“靈巴菌質”抗腫瘤活性部位的體外篩選

尚文斌， 孫 鈺， 潘稚云， 潘 揚

（南京中醫藥大學，江蘇 南京 210029）

因巴豆毒性較大，內服須炮制后（巴豆霜）入藥［17］。在前期工作中，我們采用靈芝菌Ganoderma lucidum（Curtis：Fr.） P.Karst.對巴豆進行獨特的發酵法炮制，得到其固體發酵產物——“靈巴菌質”。研究表明，“靈巴菌質”的毒性成分脂肪油和總蛋白的含量已明顯降低，這二種物質含量均低于生巴豆及傳統炮制品（巴豆霜）［18］；進一步實驗還發現，“靈巴菌質”的毒性也有了明顯的下降，且低于巴豆霜［19］。

通過體外培養和MTT比色法，考察“靈巴菌質”的提取物石油醚部位（PEE）、堿性醇提物（AME）和巴 豆 苷 （Cro） 對 SMMC-7721、MGC-803、A549、HepG-2腫瘤細胞增殖的影響，初步篩選這3種物質的抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DMSO：PCR級；低熔點瓊脂糖：生工生物工程股份有限公司；噻唑藍/MTT：上海捷瑞生物工程有限公司；胰酶：美國Sigma公司；DMEM培養基：美國Life Technologies；其余試劑包括DMSO、甲醇、石油醚、乙腈等均為分析純或色譜純級，水為重蒸餾水。

HF 90二氧化碳培養箱，HF Safe 1200生物安全柜：上海力康生物醫療科技控股有限公司；Leica DM IL LED/DFC450倒置顯微鏡：德國徠卡儀器有限公司；Hitachi Corona MTP-601F全自動熒光酶標儀：日本日立公司；Sartorius BS 124S電子天平：0.1 mg，德國賽多利斯公司；手動移液器：德國Eppendorf公司。

1.2 化學對照品、瘤株與藥品

巴豆苷：由本校凌云博士惠贈（成都普思生物科技有限公司，HPLC面積歸一化法測定，其純度≥98.5%）；生巴豆：購自亳州輝睿中藥科技有限公司，經潘揚教授鑒定為中藥巴豆為大戟科植物巴豆Croton tiglium L.的干燥成熟果實；靈巴菌質（LBJZ）：由作者所在實驗室提供，制備方法參見文獻［8］；人肝癌SMMC-7721細胞和 HepG-2細胞、人胃癌MGC-803、人肺癌A549細胞：均由南京大學模式動物研究所惠贈。

1.3 實驗方法

1.3.1 “靈巴菌質”石油醚提取部位、堿性醇提物的制備 取靈巴菌質940 g，粉碎，過40目篩，以石油醚、二氯甲烷、水飽和正丁醇和甲醇四個極性梯度依次進行索氏抽提12 h，提取液用旋轉蒸發儀將溶劑揮盡后，60℃減壓干燥成干浸膏，分別得石油醚、二氯甲烷、正丁醇和甲醇提取物各 150、17、7、50 g；其中石油醚即為石油醚部位 （petroleum ether extracts，PEE）。甲醇提取物用10%鹽酸1 000 mL超聲輔以攪拌1 h使溶解，過濾，濾液以10%氫氧化鈉溶液調pH 9～10，再以4 000 mL正丁醇分3～5次進行萃取，合并萃取液，用旋轉蒸發儀減壓將溶劑揮盡后，60℃減壓干燥成干浸膏，即得堿性醇提物（AME）約14 g。 PEE、AME均用DMSO 溶解成儲備液備用，臨用時以培養液稀釋成所需濃度。

1.3.2 瘤株細胞的培養 將SMMC-7721、HepG-2、A549、MGC-803細胞接種于細胞培養瓶中，DMEM培養基含胎牛血清1 00 ml/L，青霉素100 kU/L和鏈霉素100 mg/L，置于37℃、5%CO2培養箱，相對飽和濕度的條件下培養。細胞長滿后，棄去培養液，用PBS輕輕洗滌2次，加入0.25%胰酶-0.02%EDTA，37℃消化3～5 min，每兩天按1∶3比例傳代1次，均取對數生長期的細胞用于實驗。

1.3.3 MTT比色法測定 消化收集對數增殖期細胞并調整成濃度5×107/L的細胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μL，鏡下觀察確認細胞貼壁良好時，加入含不同質量濃度PEE、AME的培養液，使終質量濃度依次為 25、50、100、200 mg/L；對照品 Cro 終質量濃度依次為 100、200、350、500 μmol/L，以不含藥物的培養基培養細胞（含相同濃度的溶劑）作為空白對照，以培養基作為空白孔調零組，每組設4個復孔。細胞和藥物在37℃飽和濕度，體積分數5%CO2培養箱中分別孵育24 h和48 h后，每孔加入 20 μL MTT （5 g/L），37 ℃繼續孵育 4 h， 終止培養，小心吸棄孔內上清培養液，每孔加入200 μL DMSO，振蕩混勻10 min，使結晶物充分溶解。選擇490 nm波長，在酶標儀上測定各孔光密度（optical density，OD）值。實驗重復3次，按照下列公式計算細胞增殖抑制率（IR，%）：

2 結果與討論

2.1 PEE對4種腫瘤細胞的增殖的影響

1）對SMMC-7721細胞的增殖的影響很小，可以忽略不計；

另一方面，智能家居產品也提供了一種新型的早教形式。近兩年，智能家居產品在科技的推動下逐漸滲透至年輕家庭生活的方方面面，其中母嬰親子類智能家居產品不僅能提供母嬰知識，還能幫助寶寶學習知識，進行簡單早教，因此廣受歡迎。各類產品中最受追捧的智能家居產品是智能電視，家庭擁有比例為51%，遠高于智能體重秤、智能可穿戴設備等其他智能產品。

2）對HepG-2細胞的增殖有明顯的促進作用，質量濃度在100 mg/L時對HepG-2細胞在48 h的增殖促進率高達53.6%，與正常對照組比較均有極顯著差異（P＜0.001）；

3）對MGC-803細胞的增殖有抑制作用，最高質量濃度抑制率僅為22.1%，沒有實質性意義。

4）與正常組對照比較，隨著的作用質量濃度增加和作用時間的延長，其對A549細胞生長的抑制率也明顯增加，在一定質量濃度范圍內呈劑量依賴性，100 mg/L藥物作用A549細胞48 h后，抑制率達76.3%；200 mg/L作用A549細胞48 h后，抑制率分別高達81.4%。各濃度組在不同時間點比較差異均有極顯著差異（P＜0.001），結果見圖1。

2.2 AME對4種腫瘤細胞增殖的影響

1）對SMMC-7721細胞的增殖有一定的抑制作用，質量濃度在100 mg/L和200 mg/L是抑制率分別為31.7%和38.9%，與正常對照組比較有顯著性差異（P＜0.05）；

圖1 PEE作用48 h后對腫瘤細胞增殖的影響Fig.1 Effects on tumor cell proliferation after treatment with PEE for 48 h

2）質量濃度在100 mg/L時，作用48 h后對HepG-2細胞增殖的促進率高達62.3%，與正常對照組比較均有極顯著差異（P＜0.001）；

3）對MGC-803細胞增殖作用有一定的抑制作用，但作用不明顯，與正常對照比較沒有顯著性差異。

4）隨著作用質量濃度增加和作用時間的延長，其對A549細胞生長的抑制率也明顯增加，在一定質量濃度范圍內呈劑量依賴性和時間依賴性；與空白組相比較，在50、100、200 mg/L作用48 h后的抑制率均有極顯著差異（P＜0.001），最大質量濃度200 mg/L組在48 h的抑制率分別達67.78%，結果見圖2。

圖2 AME作用48 h后對腫瘤細胞增殖作用影響Fig.2 Effects on tumor cell proliferation after treatment with AME for 48 h

2.3 Cro對A549細胞增殖的影響

與空白對照組相比，隨著的作用質量濃度增加和作用時間的延長，Cro對A549細胞生長的抑制率也明顯增加，在一定質量濃度范圍內呈劑量依賴性和時間依賴性，藥物作用A549細胞48 h后的抑制率均明顯高于相應濃度藥物作用于A549細胞24 h后的抑制率，350 μmol/L藥物作用A549細胞24 h和48 h后，抑制率分別為42.75% 和62.73%，500 μmol/L作用A549細胞24 h和48 h后，抑制率分別高達56.85%和72.0%，以上兩組與空白對照組相比均有極顯著性差異（P＜0.001），結果見圖3。

圖3 Cro作用48 h后對A549腫瘤細胞增殖作用影響Fig.3 Effects on A549 tumor cell proliferation after treatment with Cro for 48 h

3 結語

將 “靈巴菌質”分為石油醚、二氯甲烷、正丁醇和堿性甲醇提取物四個部位，由于石油醚（PEE）和堿性甲醇提取物（AME）得量相對較大，因此，首先對這兩個提取部位進行了抗腫瘤活性的篩選，今后將對另外兩個提取部位的藥理作用繼續進行探索。實驗結果顯示，PEE和AME對SMMC-7721、MGC-803、A549、HepG-2等4種不同的腫瘤細胞增殖產生不同的效應，有抑制增殖作用；但也有促進增殖作用；與巴豆的有效成分巴豆苷一樣，PEE和AME對肺癌A549細胞生長均呈現出明顯的抑制作用。

“靈巴菌質”的不同提取物對腫瘤細胞的抑制作用以及不同的效應可能與其活性組分有關。前期研究發現，PEE部分主要為低極性的巴豆脂肪油，甲酯化后經GC-MS法分析結果表明，“靈巴菌質”與生巴豆及其炮制品相比，無論在脂肪油成分種類還是相對含量上均存在一定差異［18］。AME部分則為極性較大的成分，除主要含有巴豆苷外，也含有巴豆三氮唑苷（crotonotriazole nucleotide），在炮制品巴豆霜中也發現存在此成分，而生巴豆中則沒有［20］，說明巴豆發酵與炮制物質基礎類同。巴豆三氮唑苷是前期對“靈巴菌質”化學成分進行分離時，在正丁醇提取部位得到一個新化合物，通過UV、IR、1H NMR、13C NMR、2D NMR和MS確定其化學結構式，化學名為：1-b-D-呋喃核糖-6-氨基-1，2，3-三氮唑并 [5，4-d]吡啶 （1-b-D-ribofuranose-6-amino-1，2，3-triazolo[5，4-d]pyridine）。 對巴豆三氮唑苷的藥理活性進行初步研究，發現其有一定的抗病毒活性，但并沒有抑瘤效果，提示AME的抗腫瘤效應與巴豆三氮唑苷無關，而與巴豆苷相關。

此外，腫瘤細胞具有相同的病理機制和表型，又具有不同的病理特點和組織特異性，決定其對抗腫瘤藥物的敏感性的差異［21］。本研究中PEE和AME抗腫瘤作用的選擇性，說明兩者具有不同的腫瘤抑制效應。今后需從活性組分分析和腫瘤細胞的不同分子靶點的角度進一步開展研究。

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