皂苷類似物與腎素的分子對接和結合能分析

張海玲， 光翠娥*， 江 波， 汪俊卿， 桑尚源

（1.食品科學與技術國家重點實驗室 江南大學，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122)

隨著現代社會人口老齡化進程的不斷加快，罹患高血壓的人群逐年增加，心血管疾病、糖尿病、充血性心臟衰竭、腎功能異常等并發癥同時增加。腎素-血管緊張素系統（RAS）參與體液和血壓的內分泌調控進而控制血管收縮，調節心血管功能和腎功能并維持身體電解質平衡，RAS過度激活導致血管結構和功能損傷引起高血壓疾病[1]。腎素是催化RAS的關鍵限速酶，通過抑制腎素的活性則可阻斷RAS，因此腎素一直是被人們關注的重要靶點。很多研究發現，一些皂苷類的化合物對心腦血管疾病以及腎疾病有良好的治療效果，已經確定的大豆皂苷I及其類似物大豆皂苷II、甘草皂苷、單葡萄糖醛酸甘草皂苷元與腎素具有生物活性作用。

隨著核磁共振和X射線衍射方法的發展，越來越多的蛋白質的三維結構被測出來。分子對接是分子模擬的方法之一，研究受體大分子和配體小分子結合作用，預測分子之間最佳的結合模式，并通過研究兩者對接結合的能量、作用位點、關鍵殘基等方面評價受體與配體的相互作用[2]，是預測和研究小分子配體與大分子蛋白質受體相互作用模式的重要方法[3]。因此，在基于腎素和皂苷結構的基礎上進行分子對接，進而分析對接復合物相互作用的輪廓是否存在相似性，并揭示腎素的活性與皂苷相互作用氫鍵、疏水作用和重要殘基氨基酸，探討皂苷對于腎素的抑制機理。

1 材料與方法

1.1 腎素的結構與模型的選取

從蛋白質晶體結構數據庫（http：//www.rcsb.org/pdb/）中下載初始結構為Renin-indole-piperazinj復合 物 結 構 （PDB ID：3OOT）， 小分子配體為C8H15NO6和 C28H28FN3O2，利用 Discovery Studio 2.5（DS）軟件去掉小分子配體和水分子得到腎素的三維結構并作為受體用于后續的對接過程。

1.2 大豆皂苷I及其類似物結構的獲取

在 chemicalbook網站庫 （http：//www.chemicalbook.com）中下載大豆皂苷I三維結構，然后在大豆皂苷I的三維結構基礎上利用pymol軟件[4]（http：//pymol.org）繪制出大豆皂苷 II（soyasaponin II）、甘草皂苷 （glycyrrhizin）、單葡萄糖醛酸甘草皂苷元（MGGM）的三維結構，圖1為4種皂苷的分子結構。

圖1 4種皂苷分子結構Fig.1 Molecular structure of four saponins

1.3 腎素與皂苷的分子對接

分子對接使用的是北京創騰科技有限公司的Discovery Studio（DS）軟件，腎素作為為受體并刪掉其中的水分子，4種皂苷作為對接配體，將距腎素活性中心的Asp226 20×10-9cm內的范圍定義為擬對接區域，并添加CHARMm力場，按照王紅寅等[5]人所述方法運用Discovery Studio 2.5軟件對配體和受體空間結構進行分子對接，可能構象模式采用Libdock模塊進行收集。運用DS程序包對對接復合物的空間結構分別進行兩次能量優化，即先采用最陡下降法（Steepest Descent）優化 1 000步，再采用共軛梯度法（Conjugate Gradient）優化2 000步。基于優化后的空間結構使用DS軟件統計腎素活性位點內的氨基酸殘基，并用Ligplot+軟件[6]得到分子間相互作用網，統計受體中與配體產生氫鍵作用以及疏水作用的氨基酸殘基，并對復合物的空間作用力進行分析。

1.4 對接復合物結合自由能的計算

分子力學泊松-波爾茲曼表面積（Molecular mechanics Poisson-Boltzmann surface area，MMPBSA）法是一種常用于受體與配體分子對接后計算結合自由能值（binding free energy，ΔGbind）的方法[7-9]，ΔGbind值越低說明受體與配體之間的親和力越高[10，11]。通過MM-PBSA方法可以將分子作用力進行分解，更為直觀的分析各種相互作用的貢獻。

2 結果與分析討論

2.1 腎素和抑制劑分子對接和結合自由能計算

4種皂苷和腎素進行分子對接和優化后，按照公式 （1）進行對對接復合物的結合自由能進行計算，結果如表1所示。大豆皂苷I、大豆皂苷II、甘草皂苷以及單葡萄糖醛酸甘草皂苷元與腎素的結合自由能均小于零，表明這些皂苷均能對腎素起到不同程度的抑制作用，其中大豆皂苷I、大豆皂苷II和甘草皂苷對腎素的抑制效果接近，結合自由能均在-35×4.8=-168 kJ/mol左右，而甘草皂苷的抑制效果則相對較差，結合自由能僅為-12.24 kJ/mol。結合自由能反映了受體和配體結合的穩定性[12]，將計算所得的結合自由能與4種皂苷的IC50值進行比較，發現使用MM-PBSA計算所得的結果能夠較好的契合Saori Takahashi[13]等人的實驗結果，如圖2所示，R2為0.79，表明使用該方法預測皂苷對腎素的抑制能力具有一定的可行性。

表1 對接復合物的結合自由能Table 1 Binding free energy of docking compounds

圖2 結合自由能和IC50值相關性Fig.2 Correlation between binding free energy and IC50

表1中列出了對結合自由能貢獻的各項能量值，通過圖3中各種作用力可以看出，ΔEvdW，ΔEelec和ΔGSUR均為負值，表明4種腎素抑制劑和腎素之間的范德華力，靜電相互作用和非極性溶劑化能對于腎素抑制劑和腎素的結合自由能都起到促進作用。在4種皂苷和腎素形成的復合物中，ΔEvdW和ΔEelec在ΔGbind中占有主導地位，表明范德華力和靜電相互作用對于4種皂苷和腎素之間的結合能作用貢獻比較大（＞90%）。

大豆皂苷I、大豆皂苷II、甘草皂苷和單葡萄糖醛酸甘草皂苷元與腎素形成復合物的范德華力分別為-93.97、-81.43、-72.79、-64.68 kJ/mol，大豆皂苷I和大豆皂苷II的范德華力比甘草皂苷和單葡萄糖醛酸甘草皂苷元大。雖然靜電相互作用也對4種抑制劑與腎素復合物的形成有促進作用，但是較強的極性溶劑化能抵消這部分作用力，阻礙皂苷和腎素的結合。

圖3 結合自由能各能量示意圖Fig.3 Diagram：each energy contribution value in binding free energy of eight groups complexes

2.2 皂苷和腎素形成的疏水作用分析

非極性相互作用能對結合自由能有促進作用，腎素可與4種皂苷結合形成較多的疏水相互作用。表2為通過Ligpiot軟件統計腎素和4種皂苷相互作用的疏水氨基酸殘基。

通過圖4分析可得，氨基酸殘基Ala229、Asp38、Asp226、Gly228和 Tyr83與 4種皂苷在腎素與4種皂苷的結合過程中都參與形成疏水相互作用，表明這4種氨基酸是參與腎素和皂苷抑制劑結合的重要氨基酸位點。此外，分析還發現Ala317、Gln19、Met303、Thr18、Tyr20 和 Val36 在腎素與大豆皂苷I、大豆皂苷II和甘草皂苷結合過程中形成疏水相互作用，His301同時參與腎素與大豆皂苷I、大豆皂苷II和單葡萄糖醛酸甘草皂苷元結合形成疏水相互作用，Ser41同時大豆皂苷I、甘草皂苷和單葡萄糖醛酸甘草皂苷元形成疏水作用，Gly40與大豆皂苷II、甘草皂苷和單葡萄糖醛酸甘草皂苷元形成疏水作用。

綜上所述，范德華力是腎素與4種皂苷結合形成復合物主要驅動能之一，大豆皂苷I和大豆皂苷II的范德華力與甘草皂苷和單葡萄糖醛酸甘草皂苷元相比要高，表明疏水作用可能是大豆皂苷I和大豆皂苷II對腎素抑制效果較好的重要原因。此外，分 析 還 發 現 Ala229、Asp38、Asp226、Gly228 和Tyr83是腎素與皂苷類抑制劑結合過程中形成疏水作用的重要氨基酸殘基。

表2 腎素中與抑制劑疏水作用的氨基酸殘基Table 2 Amino acid residues of renin reacted with inhibitors

圖4 腎素和抑制劑分子間相互作用分析Fig.4 Intermolecular interaction analysis between renin and inhibitors

2.3 皂苷與腎素形成的氫鍵和配位鍵分析

通過對4種復合物結合自由能的分析，可以看出極性相互作用很大程度上表現為阻礙腎素和抑制劑皂苷的結合，但是并不是形成極性作用的氨基酸殘基都不利于復合物的形成，例如Ser230、Tyr231和Ser84等氨基酸殘基在結合過程中都表現出了有利于結合自由能的極性作用，因為在結合過程中它們和皂苷能形成穩定的氫鍵作用。通過圖2中Ligplot軟件得到的分子間相互作用網，將體系中較為穩定的氫鍵作用統計在表3中。雖然一些具有極性作用的氨基酸殘基形成了氫鍵作用，但是遠小于溶劑化能作用，結果極性相互作用總體上講還是阻礙腎素和腎素抑制劑的結合。

2.4 腎素活性口袋的氫鍵和疏水作用

腎素是腎素原經激活酶轉化而生成的一種天冬氨酸蛋白酶，呈二葉體結構，每個葉體上的裂隙內都存在腎素的活性位點，腎素主要的活性位點區域可分為 S3sp，S3，S2，S1，S1’，S2’[14]，將 4 種皂苷和腎素進行分子對接后統計腎素活性口袋內參與形成氫鍵的氨基酸殘基，結果如圖5和表4所示。

通過表4中腎素活性口袋的氫鍵分析可得，皂苷和腎素形成的氫鍵作用主要是在 S3sp、S3、S1、S2、和S2’活性口袋，在腎素的S1’活性口袋內不存在氫鍵作用。腎素與大豆皂苷I和大豆皂苷II形成氫鍵的活性口袋十分相似，這是因為大豆皂苷I和大豆皂苷II的結構十分相似，都主要是在S3sp，S3，S2，S1 區域分別和 Tyr162，Ser230，Tyr231 和 Tyr85、Ser84等氨基酸殘基形成氫鍵；甘草皂苷形成氫鍵的活性口袋則主要位于S3和S2口袋；單葡萄糖醛酸甘草皂苷元形成氫鍵的活性口袋主要位于S3，S2，S1和S2’區域。通過相同活性口袋內的氨基酸類型分析可得，腎素的氨基酸殘基Ser230與4種皂苷都可以形成氫鍵作用，在S3活性口袋內；Tyr231在S2口袋內可以與大豆皂苷I、大豆皂苷II、單葡萄糖醛酸甘草皂苷元形成氫鍵作用；活性口袋S1內Ser84在可與大豆皂苷I、大豆皂苷II、單葡萄糖醛酸甘草皂苷元木鱉子皂苷 Ic形成氫鍵作用。因此，皂苷和腎素形成氫鍵作用的主要氨基酸殘基Ser230、Tyr231 和 Ser84 主要分布在 S3、S1、S2 活性口袋，這些口袋是形成氫鍵作用是主要活性區域。

表3 4種復合物中氫鍵分析Table 3 Hydrogen bond analysis of four compounds

圖5 皂苷與腎素的活性口袋的對接Fig.5 Docking between eight saponins and activity pockets of renin

表4 腎素活性口袋內的與皂苷具有氫鍵作用的氨基酸殘基Table 4 Amino acid residues inside renin activity pockets interaction with saponins by hydrogen bondings

將皂苷和腎素之間疏水相互作用的氨基酸殘基對應腎素的活性口袋進行分析發現，S3sp，S3，S2，S1，S1’和S2’6個活性口袋內都有較強的疏水相互作用 （見表5）。8組皂苷與氨基酸殘基Asp38和Arg82是在S1活性口袋形成疏水作用，Asp226和Tyr83是在S1’活性口袋形成疏水作用，與Ala229在S3活性口袋形成疏水作用；Met303和His301在S2活性口袋和皂苷形成疏水作用；Gly228、Val36和Tyr20在S3sp活性口袋形成與皂苷形成疏水作用；Gln19、Thr18和Thr18在S3活性口袋和皂苷形成疏水作用；Gly40、Gln135、Ser41 和 Ile137 在 S2’活性口袋和皂苷形成疏水作用。

綜上可以得出，腎素和皂苷在6個活性口袋內都存在較強的疏水相互作用，并明確得出了每個活性口袋內形成疏水相互作用的關鍵殘基氨基酸。

3 結語

對大豆皂苷I及其類似物大豆皂苷II、甘草皂苷和單葡萄糖醛酸甘草皂苷元與腎素進行分子對接，并對4種復合物分別采用分子動力學模擬和MM-PBSA方法計算結合自由能，計算結果和實驗值測得的抑制劑抑制能力相接近。通過對結合能能量分解表明范德華力和靜電力是形成能夠形成復合物的主要驅動力，非極性溶劑化能對于復合物形成的促進作用較小。通過活性口袋氫鍵分析可以得出，S2、S3和S1是腎素和皂苷形成氫鍵作用重要的活性口袋，Ser230、Tyr231和Ser84等氨基酸殘基是腎素和皂苷類抑制劑形成氫鍵作用的主要的氨基酸殘基。范德華力主要來自于非極性氨基酸形成的疏水作用，通過Ligpiot軟件以及分析活性口袋內的疏水作用得出，每個活性口袋是腎素和皂苷形成疏水作用的活性區域，Ala229、Asp38、Asp226、Gly228和Tyr83是腎素與皂苷類抑制劑結合過程中形成疏水作用的重要氨基酸殘基。

表5 腎素活性口袋內與皂苷具有疏水作用的氨基酸殘基Table 5 Amino acid residues inside renin activity pockets interaction with saponins by hydrophobic effect

[1]Gwathmey T M，Pendergrass K D，Reid S D，et al.Angiotensin-（1-7）-Angiotensin-Converting Enzyme 2 Attenuates Reactive Oxygen Species Formation to Angiotensin II Within the Cell Nucleus[J].Hypertension，2010，55：166-171.

[2]陳凱先，蔣華良，嵇汝運.計算機輔助藥物設計：原理，方法及應用[M].上海：上海科學技術出版社，2000.

[3]Reinikainen T L，Ruohonen L，Nevanen T，et a1.Investigation of the function of mutated cellulose-binding domains of Trichoderma reesei cellobiohydrolase I[J].Proteins：Structure，Function and genetics，1992，14（4）：475-482

[4]Schrodinger，Llc.The PyMOL Molecular Graphics System，Version 1.3r1.2010.

[5]王紅寅，林東強，姚善，等.4-巰乙基吡啶配基與IgG相互作用的分子模擬研究[J].化學學報，68（16）：1597-1602.

[6]Wallace A C，Thornton J M，Laskowski R A.LIGPLOT：a program to generate schematic diagrams of protein-ligand interactions[J].Protein Engineering，1995，8（2）：127-134.

[7]Zhang Y，Pan D B，Shen Y L，et al.Understanding the molecular mechanism of the broad and potent neutralization of HIV-1 by antibody VRC01 from the perspective of molecular dynamics simulation and binding free energy calculations[J].Journal of Molecular Modeling，2012，18：4517-4527.

[8]Wang J，Morin P，Wang W.Use of MM-PBSA in reproducing the binding free energies to HIV-1 RT of TIBO derivatives and predicting the binding mode to HIV-1 RT of Efavirenz by docking and MM-PBSA[J].American Chemical Society，2001，123：522l-5230.

[9]De Grandis V，Bizzarri A R，Cannistraro S.Docking study and free energy simulation of the complex between p53 DNA-binding domain and azurin[J].Journal of Molecular Recognition，2007，20：215-226.

[10]Takamatsu Y，Sugiyama A，Purqon A，et al.Binding free energy calculation and structural analysis for antigen-antibody complex[J].AIP Conference Proceedings，2006，832：566-569.

[11]Schrodinger，Llc.The Pymol molecular graphics system，Version 1.3r1.2010.

[12]Guang C E，Shang J G，Jiang B.Transport of traditional Chinese pimple milk-derived angiotensin-converting enzyme（ACE）inhibitor peptides across a Caco-2 cell monolayer and their molecular recognition with ACE[J].Journal of Food，Agriculture&Environment，2012，Vol.10（3&4）：40-44.

[13]Takahashi S，Hori K，Hokari M，et al.Inhibition of human renin activity by saponins[J].Biomedical Research，2010，31（2）：155-159.