復合改性改善大豆分離蛋白功能性質的研究

張亞婷， 張曉鳴

（食品科學與技術國家重點實驗室/江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122）

大豆分離蛋白（SPI）由于價格低廉、具有良好的營養價值，廣泛應用于食品加工行業[1-3]。隨著食品工業的發展，蛋白質的需求量大大增加，尤其是功能特性和營養特性高的蛋白質原輔料，更存在巨大的需求缺口。然而大豆分離蛋白功能特性相對較差，對加工條件（高溫、pH等）敏感，很大程度限制了其在諸多食品體系的應用[2]。為此，加強或改善大豆分離蛋白的功能特性成為食品加工行業亟待解決的問題。乳化能力及氣泡性能是大豆分離蛋白作為功能性食品添加劑的最重要功能特性之一。大豆分離蛋白乳化能力改性的主要方法包括物理法、化學法和酶法，其中化學法中的糖基化改性安全、簡單，符合近年來人們對于綠色安全的天然食品添加劑的要求，成為近年研究的熱點。蛋白分子上引入多糖后，分子間空間位阻加大，同時接枝物中蛋白質分子側鏈具有一定的疏水性，使得接枝物能快速且緊密地吸附在油／水界面上，因而SPI的乳化活性得到提高，其他功能性也隨著結構變化而相應改變[1]。酶法改性通過蛋白酶的作用使蛋白質的空間結構及其功能特性發生相應的改變。酶促反應由于效果顯著、條件溫和、一般不會導致營養方面的損失，也越來越多的受到人們的重視[4]。作者嘗試將糖基化改性和酶法改性結合到一起，對大豆分離蛋白-麥芽糊精的接枝產物進一步酶解，優化了復合改性工藝條件，并對產物功能性質進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂大豆粕：河南安陽漫天雪食品制造有限公司提供；麥芽糊精：山東保齡寶生物股份有限公司提供；中性蛋白酶：諾維信生物技術有限公司提供。

1.2 儀器與設備

恒溫水浴鍋：江蘇省金壇環宇科學儀器廠提供；超級恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司提供；T18高速均質分散機：德國IKA公司提供；DELTA 320 pH計：梅特勒-托利多儀器上海有限公司提供；UV-1600紫外可見分光光度：上海美譜達儀器有限公司提供；CF-16RXII冷凍離心機：日本日立有限公司提供；梅特勒AL204分析天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 大豆分離蛋白的制備 參考文獻[3]的方法，采用堿溶酸沉法制備大豆分離蛋白。稱取一定量脫脂豆粕粉（粉碎過100目篩），按照 1∶15（蛋白質與去離子水質量比）溶于去離子水，充分攪拌混勻。用2 mol/L NaOH溶液調節pH至7.0，持續攪拌2 h。所得溶液用高速離心機8 000 g離心30 min，取上清液用2 mol/L HCL調節pH至4.6，持續攪拌2 h，8 000 g離心30 min，得到沉淀水洗，加入少量蒸餾水充分攪拌混勻，調節pH至中性，所得溶液冷凍干燥得到大豆分離蛋白，經凱氏定氮法測定，蛋白質質量分數為96.7%。

1.3.2 大豆分離蛋白-麥芽糊精糖基化產物制備將大豆分離蛋白與麥芽糊精按照不同的比例溶解于一定去離子水中，蛋白質質量分數為0.5%～60%，水浴條件下（70℃～90℃）反應一定時間（20～120 min），反應結束后迅速冰浴至室溫，冷凍干燥制成干粉置于冰箱中備用。

1.3.3 游離氨基氮濃度的測定及接枝度的計算游離氨基氮濃度采用OPA法進行測定[5]。準確稱取40.0 mg的OPA溶解于1.0 mL甲醇中，再加入質量分數20%的十二烷基硫酸鈉（SDS）2.5 mL，硼砂（0.1 mol/L）25.0 mL，β-巰基乙醇 100 μL 最后用蒸餾水定容到50 mL。測定時，取4.0 mL OPA試劑于試管中，加入200 μL樣品，混合均勻，放入 35℃水浴中反應 2 min后在 340 nm下測吸光值 A340，另取 4.0 mL OPA試劑于試管中，加入 200 μL去離子水作為空白對照。用相同的方法，以賴氨酸代替樣品作標準曲線，根據曲線計算樣品中自由氨基的濃度 A。

接枝度計算公式：

其中：A0為接枝反應前溶液中自由氨基的濃度，mol/L；At為接枝反應后溶液中自由氨基的濃度，mol/L。

1.3.4 大豆分離蛋白-麥芽糊精糖基化產物酶解物制備及水解度的測定 將大豆分離蛋白-麥芽糊精糖基化產物粉末溶于適量的去離子水，制備質量分數4%的蛋白質溶液，80℃條件下預熱10 min然后調節溶液溫度為54℃，pH為7.0。加入適量的中性蛋白酶進行酶解，計時25 min。通過加入0.5 mol/L氫氧化鈉穩定酶解過程pH為7.0，記錄堿液的消耗量。酶解結束80℃水浴加熱10 min滅酶。實驗通過控制不同加酶量制備不同水解度的酶解產物。采用pH-stat法[6]計算產物水解度，公式如下：

DH（%）=BNb（1/α）（1/Mp）（1/htot）×100

其中：B－水解過程中消耗 NaOH溶液的體積（mL）；Nb－NaOH 溶液的濃度 （mol/L）；α－α-氨基解離度；Mp－底物蛋白質濃度（g）；htot－蛋白質中總的可被水解的肽鍵數。

1.3.5 復合改性產物乳化能力測定 參照Pearce＆Kinsella[6]的方法進行改進。 取 12 mL 0.1%（w/v）待測樣品蛋白液 （樣品蛋白于0.2 mol/L pH 7.0磷酸緩沖液中），加入4 mL大豆色拉油（福臨門，東海糧油集團），在10 000 rpm，25℃下高速均質1 min，分別在攪拌后 0、2、4、6、8、10 min 取樣。以 0.1 g/dL SDS（pH 7.0）稀釋50倍，測定500 nm處的吸光值，以SDS溶液為空白。乳化活性指標EAI的計算：

其中，A為測定的吸光度值；ψ為乳化液中油相的比例；L為比色杯光徑；C表示蛋白質的初濃度；N為稀釋倍數。

乳化穩定性（ES）用乳化穩定指數（ESI）表示：

ESI=A0×ΔT/（A0-At）

其中，A0，0 時刻的吸光值；At，t時刻的吸光值；ΔT，時間差。

1.3.6 復合改性產物氣泡能力測定 參照郭鳳仙[7]的方法，將一定濃度的SPI溶液20 mL置于100 mL量筒（口徑6 cm，高為20 cm，實驗室自制）中，使用高速乳化均質機以10 000 r/min的速度均質1 min，記錄均質后液面高度記為V0，靜置 30 min后記錄液面高度，記為 V30。起泡能力（Foaming capacity）公式如下：

泡沫穩定性（Foaming stability）公式如下：

1.3.7 抗脂質氧化能力測定 抗脂質過氧化能力測定方法參見文獻 [3]。將卵磷脂溶于0.01 mol/L、pH 7.4的磷酸緩沖溶液中配制成10 mg/mL的溶液（標記為 LLS）。 將三氯乙酸（15 g）、硫代巴比妥酸（0.37 g）、濃鹽酸（2 mL）加入蒸餾水配成 100 mL 溶液，標記為TCA/TBA/HCl。試管中依次加入1 mL LLS、1 mL 400 μmol/L FeCl3、1 mL 樣品溶液， 溶液置于37℃水浴中暗處放置60 min，加入2 mL TCA/TBA/HCl，在沸水浴15 min，取出冰水冷卻，將粉紅色溶液8 355 g離心10 min，取上清液測定532 nm下的吸光度值，空白用蒸餾水代替樣品，抗氧化能力按式3-5計算：

1.3.8 還原力測定 還原能力的測定參見文獻[3]，試管中順序加入1.0 mL稀釋后的樣品溶液，1.0 mL、0.2 mol/L、pH 6.6 的磷酸鹽緩沖液和 1.0 mL、1.0 g/dL 的 K3Fe（CN）6溶液，均勻混合，50 ℃下保溫20 min后快速冷卻，加入三氯乙酸（10 g/dL）溶液1.0 mL，混合均勻后以2 089 g離心10 min。取上清液1.0 mL，加入1.0 mL蒸餾水和1.0 mL 0.1 g/dL的FeCl3，混合均勻，靜置10 min，以700 nm處的吸光度表示樣品的還原能力，以蒸餾水代替鐵氰化鉀作為空白。

1.3.9 DPPH自由基清除能力 清除DPPH自由基能力的測定方法見參考文獻[3]，準確吸取適當稀釋的MRPs 1.0 mL，加入2.0 mL 0.1 mmol/L DPPH甲醇溶液均勻混合后室溫暗處放置20 min，2 089 g離心10 min，取上清液測定517 nm處的吸光度值，空白以蒸餾水代替樣品，對照以甲醇代替DPPH，DPPH自由基清除能力按式3-3計算：

1.4 數據統計及統計分析

對于大豆分離蛋白與麥芽糊精在某一條件上進行研究時，反應的其它條件均相同。所有實驗均進行三次平行實驗，所得數據應用SPSS軟件進行方差分析和差異顯著性分析。

2 結果與分析

大豆分離蛋白-糖的接枝反應受很多因素影響，如蛋白/糖的比例、反應濃度、反應溫度、反應時間等，接枝反應的程度及接枝物的性質，是多種因素共同作用的結果。

2.1 大豆分離蛋白糖基化反應的影響因素研究

2.1.1 反應物比例對大豆分離蛋白糖基化反應的影響 蛋白和多糖的分子間的共價結合是在一定的基團間發生的，適當的反應物配比不僅可以提高反應的速度和最終的反應程度，而且可以減少副反應（如焦糖化）的發生。

大豆分離蛋白與麥芽糊精按照一定質量比 （2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4）混合，pH 為 7.0，蛋白質質量濃度5 g/dL，溫度80℃，反應2 h得到美拉德接枝反應產物，考察反應物比例對接枝反應（接枝度和褐變程度）的影響，結果如下所示。

圖1 SPI與麥芽糊精的比例對SPI-Md接枝反應接枝度與褐變程度的影響Fig.1 Effect of the ratio of SPI to Maltodextrin on the DG and degreeofbrowning ofSPI-Md conjugation

結果表明，隨著麥芽糊精添加量的增大，接枝度有一定的下降。這可能是由于反應物過量會影響反應的速度；另外，由于麥芽糊精本身是白色，可以適當掩蓋反應產物的顏色，使得反應帶來的褐變不明顯。當底物配比為2∶1時，接枝度最高，褐變程度相對較低僅0.13左右。

2.1.2 蛋白質質量濃度對大豆分離蛋白糖基化反應的影響 控制大豆分離蛋白與麥芽糊精配比2∶1，pH為7，溫度80℃，反應2 h得到美拉德反應產物，考察蛋白質質量濃度對接枝反應影響，接枝度和褐變程度結果如下所示。

圖2 蛋白質質量濃度對SPI-Md接枝反應接枝度與褐變程度的影響Fig.2 Effect of protein concentration on the DG and degree of browning of SPI-Md conjugation

隨著蛋白質質量濃度的上升，接枝度出現先上升后下降的趨勢，蛋白質質量濃度在4%時最高。這可能是由于，在當反應物的配比一定時，隨著蛋白質質量濃度的提高，反應物分子之間碰撞的幾率大大增加，有利于反應的進行[8]。而濃度增加到一定程度，考慮到蛋白質分子和多糖分子的空間位阻，分子之間的碰撞幾率會減少，不利于反應的進行[2]。

2.1.3 反應溫度對大豆分離蛋白糖基化反應的影響 控制大豆分離蛋白與麥芽糊精質量比2∶1，底物質量濃度為4 g/dL，pH為7.0，反應2 h制備美拉德反應產物，研究不同反應溫度對美拉德反應的影響，結果如下圖所示。

圖3 反應溫度對于SPI-Md接枝反應接枝度和褐變程度的影響Fig.3 Effect of the temperature on the DG and degree of browning of SPI-Md conjugation

隨著美拉德反應溫度的上升，接枝度呈現先上升后下降的趨勢，反應溫度為80℃的時候接枝度最高，表示反應底物分子接觸充分，反應迅速。產物色澤隨反應溫度的提高有加深的趨勢，這可能是因為，美拉德反應的后期過程是有色產物增多。選取80℃作為合適的反應溫度。

2.1.4 反應時間對大豆分離蛋白糖基化反應及終產物功能性質的影響 控制大豆分離蛋白與麥芽糊精配比2∶1，底物質量濃度為4 g/dL，溫度80℃，pH為7.0，研究不同反應時間對美拉德反應的影響，結果如下圖所示。

隨著反應的進行，接枝度逐步上升，當反應時間達到120 min時出現下降趨勢。這是可能是由于接枝反應開始后，蛋白質結構部分展開，蛋白中的ε-氨基逐步暴露，多糖與蛋白質受熱逐步結合，接枝度逐漸提高。而過度加熱可能使蛋白質分子的賴氨酸被破壞，也可能使蛋白質由于相互作用增加，導致凝聚和沉淀，不利于接枝反應，此外美拉德反應后期，部分接枝物可能會發生裂解，也可能導致接枝度下降。選擇適中的反應程度，在保證接枝度較大的情況下褐變指數越小越好。

圖4 反應時間對于接枝度和褐變程度的影響Fig.4 Effect of the reaction time on the DG and degree of browning of SPI-Md conjugation

考察了不同接枝反應時間對于復合改性終產物的乳化性及抗氧化能力（還原力、DPPH自由基清除能力）的影響。 如圖 5（a）、（b）所示，隨著接枝反應時間的增加，接枝酶解終產物乳化性先升高后逐漸減小，反應時間80 min時制備的產物乳化性最高；然而乳化穩定性則隨接枝時間的變化出現下降的趨勢?？寡趸芰Ψ矫?，隨接枝反應時間的增加，復合改性終產物還原力變化不大，DPPH自由基清除能力則有明顯的先上升后下降的趨勢，反應時間100 min時產物DPPH自由基清除能力最高 （圖5（c）、（d））。

圖5 接枝反應時間對于復合改性終產物乳化能力及抗氧化能力的影響Fig.5 Effect of the conjugation time on the emulsifying properties and antioxidative propertiesofthe combined modified products

2.1.5 接枝酶解反應條件的確定 綜上所述，以接枝度及褐變程度為主要指標，同時參考反應時間對產物功能性質的影響，選擇體系的反應物比例（大豆分離蛋白/麥芽糊精）為 2∶1，蛋白質量濃度為4 g/dL，溫度80℃，pH為7.0，反應時間為80 min作為反應條件，對大豆分離蛋白-麥芽糊精接枝產物進行進一步酶解改性研究。

2.2 酶解程度對復合改性終產物的乳化能力的影響 將大豆分離蛋白-麥芽糊精糖基化產物進行酶解，通過控制不同的加酶量，制備不同酶解程度的復合改性終產物。加酶量（E/S）分別設定為0.5%，2%，4%，6%，8%，制備得到酶解度分別為1.8%，2.9%，4.6%，5.7%，6.2%的酶解物，進一步研究其功能性質的變化，結果見圖6。

圖6 復合改性對于產物乳化能力的影響Fig.6 Effect ofthecombined modification on the emulsifying properties of the modified products

大豆分離蛋白與麥芽糊精接枝后，分子間的空間位阻加大，同時接枝物中蛋白分子片段側鏈具有一定的疏水性，使得接枝物能快速且緊密的吸附在油/水界面，從而提高了大豆分離蛋白的乳化性[2]。

接枝物經過適度酶解后，乳化性及乳化穩定性均呈現先增加后減少的趨勢。這是因為酶解帶來疏水性氨基酸側鏈增加，增強的疏水性基團有利于與油滴結合，從而使乳化性增強；然而隨著水解度的增加，溶液粘度下降，極性電荷數量增加，親水性也隨著增加，吸附油滴能力下降，又降低了乳化能力[9]。

2.3 酶解程度對于復合改性產物起泡性的影響

實驗還研究了復合改性對于產物起泡性的影響，圖7顯示，接枝后產物起泡性增強。進一步酶解過程使得產物起泡性先有所降低后逐漸提高，當水解程度超過5.7%時出現明顯下降。這是由于隨著酶解的進行，包裹于蛋白分子內部的疏水性基團暴露，酶解產物疏水性增強，從而表面張力減弱，發泡能力增強[10-11]。然而當酶解度過大則由于肽鏈過短，不足以穩定泡沫液膜，從而導致起泡性下降。經過酶解改性后，泡沫穩定性出現明顯下降，該結果與文獻報道結論一致[12]。酶解使得產物溶解性增強的同時，也會帶來溶液粘度下降，從而不利于維持泡沫液膜穩定。

2.4 復合改性對大豆分離蛋白抗氧化能力的影響

由圖8可以看出，大豆分離蛋白經過接枝后抗脂質氧化能力有顯著的提高。這可能是由于蛋白接枝物具有較強的鐵離子螯合能力從而可以抑制卵磷脂體系的氧化[13]。然而對應的接枝酶解物隨著水解程度的加深，抗脂質氧化能力則顯著下降 （P＜0.05）。這是由于中性蛋白酶無特定的酶切位點，可能破壞了部分具有抗脂質氧化能力的活性基團結構.然而由于本實驗控制酶解程度不高（DH≤6），產生的氧化還原活性基團帶來的積極影響不及原有活性基團結構被破壞失去的抗脂質氧化能力。

圖7 復合改性對于產物起泡性的影響Fig.7 Effect of the combined modification on the foaming properties of the modified products

圖8 復合改性對于產物抗氧化能力的影響Fig.8 Effect ofthecombined modification on the antioxidative properties of the modified products

樣品體系中還原性介質的存在可以抑制或減少Fe3+/鐵氯化物向亞鐵離子形式（Fe2+）轉化，其中Fe2+可以通過測定體系中普魯士藍的生成量來監測。大豆分離蛋白經過接枝后還原力有顯著增加，然而酶解作用先降低了產物的還原力，后隨著酶解程度的加深，產物還原力持續增加。該現象與抗脂質氧化能力的趨勢吻合，由于蛋白酶解程度加深，生成氧化還原活性基團、氫離子增多，從而進一步增強產物的還原力。

乙醇溶液中DPPH自由基在517 nm處有最大吸收，溶液呈紫色。當有自由基清除劑存在時，由于與DPPH自由基單電子配對使溶液由紫色變黃色，其吸收逐漸減弱消失[13]。大豆分離蛋白接枝物經過不同程度的酶解后，DPPH自由基清除能力顯著增強，這是由于接枝物酶解后產生氫離子與DPPH結合生成穩定的DPPH-H分子從而終止氧化反應。由此，復合改性除了能增強大豆分離蛋白的界面兩親性質，同時對于增強其抗氧化能力也有積極意義。

3 結語

通過實驗得出大豆分離蛋白-麥芽糊精接枝反應最佳條件為：大豆分離蛋白與麥芽糊精質量比為2∶1，蛋白質質量濃度為4 g/dL，溫度80℃，pH為7.0，反應時間為80 min。對復合改性產物乳化能力及起泡性能的研究證實，經過接枝及適度酶解復合改性后，蛋白的乳化能力及起泡性有了較大的提高，然而深度的酶解則有可能破壞蛋白的空間結構，降低粘度從而影響功能性質的發揮。另外，復合改性對于增強大豆分離蛋白的抗氧化能力也有積極意義。

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