原生貢寮山藥萃取物抗氧化成分及抗氧化活性的研究

趙一霖， 蔡國珍， 婁永江*， 丁仲仲， 張興龍

（1.寧波大學 海洋學院，浙江 寧波 315211；2.臺灣海洋大學 生命科學院，臺灣 基隆）

山 藥 為 薯 蕷 科 （Diosoreaceae） 薯 蕷 屬（Dioscorea）的蔓性塊莖類植物，俗稱懷山或山芋。具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖等多項生理功能，是值得關注及發展成為保健食品[1-4]。

Farombi指出，褐變后山藥（D.rotundata）粉末的乙酸乙酯萃取物具有很好的抗氧化效果[5-6]；若將此乙酸乙酯萃取物進一步以 Sephadex LH-20管柱層析配合甲醇流洗作區分，所得的各區分物同樣顯示具有很好抑制脂質氧化的效果。Araghiniknam以購自市面上的山藥萃取物補充劑給予 65～82歲的老年人服用，經過3周后發現效果明顯，山藥萃取物補充劑可以緩解血清中脂質過氧化，降低三酸甘油酯的含量，增加高密度脂蛋白（HDL）的含量，減少低密度脂蛋白（LDL）造成的氧化損傷。Hu等以熱水萃取、乙醇沉淀、Sephadex G-100純化所得的山藥多糖（相對分子質量 8.1×104），能降低維生素 CNADPH及Fe2+-cysteine誘發小鼠腦、肝臟和腎微粒體（microsome）脂質過氧化物的生成，同時山藥多糖對 hypoxanthine/xanthine oxidase反應系統生成的超氧自由基 （O2-·）及 Fenton反應系統生成的氫氧自由基（HO·）也一樣具有清除能力。現代許多疾病均與氧化壓力有關，如老化、癌癥、骨質疏松以及發炎等[7]。山藥可以當做是一種天然的抗氧化劑，并能抵抗環境中的化學物質所造成的氧化傷害與疾病。發炎反應容易引起免疫相關的細胞產生趨化作用，進而造成活性氧（ROS）的產生。

目前對山藥提取物的研究，主要集中在山藥多糖上，認為多糖是其主要活性成分[8-9]，而對山藥提取物中酚類物質及其抗氧化性方面研究尚未見報道。作者采取不同干燥方法及萃取方式分別探討了原生貢寮山藥（Dioscores alata）山藥皮與山藥肉的抗氧化性及抗氧化成分，望進一步評估山藥作為功能性產品的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原生貢寮山藥：產自臺灣省貢寮市山藥園，采后厚紙包裝置于4℃冰箱中；磷酸氫二鈉、六氰合鐵酸鉀、碳酸氫鈉、沒食子酸、磷酸二氫鉀等：均為分析純試劑；二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）、福林酚試劑、綠原酸：購自 Sigma公司；Dulbecco’s Modified Eagle Medium （DMEM）（low glucose） 培養基，胎牛血清（FCS）：購自 Gibco公司。

CR-21型高速離心機：日立建機株式會社產品；UV-160-A型分光光度計：日本島津公司產品；Bichi RE111 型減壓濃縮機：Model 107905，Boekel Scientific Inc產品；FACScan流式細胞儀：美國碧迪醫療器械有限公司產品；高效液相色譜儀：日本島津公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 山藥粉末的制備 清洗干凈，表面晾干后的山藥適量，表面削皮得到厚度約為0.2 cm的山藥皮以及去皮的山藥（后稱山藥肉，切成2 cm左右厚的小塊狀），分別浸入90℃熱水中30 s熱燙處理。熱燙后每個樣品分成兩份分別進行熱風干燥以及冷凍干燥后破碎過80目篩網，粉末于封口袋密封后備用。

1.2.2 萃取物的制備 將預先制得的山藥皮、肉粉末分別用體積分數50%的乙醇，25、100℃去離子水，以200 r/min攪拌避光萃取1 h，減壓濃縮后冷凍干燥。得到粉末密封后儲存于-20℃冰柜中備用。

1.2.3 體外抗氧化實驗

1）總多酚類化合物測試 參考Sato的方法[10]，首先取400 μL不同濃度值萃取物及沒食子酸（3.125～100 μg/mL）作為對照組，加入 400 μL 福林酚試劑充分振蕩后靜置3 min，再加入40 μL質量分數10%NaCO3溶液，經充分振蕩后靜置于暗室1 h以分光光度計檢測于700 nm的吸光值。以不同濃度的沒食子酸替代樣品進行反應，制作標準回歸曲線，每毫升萃取液中等同于含有沒食子酸的毫克數，吸光值越高表示總酚類化合物越多。

2）DPPH自由基清除能力 參考Yamaguchi and others的方法[11]，取樣品液0.05 mL，加入0.5 mL 100 μmol/L的 DPPH溶液（溶于體積分數95%的乙醇），混勻后在室溫下靜置避光反應40 min后在517 nm處測吸光值Ai，未添加樣品的控制組吸光值A0；維生素C為標準品。

清除率按下式計算：

DPPH·清除率 （%）=（1-（樣品吸光值 Ai）/（未添加樣品的控制組吸光值A0））×100

3）還原力測定 參考Yen and chen的方法[12]，取150 μL不同質量濃度萃取物以及沒食子酸（0.001 95～0.062 5 mg/mL）做對照組，加入等體積的磷酸鈉緩沖溶液以及1%K3Fe（CN）6充分震蕩后靜置14 min，在700 nm下檢測吸光值，以不同質量濃度的沒食子酸反應制定還原力標準曲線，還原力以相同吸光值的沒食子酸濃度表示，吸光值越高待變萃取物的還原能力越強。

1.2.4 高效液相色譜分析多酚類物質 柱溫30℃，流量1 mL/min，進樣量為20 μL，檢測波長是280 nm，Thermo C18（250 mm×4.6 mm，D 5 μm），洗脫液A：乙腈 B：體積分數1% 乙酸，洗脫梯度：0～7 min v（A）∶v（B）=1∶9，8～12 min v（A）∶v（B）=3∶7，13～18 min v（A）∶v（B）=1∶1 ，19～25 min v（A）∶v（B）=1∶9，標準品綠原酸。

1.2.5 胞內活性氧分析 參考Prabhu等的方法[13]，取每毫升 1×106個細胞 （含體積分數10%FCS的DMEM）以有或者無樣品與最終質量濃度在1 μg/mL 的脂多糖（LPS）在 37 ℃（體積分數 5%CO2）的恒溫培養箱內共同培養18 h后，再加入熒光染劑DCFH-DA于培養液（不含serum）中，使最終濃度為20 μmol/L。非極性物質 DCFH-DA滲入細胞內，經細胞內cellular esteraser作用可成為非熒光極性物質DCFH，待其進入細胞后遭到細胞內部H2O2等氧化，使其成為熒光物質 DCF，間接可量化細胞內ROS生成量。 細胞與DCFH-DA于37℃反應30 min后，將細胞液吸到15 mL離心管中，以 400 g離心10 min，棄上清液，細胞用 PBS清洗兩次，加入1 mL PBS懸浮細胞，在流式細胞儀中進行分析。分析時，讀取被水解成DCF所激發的熒光，收取10 000個細胞作為檢品。

1.3 統計分析

利用Spss軟件進行統計分析，實驗結果數據以（平均值±標準差）表示，利用單因子變異數分析法，當p＜0.05表示有顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 山藥總多酚類化合物質量分數分析與體外試管抗氧化能力

表1為比較原生貢寮山藥皮與山藥肉的總多酚含量。可以發現，不同干燥方式、萃取方式山藥皮萃取物的總多酚質量分數遠高于山藥肉質量分數，山藥皮萃取物總多酚質量分數為山藥肉總多酚質量分數的3～20倍。干燥方式以冷凍干燥更好地保留了山藥中的多酚成分；萃取物以體積分數50%乙醇萃取最優。

表2、表3為比較原生貢寮山藥皮與山藥肉的抗氧化能力，可以發現無論哪一種萃取方式的山藥皮萃取物的DPPH自由基清除能力、還原力均遠遠高于山藥肉萃取物。干燥方式也均以冷凍干燥優于熱風干燥；DPPH自由基清除能力跟還原力測試以乙醇萃取優于常溫水萃取和熱水萃取；熱水萃取物的抗氧化能力均低于其余萃取物的抗氧化能力。

表1 原生貢寮山藥的總多酚質量分數Table 1 Total phenolic content of Dioscores alata mg（以10 g山藥干燥粉末計）

表2 原生貢寮山藥的DPPH清除能力Table 2 Reducing power of Dioscores alata %

表3 原生貢寮山藥的還原力Table 3 Reducing power of Dioscores alata mg（以10 g干燥山藥粉末計）

實驗結果顯示，加熱處理會顯著降低山藥的抗氧化能力，Hsu等[14]也指出冷凍干燥的山藥粉末通常比熱風干燥保留了更多的抗氧化活性。冷凍干燥的山藥皮熱水萃萃取物較常溫水萃取物抗氧化能力與總多酚質量分數顯著降低：DPPH降低了78%，還原力降低了45%，總多酚質量分數降低了34%。熱風干燥的山藥皮較冷凍干燥山藥皮的抗氧化能力與總多酚質量分數也顯著降低，其中熱風干燥的DPPH清除能力為冷凍干燥的DPPH自由基清除能力的45%～68%。總多酚質量分數，熱風干燥較冷凍干燥的山藥皮常溫水萃取物降低32%，熱水萃取降低15%，乙醇萃取降低31%。

原生貢寮山藥皮的抗氧化能力高于山藥肉部分。萃取方式以體積分數50%乙醇的萃取物的抗氧化能力最強，這與黃等人的研究結果相同[15]。在Hou的研究報告中指出山藥肉部分主要抗氧化能力的活性物質包括粘質、酚類化合物、儲存蛋白[16-17]；但尚未有報道指出山藥皮具有的抗氧化活性物質到底是什么。實驗發現，山藥皮比山藥肉的總多酚質量分數高很多，因此推測山藥皮具有較高的還原力以及DPPH自由基清除能力可能由于山藥皮具有較高的總多酚質量分數，此推斷有待于進一步論證。

2.2 HPLC分析山藥萃取物多酚物質

圖1為12種樣品（不同山藥部位，不同干燥方式，萃取方式處理后共12個樣品中具有代表性的4個圖譜，經全波長掃描后確定檢測波長為280 nm。結果顯示在綠原酸為主要檢出酚酸（比對綠原酸標準品），保留時間為11.64～11.67 min，標準品綠原酸保留時間為11.66 min，其余多酚類集中在5 min以內，極性極強，萃取物中綠原酸質量分數為0.85～11.91 mg/g。圖1可見，經冷凍干燥處理后的山藥皮乙醇萃取物高于熱風干燥處理的山藥皮乙醇萃取物，萃取方式以乙醇萃取優于熱水萃取，干燥方式以冷凍干燥優于熱風干燥。且綠原酸為山藥肉中主要多酚類物質，綠原酸質量分數占總多酚質量分數的44%～87%。山藥皮中，綠原酸占總多酚類物質的34%～59%。HPLC分析綠原酸質量分數以及細胞ROS實驗分析結論與體外試管抗氧活能力以及總多酚質量分數一致，初步證明山藥中粗提取物中主要的抗氧化成分為多酚類物質——綠原酸，但是綠原酸的抗氧化性質待進一步論證。

2.3 山藥乙醇萃取物對RAW264.7細胞產生胞內活性氧分析（ROS）的影響

圖2為原生貢寮山藥乙醇萃取物抑制由LPS誘導RAW264.7細胞產生ROS的影響，結果顯示較LPS誘導組相比，添加原生貢寮山藥乙醇萃取的樣品低濃度下即可顯著降低細胞產生ROS的活性。即原生貢寮山藥乙醇萃取物對于在LPS刺激下RAW264.7細胞所產生的ROS具有良好的清除結果，所以認定此萃取物良好的抗氧化能力可能與其具有ROS清除能力有很大關系。RAW264.7細胞在山藥皮的抑制能力優于山藥肉，干燥方式以冷凍干燥的萃取物抑制能力優于熱風干燥，此結果與體外試管結論一致。

3 結語

山藥皮較山藥肉具有較少的蛋白質跟較多的總多酚質量分數，所以山藥皮具有較高的還原力與DPPH自由基清除能力可能與山藥皮具有較高的總多酚質量分數有關。冷凍干燥比熱風干燥保留了較高的山藥抗氧化能力以及總多酚質量分數是由于熱處理影響了酚類物質的穩定性與抗氧化能力。山藥皮的體積分數50%乙醇，熱水和水萃取液的總多酚質量分數、還原力及DPPH自由基清除能力皆遠高于山藥肉的萃取液。在3種萃取方式的山藥萃取液的抗氧化能力體積分數50%乙醇的萃取方式最優。體外抗氧化分析，HPLC分析綠原酸實驗以及萃取物降低由LPS所誘發RAW 264.7細胞產生ROS的活性實驗結論一致。

圖1 部分原生貢寮山藥的萃取物的HPLC分析圖譜Fig.1 Part of HPLC chromatogram of extraction from Dioscores alata

圖2 原生貢寮山藥的乙醇萃取物對抑制小鼠RAW264.7細胞產生ROS能力的影響Fig.2 Effect of 50%ethanolic extraction from Dioscores alata on the ROS scavenging in murine RAW 264.7 macrophage

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