素和基質金屬蛋白酶—2的含量測定及分析

袁志堅+++++周梅芳++++++何文涓++++++吳華英++++++趙慶國

[摘要] 目的 測定不同時期燒傷患者增生性瘢痕（HS）組織中前列腺素（PGs）和基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）的含量并探討其變化規律。 方法 選取2013年3～9月在無錫市第三人民醫院收治的燒傷患者或需手術切除瘢痕的患者皮膚標本57例，分為正常組（10例），燒傷早期組（9例），瘢痕1個月組（9例）、3個月組（9例）、6個月組（8例）、12個月組（6例）、24個月組（6例）。采用ELISA法和Western bolt法測定不同時期各分組瘢痕組織中PGs（包括PGD2，PGE2和PGF2α）和MMP-2含量。觀察PGs和MMP-2在不同時期瘢痕組織中的含量變化。 結果 正常組PGE2、PGD2和PGF2α的含量最低[（5.543±0.484）、（3.619±0.484）、（4.833±1.106）ng/mL]，與正常組比較，燒傷早期組PGE2、PGD2和PGF2α含量顯著增加[（30.960±0.735）、（25.952±1.309）、（17.451±1.056）ng/mL]（P < 0.01）；除正常組外，瘢痕24個月組PGE2、PGD2和PGF2α的含量最低[（11.445±0.972）、（8.012±0.972）、（5.888±1.059）ng/mL]，但與正常組比較差異仍有統計學意義（P < 0.01或P < 0.05）。MMP-2在正常組含量最低，與正常組比較，燒傷早期組MMP-2的增加（P < 0.05），瘢痕3個月組含量最高（P < 0.01），瘢痕12個月組降低（P < 0.05），瘢痕24個月組MMP-2含量則降低至與正常組接近的水平（P > 0.05）。 結論 PGs和MMP-2在不同時期瘢痕組織中的含量和正常皮膚比較有顯著差異，提示兩者可能在增生性瘢痕中有重要作用。

[關鍵詞] 增生性瘢痕；前列腺素E2；前列腺素D2；前列腺素F2α；基質金屬蛋白酶-2

[中圖分類號] R62 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）12（a）-0015-04

增生性瘢痕（hyperplastic scar，HS）多發生于深度燒傷的創面愈合后。由于瘢痕組織的黏彈性降低，使人體表面皮膚組織的正常解剖結構遭到破壞，從而導致功能障礙，影響正常的生活與工作，給患者帶來極大的心理負擔[1]。皮膚創傷愈合經歷3個階段，即炎癥期、肉芽組織形成期和瘢痕形成期。這3個階段是連續并相互聯系、相互重迭的[2]。創傷愈合過程中的炎性反應，一方面可以作為抗感染的免疫屏障，一方面刺激纖維形成以閉合創面[3]。前列腺素（prostaglandins，PGs）是這其中一種常見的炎癥介質，可介導炎癥的發生和發展。皮膚能合成、降解PGs。多種皮膚病與PGs及其衍生物有關[4-5]。正常情況下，傷口內的膠原合成與分解呈動態平衡，在某些情況下，這種平衡被打破，導致成纖維肌纖維母細胞合成膠原增多，而膠原纖維分解減少，膠原合成速度遠大于膠原分解，最終導致了膠原沉積，從而形成瘢痕組織[6]。這一演化過程包括創面中細胞外基質（extracellular matrix，ECM）成分和定位的改變，而細胞外基質持續的降解和重建過程又受到基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的調控[7]。MMPs是影響細胞外基質降解的關鍵性蛋白水解酶，它主要由角質形成細胞巨噬細胞成纖維細胞內皮細胞等細胞分泌。目前已知MMPs主要有20多種[8]，其中基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloprotein-2，MMP-2）屬于明膠酶，主要水解底物為變性膠原和細胞外基質的主要成分，如Ⅳ型膠原和Ⅴ型膠原等，在創傷愈合中具有重要的作用[9]。PGs和MMP-2都參與了瘢痕的形成過程，而在不同時期瘢痕組織中PGs[包括前列腺素D2（PGD2）、前列腺素E2（PGE2）和前列腺素F2α（PGF2α）]和MMP-2的含量變化的相關報道較少。本研究采用ELISA法和Western bolt法觀察了不同時期瘢痕組織中PGs和MMPs的表達。為進一步研究MMP-2和PGs在瘢痕組織中的作用和機制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑：苯甲基磺酰氟（ST506），RIPA裂解液（P0013C），超敏ECL化學發光試劑盒 （P0018），BCA蛋白定量試劑盒 （P0010），SDS-PAGE凝膠配制試劑盒 （P0012A）均購于碧云天公司。一抗（bs-4605R）兔抗人MMP-2單克隆抗體，二抗（bsF-0412R）購于北京博奧森生物技術有限公司。PGD2試劑盒（512031-96），PGE2試劑盒（514010-96），PGF2α試劑盒（516011-96）均購于Cayman Chemical公司。

主要儀器：液氮罐（河南天馳儀器有限公司）；玻璃勻漿器（上海生工）；TG-1650WS型離心機（上海盧湘儀）；BioTek酶聯免疫分析儀（美國伯騰儀器有限公司）；Bio-Rad電泳儀（伯樂生命醫學產品上海有限公司）；Mini Protean 3垂直電泳槽（伯樂生命醫學產品上海有限公司）；曝光儀（上海天能科技有限公司）；TY-80B脫色搖床（普陽科學儀器研究所）。

1.2 標本來源

瘢痕組織和正常皮膚組織標本均取于2013年3～9月在無錫市第三人民醫院整形科收治的燒傷患者或需手術切除瘢痕的患者，共57例。按時期不同將標本分為7組，其中，燒傷早期組（燒傷后5 h～2 d）9例，瘢痕形成后1個月組（瘢痕1個月組）9例，瘢痕形成后3個月組（瘢痕3個月組）9例，瘢痕形成后6個月組（瘢痕6個月組）8例，瘢痕形成后12個月組（瘢痕12個月組）6例，瘢痕形成后24個月組（瘢痕24個月組）6例，取上述患者中10例瘢痕患者的正常皮膚組織作為正常組。所有取材部位未經任何治療，標本經無菌取材后，液氮凍存備用。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同時期瘢痕組織中PGs含量的檢測 本實驗測的PGs包括PGD2，PGE2和PGF2α，均用試劑盒檢測。PGD2的具體檢測過程如下：取凍存的組織標本，按組織質量與PBS體積比為1 mg∶5 μL比例混合后，用玻璃勻漿器研磨成組織勻漿，然后用離心機以3000 r/min的轉速離心10 min，分離上清液，即得待測樣品。然后按試劑盒說明書操作：①向標準品孔中每孔加入標準品50 μL，并做好標記。② 向待測樣品每孔加入50 μL待測樣品，并做好標記。③標準品孔和待測樣品孔分別加入25 μL酶標志物，充分混勻。④將包被微孔板加蓋后放置于37℃孵箱中孵育60 min，充分棄盡孔內液體，用預先稀釋好的清洗液反復沖洗5次。以防孔內液體溢出污染其他實驗孔。⑤向包括空白對照孔在內的所有孔，依次加入底物Ⅰ50 μL（HRP-avidin），再加入底物Ⅱ50 μL（TMB），室溫下避光反應15 min。⑥ 反應過后每孔加入終止液（2 mol/L硫酸）50 μL，充分混勻，終止反應。⑦30 min內使用酶標儀在450 nm波長下讀取吸光度值，根據標準曲線計算PGE2的濃度。PGE2和PGF2α的檢測方法也按試劑盒說明書檢測。

1.3.2 不同時期瘢痕組織中MMP-2蛋白的測定 采用Western bolt法。每組中取3例患者的瘢痕組織進行MMP-2蛋白含量測定，瘢痕皮膚組織按1 mg∶5 μL的比例加入含有（濃度為1 mmol/L）RIPA裂解液。冰浴條件下用玻璃勻漿器破碎組織。充分裂解后用離心機以12 000 r/min的轉速離心5 min。分離上清液即為總蛋白提取液。取40 μg蛋白進行SDS-PAGE進行電泳，凝膠經半干電轉儀轉膜，轉移好的纖維棉漂洗后，將膜置于封閉液中，防止變干，室溫下于脫色搖床上搖動封閉1 h。與一抗（1∶500稀釋）4℃溫育過夜，充分漂洗后，加HRP標記的二抗（1∶500稀釋），在室溫下溫育1 h，洗膜4次。最后用ECL發光試劑盒檢測，在X線膠片上曝光，顯影，定影。蛋白表達量是MMP-2蛋白的灰密度值與β-actin蛋白的灰密度值的比值表示。

1.4 統計學方法

采用統計軟件SPSS 17.0對數據進行分析，正態分布計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。作圖采用Graphpad prism 6.01軟件。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組PGD2，PGE2和PGF2α含量的檢測結果

ELISA結果顯示，正常組皮膚組織中PGE2、PGD2和PGF2α的含量最低，其他六組的PGE2、PGD2和PGF2α的含量都顯著性升高，差異均有統計學意義（P < 0.01或P < 0.05）。而從瘢痕1個月組開始，三者的含量均開始降低，且在瘢痕24個月組降到最低。見表1。

2.2 各組MMP-2的含量

正常組中MMP-2的表達水平最低，燒傷早期組MMP-2的表達顯著升高（P < 0.05），且從此組開始表達水平增加，在瘢痕3個月組MMP-2蛋白表達水平達到最高（P < 0.01）；瘢痕12個月組又開始降低，在瘢痕24個月組MMP-2蛋白表達水平恢復到與正常組接近的水平（P > 0.05）。見圖1～2。

3 討論

燒傷早期和瘢痕形成后的PGs含量明顯高于正常皮膚。PGs作為重要的內源性炎癥介質在炎癥的發生發展中起著重大作用。組織損傷后，傷口滲液中會很快出現大量的PGs，并且持續一段時間。研究表明，PGs介導的創傷性炎癥所引起的炎癥細胞浸潤和一些促纖維化細胞因子的產生可促進瘢痕組織的形成，并且PGs含量的紊亂可能是瘢痕瘙癢的一個誘發因素[5]。而燒傷早期皮膚處于重度炎癥期。所以燒傷早期PGs的含量最高。PGE2是花生四烯酸經環氧化酶-2催化轉化而來，花生四烯酸能夠被催化首先生成不穩定的PGG2和PGH2，但是這些物質很快經過催化，最終在合成酶及異構酶的作用下，轉變為穩定存在的PGD2、PGE2及PGF2[10]。所以盡管3種PGs的含量不相同，但是整個含量的變化趨勢是大致相同的。

PGE2能夠使組織動脈擴張，能誘導組胺水平增高，增加血管通透性，參與炎癥的疼痛及發熱過程[11]。此外，PGE2還能聯合趨化因子發揮協同作用，激活并促使中性粒細胞向內皮細胞黏附，促進炎癥細胞中活性氧和溶酶體酶的釋放[12]。所以在燒傷早期，PGs的含量很高。而在瘢痕形成早期的1個月、3個月，PGs的含量相比燒傷早期要低，因為此時炎癥已經好轉。但組織內的PGs仍然處于較高水平。汪涌等[13]發現PGE2顯著抑制正常皮膚和瘢痕成纖維細胞的增殖和膠原合成，他們的實驗經Dot blot雜交，發現PGE2可顯著抑制瘢痕成纖維細胞內Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達，在基因轉錄水平抑制其膠原的合成。所以在瘢痕早期的1個月、3個月PGs含量仍然較高，可能是因為此時PGs在抑制瘢痕形成。瘢痕形成后的6個月后，PGs含量開始降低，但直至瘢痕期2年后，組織內的PGs仍然要高于正常皮膚中的PGs。這也說明PGs在瘢痕過程中有一定的作用，值得繼續探究。

有研究表明，MMP-2在創傷后的第一時間均可被檢測到，可作為瘢痕過度增生的急性燒傷患者血清中的標志物[14]。而本實驗的結果也驗證了這個結論。從燒傷早期開始，MMP-2的含量開始升高。且一直呈上升趨勢，到瘢痕3個月表達達到最大水平。也驗證了之前報道的MMP-2活性在人瘢痕組織顯著增加這個結論[15]。MMP-2在正常皮膚中低表達，參與維持皮膚組織及其附件的正常結構、細胞外基質的代謝和新血管的形成。在增殖期的瘢痕組織中，MMP-2基因表達顯著升高，如瘢痕3個月、6個月，這段時期的MMP-2都很高，與瘢痕處于增生初期，組織細胞內炎癥介質、細胞因子和趨化因子等大量積累，促進細胞增殖的同時誘導MMP-2基因和蛋白表達有關[16]。所以在瘢痕增生期，MMP-2蛋白表達量達到最大。而瘢痕12個月開始呈下降，可能是因為隨著傷口愈合好轉，瘢痕內的細胞因子和炎癥介質減少，修復細胞增殖活性降低，凋亡增加，瘢痕組成細胞的增殖和凋亡、細胞外基質的合成與降解達到相對穩定狀態，此時的瘢痕就轉變為成熟的增生性瘢痕[17-18]。可見MMP-2在瘢痕增殖過程中有重要的作用。

通過對PGs和MMP-2含量的變化對比研究發現，燒傷早期，當PGs含量大量增加時，MMP-2的含量開始增加，并且一直呈上升趨勢。到增生晚期，瘢痕1年以后，當PGs含量逐步降低時，MMP-2的表達也逐漸減少。因為炎癥因子會激發誘導MMPs的表達。所以PGs有可能通過某些通路影響到MMP-2的合成、釋放，值得進一步研究，以便加深對PGs和MMP-2兩者的關系的理解，以及它們在增生性瘢痕中的作用及影響。

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（收稿日期：2014-08-23 本文編輯：蘇 暢）

通過對PGs和MMP-2含量的變化對比研究發現，燒傷早期，當PGs含量大量增加時，MMP-2的含量開始增加，并且一直呈上升趨勢。到增生晚期，瘢痕1年以后，當PGs含量逐步降低時，MMP-2的表達也逐漸減少。因為炎癥因子會激發誘導MMPs的表達。所以PGs有可能通過某些通路影響到MMP-2的合成、釋放，值得進一步研究，以便加深對PGs和MMP-2兩者的關系的理解，以及它們在增生性瘢痕中的作用及影響。

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（收稿日期：2014-08-23 本文編輯：蘇 暢）

通過對PGs和MMP-2含量的變化對比研究發現，燒傷早期，當PGs含量大量增加時，MMP-2的含量開始增加，并且一直呈上升趨勢。到增生晚期，瘢痕1年以后，當PGs含量逐步降低時，MMP-2的表達也逐漸減少。因為炎癥因子會激發誘導MMPs的表達。所以PGs有可能通過某些通路影響到MMP-2的合成、釋放，值得進一步研究，以便加深對PGs和MMP-2兩者的關系的理解，以及它們在增生性瘢痕中的作用及影響。

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（收稿日期：2014-08-23 本文編輯：蘇 暢）