重組人ADAM15去整合素區域蛋白抑制HeLa細胞的增殖及遷移

侯 穎， 儲 敏， 蔡燕飛， 杜芳芳， 王曉敏， 陳 蘊， 金 堅

（江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122）

整合素金屬蛋白酶家族蛋白 （a disintegrin and metalloproteinase，ADAM）， 也 被 稱 為 MDC（Metalloproteinase/Disintegrin/Cysteine-rich），是一類錨定于細胞膜表面的跨膜蛋白家族[1]，自1990年發現第一個家族成員以來[2]，迄今為止共有23種ADAM家族蛋白在人類基因中被發現。ADAM家族蛋白參與蛋白水解、生長因子和細胞因子的釋放、細胞外基質降解、細胞的融合、遷移、粘附及信號轉導等生物功能[3]。在病理學中，ADAM家族蛋白亦參與了炎癥和腫瘤的發生和發展。ADAM家族蛋白中，ADAM15被發現與多種腫瘤的發生和發展密切相關，在多種實體瘤發生時，如胃癌、肝癌、前列腺癌等，ADAM15的表達都會上調[4-5]。另外，由于ADAM15的去整合素區域含有整合素結合位點RGD（arginine-glycine-asparti，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）序列，具有典型的藥物分子靶點結構特征，因此有希望作為臨床腫瘤診斷的標志物及藥物設計的靶點。

人ADAM15去整合素區域蛋白由91個氨基酸殘基構成，相對分子質量為9 805，作者所在實驗室成功利用大腸桿菌表達系統表達并分離純化出重組人ADAM15去整合素區域蛋白，記為rhddADAM15（recombinant human disintegrin domain of ADAM15）[6]。作者以人宮頸癌細胞HeLa為模型，檢測了rhddADAM15對HeLa增殖及遷移的影響，并初步確定了rhddADAM15作用機理及其相關的信號通路，為進一步研究其對腫瘤的作用機制提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

rhddADAM15：由作者所在實驗室制備；人宮頸癌細胞HeLa：購自上海中科院細胞庫；培養細胞所用RPMI-1640基礎培養基、小牛血清、青霉素、鏈霉素：購自Gibco公司；胰蛋白酶：購自碧云天公司；脂質體Lipo2000：購于Invitrogen公司；細胞實驗用各種孔板：購自Corning公司；SRB：購自Sigma公司；表皮生長因子（EGF）及 U0125：購自 Cell signaling公司；CM-Dil：購自 Invitrogen公司；兔源抗rhddADAM15的一抗：由作者所在實驗室制作保存；辣根過氧化酶標記的羊抗兔二抗：購自碧云天公司；細胞周期試劑盒：購自南京凱基生物。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 細胞采用含10%小牛血清的1640培養基，添加1×105U/L的青霉素和100 mg/L鏈霉素，置于37℃5%CO2培養箱培養。當細胞生長至所需要密度時用胰蛋白酶消化處理，收集細胞，計數并根據需要重懸成所需濃度。

1.2.2 SRB法測細胞增殖 將細胞消化后計數，用含10%小牛血清的培養基稀釋至 （0.6～0.8）×108個/L，每孔100 μL鋪于96孔板，培養24 h后，吸除培養基，將含有不同濃度的rhddADAM15、絲裂原活化蛋白激酶 （mitogen-activated protein kinases，MAPKs）通路的激動劑表皮生長因子（EGF）及MAPK通路中細胞外調節蛋白激酶 （extracellular regulated protein kinases，ERK）抑制劑U0125的細胞培養液分別加入至96孔板。各個藥物的各個濃度設置至少3個副孔，同時設置不加任何藥物的孔為陰性對照及不鋪細胞只加培養液的孔為空白對照孔。繼續培養24 h后，棄去各孔培養基，加入100 μL的10%TCA溶液固定40 min后，棄去TCA溶液，超純水洗板2次，在空氣中干燥后每孔加入100 μL的0.4%SRB溶液，于37℃孵育30 min，棄去SRB溶液，用1%醋酸溶液清洗至無色后甩干，每孔加入100 μL 的 10 mmol/L Tris溶液，10 min 后利用酶標儀在570 nm處檢測其吸光值。

1.2.3 劃痕法測細胞遷移 將細胞消化后計數，用10%牛血清的培養基稀釋至 （0.6～0.8）×108個/L，每孔100 μL，均勻鋪于96孔板。待細胞生長至鋪滿孔底80%～90%時，用槍頭在孔底均勻筆直的劃出約1 mm細痕，PBS輕輕洗2～3次，洗去劃掉的細胞，加入含有不同濃度的rhddADAM15的細胞培養液，在0、24 h時分別定點拍照，觀察并記錄細胞遷移情況。 遷移計算公式為式（2）、（3）：

1.2.4 PI單染法測細胞周期 處于對數期的待檢測細胞消化后鋪于 6 孔板，每孔（3～4）×105個，生長24 h 后 加 入 終 濃 度 分 別 為 0、1.5、4 μmol/L 的rhddADAM15繼續培養24 h，棄去上清液，PBS洗滌、胰蛋白酶消化后收集細胞，再用PBS洗滌兩遍后，70%的冷乙醇固定2 h至過夜，洗去固定液，經PBS清洗后收集細胞，加入50 μg/mL的RNAase，于37℃孵育30 min后，加入PI置于4℃避光染色，0.5 h后上機檢測。數據利用Modfit軟件進行分析。

1.2.5 人ADAM15去整合素區域在HeLa細胞內的表達質粒構建 以作者所在實驗室保存的質粒pGEX-4T-1/ddADAM15作為模板，利用以下引物克隆人 ADAM15去整合素區域：上游引物，5’-CCGCTCGAGCGGGCCACCATGGCTGCTTTCTGC-3’， 下游引物 5’-TAAAGCGGCCGCAAATTTACTC GCCATCCCCT-3’。將PCR產物純化后，利用XhoI及NotI酶切，連于pCI-neo載體。構建好的pCI-neo/ddADAM15質粒經測序驗證正確后，利用Lipo2000轉入HeLa細胞內，轉染后的細胞株記做HeLa/AD。轉染4、6 h后，收集細胞并裂解收取蛋白質，利用抗rhddADAM15的一抗進行Western blot實驗，分析細胞內人ADAM15去整合素區域蛋白質的表達水平。

1.2.6 斑馬魚體內的腫瘤細胞移植模型 本實驗與杭州環特生物技術有限公司合作開展，所用斑馬魚為野生型斑馬魚，由環特生物技術有限公司培養提供。本實驗用魚為斑馬魚幼魚。斑馬魚的繁殖以自然成對交配的方式進行。陽性對照為巴馬司他，陰性對照為PBS溶液。

1）腫瘤細胞移植：HeLa生長至聚合度為90%以上后，棄去培養液，用 PBS洗滌2～3遍，加入 1 mL質量濃度為5 μg/mL熒光素CM-Dil溶液，將培養瓶置于4℃冰箱。15 min后棄去CM-Dil溶液，用PBS洗滌2～3遍，消化收集標記好的細胞，置于冰上待用。將受精48 h的斑馬魚置于0.4%三卡因甲磺酸進行麻醉后，利用顯微注射儀將約800個標記好的HeLa細胞注入斑馬魚卵黃囊，以此作為腫瘤細胞在斑馬魚體內的移植模型。

2）rhddADAM15給藥：HeLa細胞移植到斑馬魚體內24 h后，在熒光顯微鏡下挑選腫瘤細胞生長良好，即熒光強度較亮的斑馬魚，將不同量的rhddADAM15，PBS（陰性對照）及巴馬司他（陽性對照，450 ng/魚）顯微注射到斑馬魚體內，每組至少10條。繼續飼養48 h后，將斑馬魚麻醉固定后拍照，利用尼康NIS-Elements D 3.10高級圖像處理軟件進行圖像分析。熒光強度（S）表示細胞的增殖程度，面積（A）表示細胞的遷移程度。rhddADAM15對斑馬魚體內腫瘤細胞的增殖抑制率及遷移抑制率計算公式為式（4）～（5）。

2 結果與討論

2.1 rhddADAM15抑制HeLa細胞增殖及遷移

SRB檢測法顯示rhddADAM15對HeLa細胞增殖有明顯抑制，抑制率隨著rhddADAM15濃度的升高而增大，在0～8 μmol/L內呈劑量依賴性，見圖1。數據分析得，rhddADAM15抑制HeLa細胞增殖的IC50為2.44 μmol/L。利用劃痕法顯示rhddADAM15對HeLa細胞的遷移能力也有明顯抑制，且呈劑量依賴性，計算得rhddADAM15抑制HeLa細胞遷移的 IC50為 1.60 μmol/L。

圖1 rhddADAM15抑制HeLa細胞增殖及遷移Fig.1 rhddADAM15 inhibited the proliferation and migration of HeLa cells

2.2 ADAM15去整合素區域蛋白過表達抑制HeLa細胞的遷移及細胞周期

轉染4、6 h后，利用Western blot分析HeLa/AD細胞內ADAM15去整合素區域蛋白質的表達水平，結果見圖2。轉染4 h后，ADAM15去整合素區域蛋白已有表達，6 h后表達水平較高。因此我們選擇轉染后6 h作為檢測時間點，檢測HeLa細胞周期及遷移能力的變化。

如表1所示，與正常HeLa細胞相比，HeLa/AD的遷移抑制率為 18.27%±2.15%， 而 4 μmol/L rhddADAM15作用于HeLa細胞后，HeLa細胞的遷移抑制率為96.37%±2.35%，抑制率遠遠大于HeLa/AD；rhddADAM15處理后，HeLa細胞的S期含量上升約4%，G2/M期含量下降約3.1%，G0/G1期下降約1%；與rhddADAM15處理后的HeLa細胞相似，和野生型HeLa細胞相比，HeLa/AD細胞也具有S期的部分阻滯，阻滯率約為5%，G2/M期含量下降約3%。轉染空質粒的對照組S期含量下降，G2/M期略微升高，證明轉染試劑對細胞周期也有一定影響。

圖2 ADAM15去整合素區域蛋白在HeLa細胞內的表達Fig.2 Expression of the disintegrin domain of ADAM15 in HeLa cells

表1 HeLa/AD及HeLa細胞經過rhddADAM15處理后的細胞周期及遷移能力變化Table 1 Cell cycle arrest and migration inhibition of Hela/AD or HeLa cells treated with rhddADAM15

2.3 相關通路抑制劑及激動劑對HeLa細胞的增殖影響

rhddADAM15抑制HeLa細胞的增殖，阻滯其細胞周期，為了研究rhddADAM15抑制HeLa細胞增殖作用相關的通路，考察了MAPK通路激動劑EGF及ERK1/2通路抑制劑U0125對rhddADAM15處理后HeLa細胞增殖的影響。實驗中所用rhddADAM15的濃度為1.0 μmol/L，EGF濃度為0.8 nmol/L，U0125濃度為 10 nmol/L， 結果見圖 3。rhddADAM15可抑制HeLa細胞的增殖（柱1），EGF可促進HeLa細胞的增殖并可逆轉rhddADAM15引起的細胞增殖抑制 （柱2，3），在EGF的作用下，rhddADAM15對HeLa細胞增殖并沒有抑制效果，只是減弱EGF對HeLa細胞增殖的促進作用 （柱3）；U0125同樣也能抑制HeLa細胞的增殖 （柱4），rhddADAM15與U0125聯用會使HeLa的增殖抑制增強 （柱 5）；EGF可以逆轉 U0125及 U0125與rhddADAM15聯用引起的增殖抑制作用 （柱6、7），即 EGF存在下，U0125及 U0125與 rhddADAM15聯用并不能引起HeLa細胞的增殖抑制，HeLa細胞仍會有一定程度的增殖促進。

圖3 rhddADAM15，EGF，及U0125對HeLa細胞增殖的影響Fig.3 Effect of rhddADAM15，EGF，and U0125 on the proliferation of HeLa cells

2.4 rhddADAM15對斑馬魚體內HeLa細胞生長及轉移的影響

圖4 rhddADAM15抑制斑馬魚體內HeLa細胞的生長及轉移Fig.4 Inhibitory effect of rhddADAM15 on the proliferation and metastasis of HeLa cells in zebrafish xenografts

HeLa細胞移植于斑馬魚體內后，可以正常生長，如圖4A所示，移植3 d以后，HeLa細胞在斑馬魚體內增殖并轉移，表現為紅色熒光范圍變廣。經過陽性對照巴馬司他及rhddADAM15處理后，斑馬魚體內HeLa細胞的熒光面積減小，亮度變暗 （圖4B）。統計結果顯示，rhddADAM15作用后斑馬魚體內HeLa細胞的熒光強度及熒光面積減弱呈劑量依賴性，在rhddADAM15最大非致死劑量，即7.5 pmol/魚的劑量下，rhddADAM15對HeLa細胞在斑馬魚體內增殖的抑制率為53%±1.49%，轉移抑制率為51%±2.83%；在巴馬司他最大非致死劑量，即490 pmol/魚的劑量下，巴馬司他對HeLa細胞在斑馬魚體內生長的抑制率為39%±2.51%，轉移抑制率為43%±2.90%。

3 結語

整合素作為存在于細胞表面的重要黏附分子，可介導細胞與細胞及細胞與基質的黏附，對細胞基因表達與調控、細胞增殖、分化與凋亡，在腫瘤的發生發展過程中起著非常重要的作用[7-8]。去整合素可以通過競爭性抑制阻斷整合素與細胞外基質的相互作用，干擾由整合素介導的信號轉導通路[9]。

已有的研究發現，rhddADAM15對多種腫瘤細胞的增殖均有較強的抑制作用，有較為廣譜的抗癌性[4，10]。 在本研究中，rhddADAM15可以顯著抑制人宮頸癌Hela細胞在體外及斑馬魚體內的增殖及轉移，抑制效果呈劑量依賴性；rhddADAM15處理后，HeLa細胞S期阻滯率約4%；而通過瞬時轉染使ADAM15去整合素區域蛋白在HeLa細胞內過表達，得到HeLa/AD細胞，其遷移能力較野生型HeLa細胞有微弱的下降，S期阻滯率約為5%。以上實驗證明，rhddADAM15作為外源蛋白及細胞內表達的內源蛋白，均可抑制細胞的遷移及誘導S期阻滯，雖然抑制及誘導強度不同，仍可說明rhddADAM15在細胞內及細胞表面均有其作用靶點。

rhddADAM15發揮功能的一個重要活性位點為其可與整合素相互作用的RGD序列[4]。細胞的生存與增殖，都需要與細胞外基質的相互作用，整合素是細胞表面受體的主要家族，對細胞和細胞外基質的粘附起介導作用。整合素參與了一系列的信號通路，調節細胞質蛋白激酶，生長因子受體和離子通道的活性，調控細胞內的肌動蛋白細胞骨架的組織。整合素還可以調節細胞周期，控制細胞存活、增殖、退出細胞周期或者細胞分化[8]。Chong等發現，ADAM15激活Src/Erk途徑，來調整內皮細胞的通透性及中性粒細胞的遷移[11]。MAPK信號通路在調節細胞增殖、分化、凋亡以及遷移方面發揮重要作用，并與炎癥、腫瘤等多種疾病的發生密切相關[12]。本研究表明，EGF可以逆轉rhddADAM15及rhddADAM15與ERK抑制劑U0125引起的HeLa細胞增殖抑制，表明rhddADAM15對HeLa細胞增殖的抑制與MAPK通路密切相關。雖然對于rhddADAM15的具體作用靶點及機制仍不清楚，但是本研究為進一步探究rhddADAM15參與的激酶級聯激活過程提供了研究方向，為rhddADAM15的成藥性提供了研究基礎。

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