利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷腺苷的工業(yè)化試驗

朱曉宏， 朱曉慧， 魏 薇

（江蘇省微生物研究所有限公司，江蘇 無錫 214063）

環(huán)磷腺苷具有調(diào)節(jié)生物體內(nèi)很多酶催化反應的功能，體內(nèi)很多激素的作用也是通過環(huán)磷腺苷區(qū)進行的，起著激素媒介物質的作用[1]。

現(xiàn)已證明環(huán)磷腺苷（cAMP）是睪丸甾酮、雌激素、腎上腺激素、甲狀腺激素及胎盤激素等許多激素的第二信使。當各種激素與細胞表面作用點接觸時，發(fā)動細胞內(nèi)三磷酸腺苷（ATP）轉化成環(huán)磷腺苷（cAMP）。細胞內(nèi)環(huán)磷腺苷的濃度變化又引起了細胞各種代謝的變化。而且環(huán)磷腺苷與細胞內(nèi)蛋白質合成、脂肪分解、類固醇合成均有關系。環(huán)磷腺苷與惡性腫瘤、內(nèi)分泌之間的關系十分密切。在特定條件下，環(huán)磷腺苷對癌細胞具有控制作用，對冠心病、牛皮癬等有緩解作用。

目前在我國，環(huán)磷腺苷主要作為醫(yī)藥品被應用。環(huán)磷腺苷在醫(yī)藥上主要作為急性心肌梗塞搶救藥并用于冠心病、糖尿病、氣喘、牛皮癬等疾病的治療。

目前國內(nèi)環(huán)磷腺苷的生產(chǎn)方法全是化學合成方法[2]。包括：

1）堿性水解法：David lipkin等人在1959年曾用堿性水解的工藝方法制得了環(huán)磷腺苷。此法主要是利用三磷酸腺苷（ATP）100℃時在氫氧化鋇強堿水溶液中水解并關環(huán)制得環(huán)磷腺苷。

2）活性酯類法：河北大學韓文炎和屠宛蓉在1986年報道了環(huán)磷腺苷的改進合成工藝方法。5-腺苷酸、4-嗎啡啉-N，N-二環(huán)己基脒和金屬鈉在乙二醇單甲醚溶劑中反應，合成了環(huán)磷腺苷。

3）DCC 脫水法[3]：M．Smith等在 1961年用 5 一腺苷酸和4一嗎啡啉一N，N一二環(huán)己基脒在吡啶溶劑中，用DCC作脫水劑進行脫水反應，使5-腺苷酸發(fā)生內(nèi)酯化反應，產(chǎn)物的收率可達80%。

4）三氯氧磷法：1989年，Genieser等報道了腺苷與三氯氧磷反應得到腺苷的合成工藝路線。中間體腺苷二氯磷酸酯不經(jīng)過分離，加堿環(huán)化得到環(huán)磷腺苷。此法原料容易得到，反應條件溫和適中，但收率偏低（49%）。

但以上方法全都屬于化學合成方法，反應所需原料都具有毒性和污染，且工業(yè)化生產(chǎn)過于昂貴。

1 材料與方法

1.1 菌種

作者所在研究室篩選育種得到的Bacillus.subtilis jsim-1277。該菌株與目前國內(nèi)鳥苷發(fā)酵菌種Bacillus.subtilis jsim-G518[4]相似，同樣源自肌苷產(chǎn)生菌Bacillus.subtilis jsim-1019。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 種子培養(yǎng)基 葡萄糖2.0 g/dL，蛋白胨1.0 g/dL，玉米漿 0.3 g/dL，NaCl 0.3 g/dL，pH 7.0。 （固體培養(yǎng)基加瓊脂2 g/dL）

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖6.0 g/dL，尿素1.0 g/dL，酵母粉1.0 g/dL，豆餅水解液0.3 g/dL，K2HPO41.0 g/dL，NaF 0.05 g/dL，MgSO40.1g/dL，pH 7.0。

1.3 搖瓶發(fā)酵試驗

1.3.1 搖瓶種子培養(yǎng) 接一環(huán)生長良好的斜面培養(yǎng)物，至裝有30 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中培養(yǎng)，旋轉式搖床，頻率 210 r／min，溫度 36℃，培養(yǎng)18 h。

1.3.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 將生長良好的種子液接至裝有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中培養(yǎng)，接種體積分數(shù)10%，旋轉式搖床，頻率210 r／min，溫度36℃，培養(yǎng)72 h后測定環(huán)磷腺苷質量濃度。

1.4 自控發(fā)酵罐試驗

自控發(fā)酵罐，容量30 L，溫度、轉速、溶氧、補料、滅菌均自控。種子用搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)時間18 h，接種體積分數(shù)10%。發(fā)酵液裝量21 L，121℃滅菌15 min，溫控 36 ℃，通氣攪拌[5]。

1.5 20 M3環(huán)磷腺苷發(fā)酵試驗

標準型不銹鋼發(fā)酵罐，二組六彎型攪拌，轉速可調(diào)，容量 20 M3，裝液 14 M3，pH、溶氧在線顯示，液氨調(diào)節(jié)pH裝置。標準型不銹鋼種子罐，六彎型攪拌轉速可調(diào)，容量 2 M3，裝液 1.4 M3，pH、溶氧在線顯示。

1.6 分析方法

高效液相色譜法。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（含0.01 mol/L四丁基溴化銨，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至4.3）-乙腈（85∶15）為流動相，檢測波長為 258 nm。標準品溶液0.2 mg/mL，取20 μL注入液相色譜儀，按外標法以峰面積計算測定。

2 結果與分析

2.1 氟化鈉（NaF）質量濃度對發(fā)酵的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同質量濃度的腺苷酸環(huán)化酶促進劑NaF，環(huán)磷腺苷的發(fā)酵水平見表1。

表1 NaF質量濃度對環(huán)磷腺苷發(fā)酵的影響Table 1 Effect of various concentration of NaF on cAMP accumulation

NaF作為一種腺苷酸環(huán)化酶促進劑，適當添加可促使產(chǎn)品積累，0.05 g/dL是合適的。

2.2 磷酸氫二鉀（K2HPO4）質量濃度對發(fā)酵的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同質量濃度的K2HPO4，環(huán)磷腺苷的發(fā)酵水平見表2。

表2 K2HPO4對環(huán)磷腺苷發(fā)酵的影響Table 2 Effect of various concentration of K2HPO4on cAMP accumulation

Bacillus.subtilis jsim-1277積累環(huán)磷腺苷不同于其原始菌株Bacillus.subtilis jsim-X-13-4。后者積累腺苷，不需要額外提供磷酸[6]；而前者需要提供磷酸鹽以生成環(huán)磷酸基團。從實驗可知，K2HPO4在1 g/dL以下時，質量濃度升高，產(chǎn)酸能力也升高；而質量濃度更高時，產(chǎn)酸能力不再提高，分析1 g/dL K2HPO4已能提供生產(chǎn)足夠的磷酸基團。過高的磷酸鹽質量濃度會增加提取的壓力，故選擇1 g/dL K2HPO4最為合適。

2.3 pH對發(fā)酵的影響

自動罐發(fā)酵過程中pH自然下降后，用液氨或氨水控制不同pH，環(huán)磷腺苷產(chǎn)量見表3。

表3 不同pH對環(huán)磷腺苷發(fā)酵的影響Table 3 Effect of various pH on cAMP accumulation

通過試驗知道，pH 6.7適合環(huán)磷腺苷的積累。

2.4 20 M3環(huán)磷腺苷發(fā)酵

種子罐2 M3，裝液1.4 M3，配料按材料與方法所述。種子液滅菌后調(diào)pH 7．0，接人3只茄子瓶斜面，溫度 36℃ ，風量 1∶0．3，培養(yǎng)過程中不控制 pH。培養(yǎng)至18 h左右，pH降至6．0左右，鏡檢無雜菌，且大部分已斷裂，即移種至發(fā)酵罐。

發(fā)酵罐20 M3，裝液14 M3，配料按材料與方法所述。滅菌后用液氨調(diào)pH 7.0。培養(yǎng)溫度36℃，種子接入發(fā)酵后，起始風量設置為1∶0.25，在12 h內(nèi)逐步增至最大，為1∶0.8。發(fā)酵過程中不斷取樣檢測產(chǎn)物積累量。發(fā)酵到后期，pH有上升趨勢，溶氧急速增加，環(huán)磷腺苷不再增長，則放罐。

表4 20 M3發(fā)酵罐中環(huán)磷腺苷發(fā)酵狀況Table 4 ccAMP fermentation in 20 M3fermentor

20 M3發(fā)酵罐5批次平均生產(chǎn)環(huán)磷腺苷6.2 g/L，平均發(fā)酵周期62 h。菌種生產(chǎn)能力穩(wěn)定。

3 結語

經(jīng)改造的枯草芽孢桿菌Bacillus.subtilis jsim-1277具有良好環(huán)磷腺苷生產(chǎn)能力，在最佳pH 6.7條件下，以葡萄糖為碳源、尿素、酵母粉、豆餅水解液為復合氮源，添以1 g/dL的K2HPO4和0.05 g/dL的NaF，能生產(chǎn)環(huán)磷腺苷6～7 g/L，發(fā)酵周期60 h略多，有較好的工業(yè)化價值。

[1]Shandar R R，Zhu J S，Baron A D.Glueosamine infusion in rat smimics the beta-cell dysfunction of non-insulin-dependent diabetes mellitus[J].Metabolism，l998，47：573．

[2]申艷紅，張文升，劉啟賓，等.環(huán)磷腺苷的合成[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2004：35（3）：132.SHEN Yanhong，ZHANG Wensheng，LIU Qibin，et al.Synthesis of adenosine cyclophospha [J].Chinese Journal of Pharmaceuticals，2004，35（3）：132.（in Chinese）

[3]Borden R K，Smith M.Nucleoside synthesis III.Preparation of nucleoside 3’，5’-cyclic phosphate in strong base[J].J Org Chem，1966，31：3247-3258.

[4]盛翠，張一平，陸茂林.原生質體紫外誘變選育鳥苷高產(chǎn)菌株[J].食品與生物技術學報，2009，28（2）：279-283.SHENG Cui，ZHANG Yiping，LU Maolin.Study on breeding up high-yield strain of guanosine by protoplast mutagensis[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2009，28（2）：279-283.（in Chinese）

[5]杜郭君，張一平，王紅連，等.鳥嘌呤核苷補料發(fā)酵條件研究[J].食品與生物技術學報，2005，24（5）：21-24.DU Guojun，ZHANG Yiping，WANG Honglian，et al.Studies on feeding condition of guanosine fermentation[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2005，24（5）：21-24.（in Chinese）

[6]柏建新，朱曉宏，張一平，等.肌苷菌核酸代謝關鍵酶缺失和形成選育腺苷茵的研究[J].微生物學通報，2003，30（2）：52-56.BAI Jianxin，ZHU Xiaohong，ZHANG Yiping，et al.Study on the microorganism fermentation of adenosine with mutative strains of lack of or producing some important enzymes in nucleic acid metabolism[J].Microbiology，2003，30（2）：52-56.（in Chinese）