VEGF—A/VEGFR—2信號通路對胃黏膜癌變過程新生血管的調控作用

唐繼貴++++++魏品康++++++張映城

[摘要] 目的 研究新生血管在胃病發展不同時期胃黏膜中的生成情況及血管內皮生長因子（VEGF）-A/血管內皮生長因子受體（VEGFR）-2的調控作用。 方法 選擇2012年1～12月上海長征醫院胃鏡室收集非癌變胃黏膜組織（包括慢性胃炎、胃息肉、胃潰瘍、腸腺化生）及病理科收集胃癌組織（包括癌組織、癌旁近端、癌旁遠端）各20例。采用免疫組化SP法檢測微血管密度（MVD）；Western Blot及RT-PCR法檢測VEGF-A/VEGFR-2的表達。 結果 新生血管在慢性胃炎、胃息肉、胃潰瘍、胃黏膜腸腺化生、胃癌不同區域的表達存在差異，其中，在胃炎胃黏膜中新生血管相對稀疏，而胃息肉、胃潰瘍和胃黏膜腸腺化生新生血管稍密集，胃癌新生血管明顯密集，有形成血管腔形狀。總體上，MVD隨著組織惡性轉化傾向存在遞增趨勢，胃炎低于胃息肉、胃潰瘍、胃黏膜腸腺化生、癌旁遠端，低于癌旁近端，低于胃癌（P < 0.05）。VEGF-A/VEGFR-2對新生血管存在明顯的調控作用，其表達和MVD變化高度一致。 結論 微血管生成貫穿在胃黏膜病變不同時期，VEGF-A/VEGFR-2信號通路對新生血管具有調控作用，抑制微血管生成可能具有阻斷胃黏膜惡性病變的意義。

[關鍵詞] 胃黏膜癌變；新生血管；血管內皮生長因子-A；血管內皮生長因子受體-2

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）12（a）-0011-04

大量研究表明，新生血管生成對腫瘤的生長和轉移具有重要作用[1]。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路是調控新生血管的關鍵信號通路，其中，血管內皮生長因子（VEGF）-A和血管內皮生長因子受體（VEGFR）-2被認為和腫瘤微血管生成密切相關[2]。研究證實，在結腸癌[3]、乳腺癌[4]、胃癌[5]等腫瘤中均發現微血管密度（microvascular density，MVD）平均值隨著TNM分期逐步增高。李學成等[6]、田小林等[7]發現胃癌組織中VEGF-A陽性率明顯高于正常組織。但胃癌發生發展過程中可能經歷的不同階段胃黏膜微血管生成情況及與VEGF-A/VEGFR-2的關系少見報道。為此本研究采用免疫組化SP法檢測MVD，Western Blot及RT-PCR法檢測VEGF-A/VEGFR-2的表達，研究VEGF-A/VEGFR-2信號通路與新生血管變化規律，現報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2012年1～12月于上海長征醫院胃鏡室，取慢性淺表性胃炎、胃息肉、胃潰瘍、胃黏膜腸腺化生各20例標本；于病理科取胃癌標本，包括癌組織、癌旁近端、癌旁遠端，各20例。癌旁近端組織為取自距胃癌組織邊緣3～5 cm胃黏膜組織，癌旁遠端組織為取自距胃癌組織邊緣5 cm外胃黏膜組織，病理證實均無腫瘤細胞浸潤。入選標準：①慢性淺表性胃炎、胃息肉、胃潰瘍、胃黏膜腸腺化生符合修訂版悉尼系統[8]診斷標準；②胃癌診斷標準參考文獻[9]；③排除放化療病例；④研究方案經倫理委員會批準，患者對受試內容完全了解，并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

一抗：CD34 antibody（1∶100，Abcam），Anti-VEGFA antibody、Anti-VEGF Receptor 2 antibody（1∶1000、Abcam）；BCA蛋白定量試劑盒（索萊寶）；逆轉錄試劑盒（Promega）；鼠兔通用型超敏二抗PV9001、DAB顯色液（中杉金橋）；中性樹膠、蘇木精染液、PMSF裂解液（國藥）；PCR反應液（Transistor）；Trizol試劑、引物（Invitrogen公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學SP法

免疫組化SP法常規脫蠟，水化，除去內源性的過氧化氫酶，抗原修復，血清封閉，加1∶100一抗，濕盒中于4°C冰箱中保存過夜，PBS洗5 min×3次，加二抗，濕盒中于37°C溫箱中0.5 h，加DAB顯色劑，水洗終止顯色，蘇木精復染，逐級酒精脫水，中性樹膠封片，晾干拍照。用已知陽性的組織切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。每一批實驗均設有陽性、陰性對照。

微血管計數參考Weidner等[10]的方法。①CD34陽性以血管內皮細胞呈棕色或棕黃色染色為標準；②微血管計數以被染成棕黃色的單個內皮細胞或內皮細胞簇作為1個血管計數，只要結構不相連，其分支結構也作為1個血管計數；③低倍鏡（100×）下觀察切片，選擇微血管分布最高密度區，然后在高倍鏡（200×，每個視野面積為0.785 mm2）下計數3個視野的微血管數，取其平均值為該例的MVD值。

1.3.2 Western Blot相對定量法

1.3.2.1 蛋白的預處理 稱取80～120 mg組織，加5倍體積單去污劑裂解液PMSF，勻漿。12 000 r/min離心，取上清液。使用BCA系統進行蛋白初定量。均一化調平上樣總蛋白質量至總體積16 μL。每管樣本中加入上樣緩沖液（含溴酚藍）。

1.3.2.2 電泳制膜 按目的蛋白大小制取1.0 mm分離、濃縮膠，浸于電泳緩沖液中，注入16 μL預處理蛋白樣本。30 min 80V電泳后60 min 120 V電泳，將電泳得到的分離膠按以下順序疊放：棉花、3層濾紙、分離膠、承載膜、3層濾紙、棉花，4℃轉膜。驗證轉膜成功后用TBST將麗春紅洗脫。

1.3.2.3 封閉孵育曝光、抗體洗脫 將承載膜浸于5%脫脂牛奶中，搖晃1.5 h。將膜浸于TBST稀釋過的一抗中，4℃孵育過夜，清洗膜10 min×3次。將膜浸于TBST稀釋過的二抗中，室溫孵育1 h，清洗膜10 min×3次。取膜加ECL發光液，移至曝光袋中。曝光后取片，顯影定影沖洗，此時X光片上相應位置的黑色條帶即為最終結果。

1.3.2.4 數據分析 Western Blot采用NIH Image J計算灰度值。

1.3.3 RT-PCR相對定量法

1.3.3.1 mRNA的提取 組織加Trizol試劑后勻漿，12 000 r/min離心后棄沉淀，加氯仿混勻，4℃ 12 000 r/min離心取上層水相至另一離心管中，加異丙醇混勻，4℃ 12 000 r/min離心棄上清，RNA沉于管底，加75%乙醇，振蕩、沉淀，4℃ 8000 r/min離心棄上清，真空干燥5～10 min。用50 μL DEPC高壓處理過的H2O溶解RNA樣品，55～60℃ 5～10 min。

1.3.3.2 逆轉錄 將提取出的mRNA進行逆轉錄，成為cDNA模板：在微量離心管中加2 μg總RNA，補充DEPC ddH2O達11 μL。加50 μmol/L Oligo（dT）12～18 μL，混勻、離心。70℃加熱5 min，將微量離心管插入冰浴1 min。在每管中加RT反應液13 μL（混勻分裝），總體積為25 μL，42℃反應60 min。cDNA產物置于-20℃保存。操作以試劑盒說明書為準。

1.3.3.3 PCR實驗 以cDNA為模板，進行real time PCR實驗。引物溶解：12 000 r/min離心5 min，用ddH2O溶解，配成2 μmol/L的工作濃度。反應液配制：引物常規終濃度設為200 μmol/L，采用20 μL中加1 μL的cDNA模板。擴增條件：95℃ 5 min→95℃ 5 s→60℃ 30 s→溶解曲線分析。

1.3.3.4 引物序列 RT-PCR引物序列見表1。

1.3.3.5 數據分析 在RT-PCR檢測實驗中，通過CT值進行數據分析，CT值是一個指數而非線性概念，通過PCR信號的對數值和循環數來確定，計算2-ΔCT將統計數據轉化成線性形式的數據值。

1.4 統計學方法

使用SPSS 18.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，采用Levene檢驗方差齊性，若總體方差齊，則采用多個樣本均數的方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；若總體方差不齊，則采用Krusakal-Wallis檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 顯微鏡下微血管形態

本研究采用免疫組織化學SP法檢測CD34，顯微鏡下顯示新生血管陽性染色呈棕黃色，表現為分支狀、竇隙狀、芽孢狀、橢圓形及圓形等（圖1，見封三）。不同組織類型胃黏膜微血管形態不一：胃炎新生血管相對稀疏，分支狀多，有芽胞狀，無規則；胃息肉、胃潰瘍和胃黏膜腸腺化生新生血管稍密集，芽孢狀、橢圓形多，仍無規則；胃癌中新生血管明顯密集，多為芽孢狀、橢圓形、圓形，有形成血管腔形狀。

2.2 不同類型組織的微血管密度

在胃病發展不同時期，各組織類型胃黏膜新生血管的活躍程度，胃癌最高，其次為癌旁近端，癌旁遠端、胃息肉、胃黏膜腸腺化生、胃潰瘍均高于胃炎，差異均有統計學意義（均P < 0.05）；而癌旁遠端、胃息肉、胃黏膜腸腺化生、胃潰瘍兩兩比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表2。

2.3 不同類型組織的VEGF-A/VEGFR-2表達

在胃病發展不同時期，通過Western blot和RT-PCR檢測各組織類型胃黏膜中VEGF-A和VEGFR-2蛋白及基因的表達（表3、圖2），結果顯示，胃癌組織最高，其次為癌旁近端，癌旁遠端、胃息肉、胃黏膜腸腺化生、胃潰瘍高于胃炎，差異均有統計學意義（均P < 0.05）；而癌旁遠端、胃息肉、胃黏膜腸腺化生、胃潰瘍兩兩比較差異無統計學意義（P > 0.05）。此結果與微血管生成情況一致。

3 討論

本研究發現，不同組織類型胃黏膜中新生血管的活躍程度、VEGF-A和VEGFR-2的表達，胃癌最高，癌旁近端次之，癌旁遠端、胃息肉、胃黏膜腸腺化生、胃潰瘍高于胃炎，差異均有統計學意義（均P < 0.05）；而癌旁遠端、胃息肉、胃黏膜腸腺化生、胃潰瘍兩兩比較差異無統計學意義（P > 0.05）。以上結果說明MVD隨著組織惡性轉化傾向存在遞增趨勢，VEGF-A/VEGFR-2信號通路對新生血管具有調控作用。

在胃癌發生發展過程中，新生血管為腫瘤生長提供營養物質和氧。目前為止已知的腫瘤促血管因子有10余種， VEGF信號通路是調控新生血管的關鍵信號通路，其中VEGF-A主要參與腫瘤血管生成的調節，與其相應的受體VEGFR-2結合后，激活下游信號通路，增加血管通透性，刺激內皮細胞增殖，同時誘導內皮細胞遷移，促使血管生成[11]。文獻報道，胃癌組織中VEGF/VEGFR2、MVD表達高于癌旁組織[12-13]，與本研究結果一致。提示VEGF-A/VEGFR-2信號通路可誘導胃癌組織新生血管的生成。

胃癌發生過程中可能經歷慢性淺表性胃炎、胃潰瘍、腸腺化生、胃息肉和癌變等不同階段，微血管生成貫穿在胃黏膜病變的不同時期。本研究發現，VEGF-A/VEGFR-2信號通路對新生血管具有調控作用，抑制微血管生成可能具有阻斷胃黏膜惡性病變的作用，從而預防胃癌發生。

本研究尚存在許多不足之處，如樣本量少（每組只有20例）、未進行干預措施等。未來建議擴大樣本量，給予相應的干預措施，進一步探討胃黏膜病變不同時期微血管生成情況及VEGF/VEGFR2的表達。

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（收稿日期：2014-08-10 本文編輯：程 銘）

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（收稿日期：2014-08-10 本文編輯：程 銘）

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（收稿日期：2014-08-10 本文編輯：程 銘）